là cao nhất .Với các protid còn lại thì mức độ thấp hơn, giảm dần từ: protid cá —> protid bò —> protid gà —> protid lợn. Trong đó chế phẩm pancreatin đơn và chế phẩm phối hợp giữa pancreatin và papain có mức độ thuỷ phãn các loại protiđ cno hơn so với 2 chô pliíĩm cồn lạị Đicii này càng chửng íỏ sự ảnh hưởng của pepsin đối với pancreatin. Nó có thể làm giảm hoạt tính pancreatin trong chế phẩm phối hợp.
Iĩảng9: Mức độ thuỷ phân một sếloạỉ proteỉn của Pepsỉn trong các c h ế
phẩm
% Protein bị thuỷ phân
Cơ chất Pepsin Papain
+Pepsin Pepsin +Pancreatin Papain +Pepsin +Pancreatin Casein 27.37 25.13 22.2 21.17 Prolid lợn 36.18 36.47 33.53 35.74 Piotid g à . 42.64 43.15 40.02 44.55 Protid bò 52.68 53.78 43.08 45.76 Protid cá 89.15 75 65.57 66.51
Glii chú: Kốl qua Irôn là giá (rị (rung bình của 3 lẩn llií nghiộm Irong cùng diồu kiộn tiến hành.
Kết quả biểu diễn như sau :
<03 sz CL 100 80 jd' c '<D>4—' o 1— Q_ 60 40 20 0 3 □ Pepsin 0Papain +pepsin □ Pepsin +Pancreatin 0Papain +Pepsin +Pancroalỉn > - ►
Chú thích :ị Casein 2. Protid lợn. 3. Prolid gà . 4. Protid bò 5. Protid cá
Kết quả hình 4 cho thấy mức độ thuỷ phân của pepsin trong các chế phẩm với protid cá là cao nhất, mức độ thu ỷ phAn protid bò, gà, lợn, đặc biệỉ là casein thì thấp hơn. Điều này được giải thích rằng ờ giai đoạn đầu pepsin có lác dụng làm đông tụ sữa hay casein.
3.2.5. Theo dõi tính ổn định hoạt tính protease trong các chế phẩm theo thòi gian.
Hoạt độ protease phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như đã trình bày ở trên: pH, cơ chất, nhiệt độ. Ngoài ra còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản, thời gian bảo quản, ở đây chúng tôi chỉ xét đến độ ổn định hoạt độ protease theo thời gian bảo quản. Để khảo sát yếu tố này, chúng tôi tiến hành theo dõi hoạt độ các protease trong các chế phẩm với thời gian 2 tháng, 15 ngày xác định hoạt độ các protease I lẩn như phương pháp đã nêụ Các chế phẩm đều được bảo quản trong lọ thuỷ tinh nút kín, bọc 1 lần túi nilon và để trong hộp cát tông ở nhiệt độ phòng.
Kết quả thu được trình bày ở bảng 10, 11, 12.
Hình 4 : Mức độ thuỷ phân một số loại protid của Pepsỉn trong các ch ế
BảnglO: Hoạt độ Papain trong các ch ế phẩm theo thời gian
Hoạt tính protease (nKat/mg protein) Thời gian (Ngay) Papain Papain +Pepsin Papain +Pancreatin Papain +Pepsin +Pancreatin 0 36,22 39,36 49,22 43,65 15 35,5 36,9 49,15 42,99 30 35,3 34,7 48,8 40,59 45 35,28 34,32 47,29 40,15 60 34,97 33,94 46,58 39,84
Ghi chú: Kết quả trôn là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm trong cùng điều kiện tiến hành
Kết quả bảng 10 cho thấy, theo thời gian bảo quản hoạt độ của papain trong các chế phẩm có giảm nhưng không đáng kể . Giảm nhiều nhất là chế phẩm phối hợp 3 thành phần, tới 8% so với hoạt tính ban đầu .
lỉả n g ll: Hoạt độ Pancreatin trong các ch ế phẩm theo thôi gian
Hoạt tính protease (nKat/mg protein) Thời gian (Ngày) Pancreatin Pancreatin -l-Pcpsill Papain +Pancreatm Papain +Pepsin +Pancrcặin 0 40,02 32,41 36,5 30,88 15 39,98 30,93 35,36 26,86 30 39,97 27,08 34,18 24,22 45 39,74 24,88 33,32 24,12 60 39,25 22,57 32,14 23,86
Ghi chú: Kết quả trôn là giá Irị trung hình của 3 lần thí nghiệm trong cùng điều kiện liến hành.
Kết quả trên cho thấy hoạt độ pancreatin trong chế phẩm đơn và trong chế phẩm phối hợp với papain giảm không đáng kể . Nhưng hoạt tính pancreat.in trong chế phẩm phối hợp với pepsin và phối hợp 3 thành phần thì giảm đáng kể tù' 22%-30%. Như vậy pepsin có ảnh hưởng tới hoạt độ của pancreatin theo thời gian.
Iĩảngl2: Hoạt độ Pepsỉn trong các ch ế phẩm theo thời gian
% Protein bị thu ỷ phân Thời gian (Ngày) Pepsin Papain +Pepsin Pepsin +Pancreatin Papain +Pepsin +Pancreatin 0 57,76 55,2 53,83 56,19 15 56,2 5 1 , 5 49,36 45,92 30 54,82 46,25 4 3 ,9 43,54 4 5 5 3 3 9 ,7 3 7 ,9 8 40,94 6 0 52,28 36,42 32,49 38,52
Ghi chú: Kếl quả trôn là giá trị trung bình của 3 lẩn thí nghiệm trong cùng diồu kiộn tiến hành
Kết quả bảng 12 cho thấy hoạt độ pepsin trong chế phẩm đơn giảm ít nhất khoảng 9%, còn lại hoạt độ pepsin trong chế phẩm phối hợp đều giảm đáng kể từ 30%-39%. Điều đó chứng tỏ ở điều kiện bảo quản bình thường hoạt độ pepsin bị giảm rất nhanh .
3.3. BÀN LUẬN
3.3.1. Độ ổn định hoạt tính của các Protease trong các chế phẩm.
Chế phẩm có chứa pepsin, papain và pancreatin là hỗn hợp của 3 loại protease có nguồn gốc và điều kiện hoạt động khác nhaụ Pepsin hoạt động ở
môi trường pH acid, papain hoạt động ở môi trường pH trung tính và pancreatin hoạt động ỏ' môi trường pH kiềm nhẹ. Hơn nữa pepsin và pancreatin có nguồn gốc lù' dạ dày và tụy của động vật có vú còn pnpnin có nguồn gốc (ừ nhựa mủ quả đu đủ xanh thuộc loại protease thực vật. Ở đây chúng đã được thử nghiệm với nhau trong một chế phẩm và cũng được ủ trong những môi trường pH khác lừ vùng acid đến kiềm nhẹ trong khoảng thời gian nhất định. Các số liệu cho thấy sau 30 phút, ở pH 2 ngoài pepsin la cũng thấy papain và pancreatin còn tồn (ại hoạt tính protease cuả chúng tuy hoạt tính có bị giảm. Dựa vào kết quả ở bảng 1, 2, 3 có thể cho rằng độ giảm hoạt tính papain là do môi trường acid còn độ giảm hoạt tính pancreatin là do sự
tấn công của pepsin. Nhìn chung ở pH từ 4 đến 7,5 hoạt tính các protease trong các chế phẩm đạt ìnức độ cao và ổn định hổn như ít thay đổi trong khoảng thời gian ủ. Đặc biệt ở pH 8,5 pancreatin và papain sau thời gian ủ có hoạt độ tương đương với vùng pH 7,5. Pepsin tuy bị vô hoạt ở vùng pH này nhưng sau khi đua Irở về pl l (ối ưu là 2 (hì vẫn có một phẩn hoạt tính được phục hổị Điều này có thể clo pepsin kết hợp với chất Inhibitor (chất ức chế) ở
pH 8,5 nhưng được hoạt hoá trở lại ở pH 2.
Còn đối với các chế phẩm 2 thành phần thì mức độ bị ảnh hưởng gần giống như các chế phẩm đon. Riêng chế phẩm phối hợp pepsin - pancreatin thì hoạt tính của pancreatin luôn bị giảm so với chế phẩm đơn. Điều này có thể do sự ảnh hưởng của pepsin đến hoạt tính pancreatin.
Mỗi protease đều có một nhiệt độ thích hợp cho sự thuỷ phân protein. Thử nghiệm tính bền nhiệt cuả các protesaeJ:rong các chế phẩm ở các nhiệt độ khác nhau kết quả cho thấy các chế phẩm hỗn hợp có sự thích nghi với khoảng nhiệt độ rộng hơn các chế phẩm bột nguyên liệu thành phần.
Theo thời gian bảo quản nghiên cứu thấy hoạt tính các protease trong các chế phẩm đặc biệt là trong những chế phẩm hỗn hợp có giảm. Tuy nhiên đây chỉ là các kết quả bước đầu đánh giá độ ổn định hoạt tính của các protese theo thơi gian ở điều kiện bảo quản bình thường ở nhiệt độ phòng, còn lất nhiều các yếu tố cần được nghiên cứu tiếp như độ ẩm, ánh sáng...
3.3.2. Khả năng íiêu protein của các Protease trong các chế phẩm.
Các chế phẩm đơn và chế phẩm hỗn họp của các protesê có khả năng phân giải nhiều loại protid là thực phẩm hàng ngày của người Việt Nanị Mức độ thuỷ phân giảm dần theo thứ tự các cơ chất: casein —» protid cá —> protid bò —> protid gà -> protid lợn. Điều này cho thấy sữa vãn là nguồn thức ăn tốt đối với trẻ đặc biệt với trẻ bị vSĐ thì ngoài sữa mẹ có thể cho trẻ ăn thêm sữa bò. Với các loại protid khác thì cá là nguồn dinh dưỡng tốt, dễ thu ỷ phản rất
có lợi cho trẻ bị SĐ, hạn chế thức ăn khó tiêu như lòng trắng trứng đổng thời thức ăn của trẻ cần được làm nhỏ, đun chín.
3.3.3. Kết luận chung.
Việc kết hợp các protease có tác dụng hỗ trợ tiêu hoá, chúng có khả năng thu ỷ phân được nhiều loại prolein trong bữa ăn hàng ngàỵ Với kỹ thuật bào chế hiện nay thì việc tạo các chế phẩm kết hợp các protease có thể thay thế cho các chế phẩm đơn protease mà lại cho tác dụng tốt hơn nhất là khi phải ăn tăng protein trong chế độ phục hồi SĐ, không phải tăng liều, tránh được những tác đụng phụ nhất là đối với trẻ em.
Trong các chế phẩm hỗn hợp đã nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng các hỗn hợp papain với pepsin và papain với pancreatin có độ ổn định hoạt tính cao, có tác dụng hiệp đồng với nhau nên có thể đưa chế phẩm có chứa 2 loại protease này vào trong chương trình phòng và chống SĐ. Riêng chế phẩm chứa pepsin với pancrcatin và chế phắm chứa 3 thành phẩn, do ảnh hưởng của pepsin tới sự giảm hoạt tính pancreatin vì vậy việc kết hợp các loại protease này vói nhau (rong chế phẩm hỗn hợp dạng bột líl không nôn. Tuy nliiôn có thể sử dụng kỹ thuật vi nang để tránh sự ảnh hưởng đó nhằm tạo được chế V"- phẩm hỗn hợp enzym có lác dụng hỗ trợ tiêu hoá suốt từ dạ dày tới ruột.
PHẦN IV
KẾT LUẬN #
1. Từ 3 loại chế phẩm protease là bột pepsin, papain và panrceatin đã phối họp để tạo ra 4 loại hỗn hợp protease dưới dạng bột.
2. Đã thử nghiệm các chế phắm nghiên cứu trong một số môi trường pH khác nhau (pH 2; 4; 7,5; 8,5). Kết quả cho thấy hoạt độ các protease bị ảnh hưởng bởi pH khác nhau, ỏ môi trường pH 4 - 7,5 cả 3 loại protease có hoạt độ ít bị ảnh hưởng so với ò pH 2 và 8,5.
3. Hoạt độ protease của các chế phẩm nghiên cứu là những hỗn hợp được tạo ra đều bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ tương tự như bột nguyên liệu ban đầụ
4. Mức độ thuỷ phân một số protid là thực pliẩm thường dùng của người Việt Nam của các protease trong các chế phẩm nghiên cứu có sự khác nhau giữa các loại chế phẩm và cơ chất. Nhưng hoạt độ protease chung của các hỗn hợp đều có kết quả cao hơn hoạt độ cùng hàm lượng của chế phẩm nguyên liệu đầụ Mức độ thu ỷ phân giảm theo cơ chất: casein —* protid cá —> protid bò —> protid gà —» protid. lợn.
5. Hoạt độ các protease của các chế phẩm ở dạng bột có giảm trong thời gian theo dõi đặc biệt là pepsin, panc-reatin trong các chế phẩm hỗn hợp.
6. Chế phẩm bao gồm pepsin + pancreatin + papain (1:1:1) có khả năng hoạt động ở 3 vùng pH acicl, (rung tính và kiồm nhẹ. Đây là cơ sở cải tiến quy (rình tạo chế phẩm hỗn họp enzym có thể được ứng dụng để phục hồi SĐ đạt hiệu quả tốt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Iĩách khoa toàn thư bệnh học , Tập 1 - Trung tâm biên soạn từ điển Bách khoa Việt Nam, 1994, trang 260 - 263.
2. Hoá sinh 1, II - Bộ môn Hoá sinh, vi sinh , Trường Đại học Dược Hà Nội - 1996 , trang 3 6 -6 1 ( tập 1 ) , trang 128 - 175 ( lộp 2) .
3. Tình hình dinh dưỡng và chiến lược hành động ở Việt Nam ( 1998)-
Công trình Hội nghị khoa học taị Viện dinh dưỡng quốc gia , trang 134.
4. Vũ Đình Vinh, Đặng Thanh Phức, Đỗ Đình Hồ - Kỹ T huật y sinh hoá - Trường Đại Học quân y 1974 - trang 222-224, 295-397, 571-572.
5. Đỗ Tất Lợi - Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam - Nhà xuất bản y học Hà Nội 1991 , trang 300, 412.
6. Nguyễn Xuân Thắng - Các yếu tố ảnh hưởng đến trạng thái hoạt động
VÌ1 không hoạt động của protease thực vật dùng làm thuốc - Tạp chí Y học
Việt Nam số 8 -1997, trang 44 - 50.
7 . Nguyễn Xuân Thắng - Sự biến dạng phân tử và tính chất của protease
thực vật dùng IÙĨ11 thuốc - Hội nghị khoa học công nghệ - Trường Đại học Dược Hà Nội - 1998, (rang 94 - 98.
8. Đỗ Thị Thanh, Chuyên luận chế phẩm enzym dùng trong điều trị, 1993,
trang 13 - 14.
9. Kiinmel, J.R and Smith, ẸLxCrystalline papain , .ỊBiochan ( 1954) , page 207, 515.
10. Enzyni nom enclature - Printed in the Netherland 1972 , page 242. I Ị MIMS Việt Nam ( 1997) .Volume 2, number 2 - page 29,30.