Lựa chọn chủng vi khuẩn để chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi do actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida và streptococcus suis gây ra ở lợn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN HUYÊN LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ðỂ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY RA Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN HUYÊN LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ðỂ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY RA Ở LỢN CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y Mà SỐ: 60 64 01 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. CÙ HỮU PHÚ 2. PGS. TS. NGUYỄN HỮU NAM HÀ NỘI, NĂM 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2013 Tác giả Nguyễn Xuân Huyên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin ñược ñặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS. TS. Cù Hữu Phú, người ñã trực tiếp hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin ñược chân thành cảm ơn thầy PGS. TS. Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y, Ban ñào tạo sau ðại học- Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh ñạo Viện Thú y, các anh chị em ñồng nghiệp tại Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y, ñặc biệt là gia ñình ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2013 Tác giả Nguyễn Xuân Huyên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv MỤC LỤC Trang Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix MỞ ðẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 ðặc tính của vi khuẩn A. pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi - màng phổi do vi khuẩn gây ra ở lợn 3 1.2 ðặc tính của vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi do vi khuẩn gây ra ở lợn 12 1.3 ðặc tính của vi khuẩn S. suis và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn 17 1.4 Tình hình sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn ở nước ta 24 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nội dung nghiên cứu 27 2.2 ðối tượng và ñịa ñiểm nghiên cứu 27 2.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết quả thu thập các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập ñược dùng cho nghiên cứu 40 3.2 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu 40 3.3 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype của các chủng P. multocida nghiên cứu. 47 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 3.4 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng S. suis nghiên cứu 50 3.5 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 58 3.6 Kết quả gây bệnh thực nghiệm một số chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên lợn 63 3.7 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ở lợn 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 1. Kết luận 74 2. Kiến nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AGID Agar Gel Immuno Diffusion A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae Apx Apx-toxins (ðộc tố Apx) BHI Brain Heart Infusion bp Base pair CAMP Christie Atkins Munch-Peterson CFU Colony Forming Unit CPS Capsule polysaccharide cs. Cộng sự ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay et al. (và) cộng sự H. pleuropneumoniae Haemophilus pleuropneumoniae LPS Lipopolysaccaride LD 50 50% Lethal Dose NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide OMPs Outer membrane proteins PCR Polymerase Chain Reaction PPLO Pleuropneumonia-like organism P. multocida Pasteurella multocida PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome RTX-toxin Repeats in the Structural Toxin S. aureus Staphylococcus aureus S. suis Streptococcus suis TCN Tiêu chuẩn ngành TYE Tryptone Yeast Extract Broth TSA Tryptone Soya Agar TSB Tryptic Soy Broth THB Todd Hewitt Broth YE Yeast Extract Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng ñể xác ñịnh gen omlA 29 Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh gen quy ñịnh sản sinh ba loại ñộc tố Apx của A. pleuropneumoniae 30 Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi ñể xác ñịnh serotype A, B, D của P. multocida 32 Bảng 2.4 Trình tự mồi dùng ñể xác ñịnh gen gdh của S. suis 34 Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh một số gen mã hoá các yếu tố ñộc lực của S. suis 35 Bảng 2.6 Trình tự các mồi dùng ñể xác ñịnh các serotype 1, 2, 7, 9 của S. suis 36 Bảng 3.1 Kết quả lựa chọn các chủng vi khuẩn dùng cho nghiên cứu 40 Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh học của các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu 42 Bảng 3.3 Kết quả giám ñịnh A. pleuropneumoniae bằng phương pháp PCR 43 Bảng 3.4 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu bằng phản ứng AGID 44 Bảng 3.5 Kết quả xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố Apx của các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu 46 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh học của các chủng P. multocida nghiên cứu 48 Bảng 3.7 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng P. multocida nghiên cứu 49 Bảng 3.8 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh học của các chủng S. suis nghiên cứu 51 Bảng 3.9 Kết quả giám ñịnh S. suis bằng phương pháp PCR 52 Bảng 3.10 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng S. suis nghiên cứu 54 Bảng 3.11 Kết quả xác ñịnh các gen mã hoá một số yếu tố ñộc lực của các chủng S. suis nghiên cứu 57 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 59 Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng P. multocida nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 61 Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng S. suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 63 Bảng 3.15 Kết quả gây bệnh thực nghiệm một số chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trên lợn 65 Bảng 3.16 ðặc tính của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis ñược chọn ñể chế tạo thử nghiệm vacxin 69 Bảng 3.17 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin 70 Bảng 3.18 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin trên chuột nhắt trắng 71 Bảng 3.19 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 72 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn 38 Hình 3.1 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh A. pleuropneumoniae 43 Hình 3.2 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng A. pleuropneumoniae 44 Hình 3.3 Sản phẩm PCR xác ñịnh ñộc tố Apx của A. pleuropneumoniae 46 Hình 3.4 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng P. multocida nghiên cứu 50 Hình 3.5 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh serotype của P. multocida 50 Hình 3.6 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh S. suis 53 Hình 3.7 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng S. suis nghiên cứu 55 Hình 3.8 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh serotype của S. suis 55 Hình 3.9 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh ñộc tố của S. suis 57 Hình 3.10 Lợn chết do gây bệnh thực nghiệm 66 Hình 3.11 Phổi lợn bị viêm dính thành ngực do A. pleuropneumoniae 66 Hình 3.12 Phổi lợn bị viêm do P. multocida 67 Hình 3.13 Lợn bị viêm, xuất huyết màng não do S. suis 67 [...]... ph i do A pleuropneumoniae, b nh vi m teo mi truy n nhi m do B bronchiseptica, ủúng d u l n do Erysipelothrix rhusiopathiae, vi m ph i ủa thanh d ch do H parasuis v t huy t trựng l n do P multocida gõy ra l n - Vacxin Donoban 10 (hóng Virbac): l lo i vacxin ủa giỏ cú tỏc d ng phũng ng a cựng lỳc cỏc b nh hụ h p trờn l n nh b nh vi m ph i ủ a phng do M hyopneumoniae, vi m ph i - mng ph i do A pleuropneumoniae,. .. trờn heo do vi khu n gõy ra bao g m: B nh vi m ph i ủ a phng do Mycoplasma hyopneumoniae, b nh vi m teo xoang mi truy n nhi m do Bordetella bronchiseptica, b nh t huy t trựng l n do P multocida, b nh Glassers do Haemophilus parasuis v b nh vi m ph i - mng ph i do A pleuropneumoniae gõy ra - Vacxin Parapleuro Shieldđ P + BE (hóng Novatis): vacxin ủa giỏ phũng b nh hụ h p ph c h p trờn l n nh: b nh vi m... ch y u ủ phõn bi t b nh vi m ph i do Pasteurella v i vi m ph i do Actinobacillus, trong ủú th ng th y m ch y ra cú mu vng v dớnh cựng v i r t nhi u s i fibrin (Pijoan and Fuentes, 1989) 1.3 c tớnh c a vi khu n S suis v b nh do vi khu n gõy ra l n 1.3.1 c tớnh sinh h c c a vi khu n S suis * c tớnh hỡnh thỏi v tớnh ch t nuụi c y: Theo Quinn et al (1994), S suis thu c gi ng Streptococcus, h Streptococcaceae,... vi khu n S suis (Fittipaldi et al., 2012) 1.3.2 B nh do S suis gõy ra l n B nh do vi khu n S suis gõy ra ra l n m i l a tu i, nhng ph bi n l n hay cũn g i l b nh liờn c u l nx y l n con m t vi tu n tu i ủ n sau cai s a vi tu n c bi t S suis serotype 2 cú th gõy b nh cho ng i c trng lõm sng c a b nh l nhi m trựng huy t, vi m mng nóo, vi m kh p v vi m ph qu n ph i Th nhi m trựng huy t v vi m nóo cú... ủó v ủang ti n hnh nghiờn c u hon thi n quy trỡnh ch t o vacxin ủa giỏ phũng b nh vi m ph i l n do 3 lo i vi khu n A pleuropneumoniae, P multocida v S suis gõy ra Vacxin ủ c s n xu t t cỏc ch ng vi khu n A pleuropneumoniae, P multocida v S suis phõn l p ủ c t l n m c b nh vi m ph i cỏc ủ a phng n c ta D ki n ủõy s l lo i vacxin ủa giỏ phũng b nh vi m ph i cho l n ủ c s n xu t l n ủ u tiờn n c ta v s... A pleuropneumoniae, vi m ph i ủa thanh d ch (b nh Glassers) do Haemophilus, b nh t huy t trựng do P multocida, vi m teo mi truy n nhi m do B bronchiseptica, v ủ c bi t l liờn c u khu n do S suis serotype 2 gõy ra l n - Vacxin Porcilisđ APP (hóng Intervet), vacxin BIOFORS APP (hóng Formosa), vacxin COGLAPIXđ (hóng Ceva): phũng b nh vi m ph i - mng ph i do A pleuropneumoniae gõy ra l n Tr ng i h c Nụng... t s vựng c a mng ph i cú th b vi m dớnh vo thnh ng c 1.2 c tớnh c a vi khu n P multocida v b nh vi m ph i do vi khu n gõy ra l n 1.2.1 c tớnh sinh h c c a vi khu n P multocida * c tớnh hỡnh thỏi v tớnh ch t nuụi c y: Theo phõn lo i c a Carter (1984) thỡ P multocida n m trong b Eubacteriales, thu c h Pasteurellaceae, thu c gi ng Pasteurella v thu c loi P multocida P multocida l lo i c u tr c khu... (Heddleston, 1972) 1.2.2 B nh vi m ph i do P multocida gõy ra l n Vi khu n P multocida cú th l nguyờn nhõn nguyờn phỏt ho c th phỏt gõy ra th b nh vi m ph i l n, b nh cú th gõy ch t l n ho c lm gi m kh nng tng tr ng c a l n do v y gõy thi t h i r t l n cho ng i chn nuụi Theo De Alwis (1992), b nh vi m ph i do P multocida gõy ra xu t hi n r ng kh p th gi i, nhng b nh hay x y ra v gõy thi t h i ủ i nh:... Pakistan, Iran, Thỏi Lan, Philippin, Indonexia, Tri u tiờn, Lo v Vi t Nam, t t c cỏc ủi u ki n khớ h u v ủi u ki n chn nuụi Vỡ vi khu n P multocida th ng c trỳ ủ ng hụ h p trờn c a l n kho m nh do v y r t khú tiờu di t Vi khu n P multocida gõy b nh th ng k t h p v i cỏc tỏc nhõn khỏc nh Mycoplasma hyopneumoniae, A pleuropneumoniae, lm cho quỏ trỡnh vi m ph i cng n ng thờm B nh vi m ph i do vi khu n P multocida. .. serotype D (chi m t l 31,43%) * Tri u ch ng v b nh tớch c a b nh vi m ph i do vi khu n P multocida gõy ra l n: Tri u ch ng lõm sng c a b nh vi m ph i do P multocida gõy ra r t khỏc nhau tựy thu c vo t ng ch ng vi khu n gõy b nh, th ng xu t hi n 3 th : - Th c p tớnh: Th ny thụng th ng do h u h t cỏc ch ng P multocida thu c serotype B gõy ra Nh ng con v t m c b nh th ng cú bi u hi n khú th , húp b ng vo . pleuropneumoniae và bệnh vi m phổi - màng phổi do vi khuẩn gây ra ở lợn 3 1.2 ðặc tính của vi khuẩn P. multocida và bệnh vi m phổi do vi khuẩn gây ra ở lợn 12 1.3 ðặc tính của vi khuẩn S. suis và bệnh do. hấp ở lợn (PRRS) và bệnh vi m phổi ở lợn do vi khuẩn gây ra với vai trò gây bệnh vi m phổi của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis ở lợn nuôi tại Vi t nam. Với 453 mẫu bệnh. XUÂN HUYÊN LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ðỂ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH VI M PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY RA Ở LỢN CHUYÊN