2.4.1 Phương pháp giám ựịnh, xác ựịnh serotype và các yếu tố gây bệnh của vi
khuẩnA. pleuropneumoniae
* Phương pháp giám ựịnh các ựặc tắnh sinh học của vi khuẩn A. pleuropneumoniae
Phương pháp giám ựịnh các ựặc tắnh nuôi cấy trên các loại môi trường, ựặc tắnh sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập ựược theo Moller et al. (1996) và theo các quy trình thường quy trong phòng thắ nghiệm Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y (Cù Hữu Phú và cs., 2011).
* Phương pháp xác ựịnh A. pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR
Xác ựịnh A. pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR theo Gram et al. (1998): - Chuẩn bị ADN ựắch: Trộn 10 ộl canh trùng nuôi cấy với 200 ộl nước cất vô trùng. Huyễn dịch sau ựó ựược xử lý nhiệt, làm lạnh, ly tâm và sử dụng 1 ộl dịch nổi cho phản ứng PCR.
- Mồi sử dụng: Cặp mồi của phản ứng ựược dựa vào chuỗi gen mã hóa omlA
(outer membrane lipoprotein) ựặc trưng cho A. pleuropneumoniae, gồm một mồi xuôi LPF và một mồi ngược LPR, trình tự nucleotide của mồi ựược trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng ựể xác ựịnh gen omlA của A. pleuropneumoniae
Gen ựắch Ký hiệu
mồi Trình tự nucleotide (5Ỗ-3Ỗ) Sản phẩm
LPF AAGGTTGATATGTCCGCACC
OmlA
LPR CACCGATTACGCCTTGCC 950 bp
- Thành phần của phản ứng PCR: Phản ứng PCR ựược thực hiện với tổng thể tắch là 25 ộl, bao gồm các thành phần: 1 ộl của mỗi loại mồi (10 ộM/ộl), 5 ộl PCR buffer 5x [(750 mM Tris-HCl (pH 8.8), 200 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20), 2 mM MgCl2, 200 ộM mỗi loại dNTP], 0.05 ộl Taq DNA Polymerase (5 units/ộl), nước cất vừa ựủ 25 ộl.
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR bao gồm các bước: 94◦C/2 phút, 26 chu kỳ (94◦C/1 phút, 52◦C/1 phút, 72◦C/1 phút) và 72◦C/10 phút.
- Phân tắch sản phẩm: Sản phẩm của phản ứng PCR ựược ựiện di trên thạch agarose 1,5% trong dung dịch 1xTAE với hiệu ựiện thế 100V/30 phút, sau ựó nhuộm với ethidium bromide trong 15- 20 phút. đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000. Nếu vạch sản phẩm ADN hiển thị tương ựương với 950 bp thì có thể kết luận chủng vi khuẩn kiểm tra là A. pleuropneumoniae.
* Phương pháp xác ựịnh ựộc tố Apx của A. pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR
Xác ựịnh gen sản sinh ựộc tố (Apx) của vi khuẩn A. pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR theo Frey et al. (1995):
- Chuẩn bị ADN ựắch: Tương tự như mô tả ở trên.
- Mồi sử dụng: Gồm 5 cặp mồi xác ựịnh 3 loại ựộc tố (Apx) của A. pleuropneumoniae, trình tự nucleotide của các cặp mồi ựược trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi dùng ựể xác ựịnh gen quy ựịnh sản sinh ba loại ựộc tố Apx của A. pleuropneumoniae
Gen ựắch Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5Ỗ- 3Ỗ) Sản phẩm (bp) XICA-F TTGCCTCGCTAGTTGCGGAT apxICA XICA-R TCCCAAGTTCGAATGGGCTT 2420 XIICA-F CCATACGATATTGGAAGGGCAAAT apxIICA XIICA-R TCCCCGCCATCAATAACGGT 2088 XIIICA-F CCTGGTTCTACAGAAGCGAAAATC apxIIICA XIIICA-R TTTCGCCCTTAGTTGGATCGA 1755 XIBD-F GTATCGGCGGGATTCCGT apxIBD XIBD-R ATCCGCATCGGCTCCCAA 1447 XIIIBD-F TCCAAGCATGTCTATGGAACG apxIIIBD XIIIBD-R AACAGAATCAAAATCAGCTTGGTT 968
- Thành phần của phản ứng Multiplex PCR: Phản ứng ựược thực hiện với tổng thể tắch là 25 ộl, bao gồm các thành phần tương tự như mô tả ở trên.
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR bao gồm các bước: 94◦C/5 phút, 35 chu kỳ (94◦C/1 phút, 55◦C/2 phút, 72◦C/1 phút) và 72◦C/10 phút.
- Phân tắch sản phẩm: Tiến hành như mô tả ở trên. Nếu các vạch sản phẩm ADN hiển thị tương ựương với sản phẩm của các cặp mồi tương ứng như trong bảng 2.2 thì có thể kết luận chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae kiểm tra có sản sinh các ựộc tố Apx ựó.
* Phương pháp xác ựịnh serotype của A. pleuropneumoniae
Xác ựịnh serotype của A. pleuropneumoniae bằng phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch (AGID) theo Mittal et al. (1982), như sau:
- Chuẩn bị kháng nguyên: Vi khuẩn nuôi cấy qua ựêm trên thạch TSA có bổ sung 1- 3% Yeast Extract, sau ựó tiến hành rửa mặt thạch bằng 1 ml PBS 0,3% formalin. Xử lý nhiệt canh trùng thu ựược và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Thu lấy phần nước trong, giữ ở 4◦C ựể làm phản ứng.
- Chuẩn bị thạch: Cân 0,5 g Noble agar cho vào lọ chứa 50 ml PBS-Sodium azide. Lắc và ựun sôi cho tan hoàn toàn bằng lò vi song. đổ khoảng 7 ml thạch vào mỗi ựĩa lồng ựường kắnh 5 cm. Sau khi thạch ựông, tiến hành ựục lỗ bằng dụng cụ ựục lỗ (gồm 1 lỗ trung tâm và 6 lỗ xung quanh). đường kắnh mỗi lỗ theo tiêu chuẩn ựạt 4 mm, khoảng cách giữa các lỗ và với lỗ trung tâm là 6 mm.
- Cách tiến hành: Cho 8 ộl kháng nguyên cần xác ựịnh vào lỗ ở giữa và 8 ộl kháng huyết thanh không pha loãng vào các lỗ xung quanh. Giữ ựĩa kiểm tra ở nhiệt ựộ phòng và ựọc kết quả sau 24- 48 giờ. Kết quả dương tắnh khi xuất hiện vạch ngưng kết ở khoảng cách giữa hai lỗ kháng nguyên và kháng huyết thanh.
2.4.2 Phương pháp giám ựịnh, xác ựịnh serotype của vi khuẩnP. multocida
* Phương pháp giám ựịnh các ựặc tắnh nuôi cấy, ựặc tắnh sinh học của vi khuẩn P. multocida
Giám ựịnh tắnh chất nuôi cấy trên các loại môi trường, ựặc tắnh sinh hóa, khả năng lên men ựường của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập ựược theo các quy trình thường quy trong phòng thắ nghiệm Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y (Cù Hữu Phú và cs., 2011).
* Phương pháp xác ựịnh serotype của P. multocida
Xác ựịnh các type giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida dựa trên phản ứng Multiplex PCR ựược mô tả bởi đỗ Ngọc Thúy và cs. (2007), gồm các cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R ựể xác ựịnh serotype A, CAPB-F và CAPB-R ựể xác ựịnh serotype B, CAPD-F và CAPD-R ựể xác ựịnh serotype D. Trình tự các cặp mồi và kắch cỡ sản phẩm ựược trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi dùng ựể xác ựịnh serotype A, B, D của P. multocida
Serotype Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5Ỗ- 3Ỗ) Sản phẩm (bp) CAPA-F TGCCAAAATCGCAGTGAG A CAPA-R TTCCCATCATTGTCAGTG 1044 CAPB-F CATTTATCCAAGCTCCACC B CAPB-R GCCCGAGAGTTTCAATCC 760 CAPD-F TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC D CAPD-R CATCTACCCACTCAACCATATCAG 657
- Chuẩn bị ADN ựắch: ADN mẫu ựược lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn P. multocida cần xác ựịnh ựã ựược nuôi cấy ở 37◦C/24 giờ trên môi trường thạch máu.
- Thành phần phản ứng: Phản ứng PCR ựược thực hiện với tổng thể tắch là 25 ộl, bao gồm các thành phần: 1 ộl của mỗi loại mồi (10 ộM/ộl), 5 ộl PCR buffer 5x [(750 mM Tris-HCl (pH 8.8), 200 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20, 2 mM MgCl2, 200 ộM của mỗi loại dNTP], 0.05 ộl Taq DNA Polymerase (5 units/ộl), nước cất vừa ựủ 25 ộl.
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm các bước: 94◦C/3 phút, 30 chu kỳ nhiệt (94◦C/1 phút, 55◦C/1 phút, 72◦C/1 phút) và 72◦C/7 phút.
- Sản phẩm của phản ứng PCR sau khi ựược ựiện di, nhuộm ethidium bromide, ựọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000 sẽ ựược so sánh với kắch cỡ sản phẩm của các cặp mồi như trong bảng 2.3 ựể xác ựịnh serotype tương ứng.
2.4.3 Phương pháp giám ựịnh, xác ựịnh serotype và các yếu tố gây bệnh của vi khuẩnS. suis
* Phương pháp giám ựịnh các ựặc tắnh nuôi cấy, ựặc tắnh sinh học của vi khuẩn S. suis
Giám ựịnh tắnh chất nuôi cấy trên các loại môi trường, ựặc tắnh sinh hóa, khả năng lên men ựường của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập ựược theo Quinn et al.
(1994) và các quy trình thường quy trong phòng thắ nghiệm Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y (Cù Hữu Phú và cs., 2011).
* Phương pháp xác ựịnh S. suis bằng kỹ thuật PCR
Các phương pháp PCR dùng ựể xác ựịnh vi khuẩn S. suis và các yếu tố gây bệnh, cũng như một số serotype gây bệnh thông thường của vi khuẩn S. suis ựược thực hiện theo quy trình ựã ựược chuẩn hoá của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y (đỗ Ngọc Thúy và Lê Thị Minh Hằng, 2009). Có thể tóm tắt phản ứng như sau:
- ADN ựắch: là một lượng nhỏ khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần xác ựịnh ựã ựược nuôi cấy trên ựĩa thạch máu cừu ở 37oC (5% CO2) trong 24 giờ.
- Mồi của phản ứng PCR: Cặp mồi của phản ứng ựược thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hoá glutamate dehydrogenase (gdh) ựặc trưng cho vi khuẩn S. suis, gồm 1 mồi xuôi là Str2-F và 1 mồi ngược là Str2-R. Trình tự các nucleotide của mồi ựược trình bày ở bảng 2.4.
- Thành phần của phản ứng PCR: Phản ứng ựược thực hiện với tổng thể tắch là 25 ộl, bao gồm các thành phần: 1 ộl của mỗi loại mồi (10 ộM/ộl), 5 ộl PCR buffer 5x [(750 mM Tris-HCl (pH 8.8), 200 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20, 2 mM
MgCl2, 200 ộM của mỗi loại dNTP], 0.05 ộl Taq DNA Polymerase (5 units/ộl), nước cất vừa ựủ 25 ộl.
Bảng 2.4 Trình tự mồi dùng ựể xác ựịnh gen gdh của S. suis
Gen ựắch Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5 Ỗ - 3 Ỗ) Sản phẩm gdh Str2-F Str2-R GCAGCGTATTCTGTCAAACG CCATGGACAGATAAAGATGG 688 bp
- Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94◦C/5 phút, 35 chu kỳ nhiệt (94◦C/1 phút, 55◦C/1 phút, 72◦C/1 phút) và 72◦C/7 phút.
- Phân tắch sản phẩm: Sản phẩm của phản ứng PCR ựược tiến hành chạy ựiện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1xTAE với hiệu ựiện thế 50V trong 30 phút. đọc kết quả và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc 2000. Nếu sau quá trình ựiện di cho kắch cỡ các vạch ADN hiển thị tương ựương với 688 bp thì có thể kết luận chủng vi khuẩn kiểm tra là vi khuẩn S. suis.
* Phương pháp xác ựịnh các gen mã hoá một số yếu tố ựộc lực của vi khuẩn S. suis bằng kỹ thuật PCR
Việc xác ựịnh 4 yếu tố gây bệnh của S. suis ựược thực hiện bằng phản ứng Multiplex PCR. Về nguyên tắc, phương pháp này ựược thực hiện tương tự như phương pháp PCR ựể xác ựịnh vi khuẩn S. suis, chỉ khác về thành phần của phản ứng và các chu kỳ nhiệt.
- Mồi của phản ứng ựược thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hoá sinh tổng hợp 4 yếu tố liên quan ựến ựộc lực là: yếu tố ngoại bào (EF, epf), protein giải phóng muramidase (MRP, mrp), suilysin (SLY, sly) và enzym arginine deiminase (ARC, arcA). Trình tự các mồi và các sản phẩm tương ứng của chúng tạo ra ựược trình bày ở bảng 2.5:
- Thành phần các chất trong phản ứng tương tự như thành phần phản ứng PCR xác ựịnh vi khuẩn S. suis, chỉ khác về chu kỳ nhiệt của phản ứng, gồm các
bước: 94◦C/5 phút, 35 chu kỳ nhiệt (94◦C/1 phút, 53◦C/1 phút, 72◦C/90 giây) và 72◦C/7 phút.
Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi dùng ựể xác ựịnh một số gen mã hoá các yếu tố ựộc lực của S. suis Gen ựắch Ký hiệu Mồi Trình tự nucleotide (5 Ỗ - 3 Ỗ) Sản phẩm (bp) epf epf-F epf-R CGCAGACAACGAAAGATTGA AAGAATGTCTTTGGCGATGG 744 sly sly-F sly-R GCTTGACTTACGAGCCACAA CCGCGCAATACTGATAAGC 248 mrp mrp-F mrp-R ATTGCTCCACAAGAGGATGG TGAGCTTTACCTGAAGCGGT 188 arc arcA-F arcA-R TGATATGGTTGCTGCTGGTC GGACTCGAGGATAGCATTGG 118
* Phương pháp xác ựịnh các gen mã hoá các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S. suis bằng kỹ thuật PCR
Bốn serotype S. suis gây bệnh thường gặp nhất ở lợn là serotype 1, 2, 7 và 9 ựược xác ựịnh bằng phản ứng Multiplex PCR.
- Mồi của phản ứng: Các cặp mồi dùng ựể xác ựịnh các serotyp 1, 2, 7 và 9 của S. suis ựược lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps1J-F và cps1J-R ựể xác ựịnh serotype 1, cps2J-F và cps2J-R ựể xác ựịnh serotype 2, cps7H-F và cps7H-R ựể xác ựịnh serotype 7, cps9H-F và cps9H-R ựể xác ựịnh serotype 9. Trình tự các mồi và các sản phẩm tương ứng của chúng tạo ra ựược trình bày ở bảng 2.6.
- Các thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng Multiplex PCR dùng ựể xác ựịnh serotype của S. suis giống như trong phản ứng dùng ựể xác ựịnh các gen mã hoá các yếu tố ựộc lực của vi khuẩn này.
Bảng 2.6 Trình tự các mồi dùng ựể xác ựịnh các serotype 1, 2, 7, 9 của S. suis Serotype Ký hiệu Mồi Trình tự nucleotide (5 Ỗ - 3 Ỗ) Sản phẩm (bp) 1 cps1J-F cps1J-R TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T
TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A 637
2 cps2J-F cps2J-R
TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG
TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC 498
7 cps7H-F cps7H-R
AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG
TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA 379
9 cps9H-F cps9H-R
GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT
CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA 303
2.4.4 Phương pháp xác ựịnh ựộc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis trên chuột nhắt trắng và gây bệnh thực nghiệm trên lợn
* Phương pháp xác ựịnh ựộc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trên chuột nhắt trắng
- Xác ựịnh ựộc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của Carter (1995).
Sử dụng canh trùng ựược nuôi cấy ở 37◦C trong 24 giờ của mỗi chủng vi khuẩn cần kiểm tra tiêm vào phúc xoang cho 2 chuột nhắt trắng, liều tiêm 0,2 ml/chuột. Theo dõi số chuột sống và chết trong thời gian 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, thời gian giết chết chuột ựể ựánh giá ựộc lực của vi khuẩn. Chuột chết ựược mổ khám, lấy máu tim nuôi cấy phân lập lại vi khuẩn.
- Tắnh liều LD50 theo Reed & Muench (1938).
* Phương pháp gây bệnh thực nghiệm trên lợn
- động vật thắ nghiệm: Lợn 35 ngày tuổi khỏe mạnh, chưa ựược tiêm vacxin phòng bệnh viêm phổi có thành phần kháng nguyên A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis và kiểm tra huyết thanh học cho kết quả kháng thể âm tắnh với 3 loại vi khuẩn này.
- Chọn chủng: Chọn một số chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis thuộc các serotype thường gặp, có ựộc lực mạnh trên chuột nhắt trắng và có sản sinh các yếu tố gây bệnh ựiển hình ựể kiểm tra khả năng gây bệnh trên lợn.
- Tiến hành: Canh trùng của các chủng vi khuẩn ựược chuẩn bị như sau: Các chủng A. pleuropneumoniae ựược nuôi cấy trong môi trường nước thịt TYE, các chủng P. multocida ựược nuôi cấy trong môi trường nước thịt BHI và các chủng S. suis ựược nuôi cấy trong môi trường nước thịt THB, tất cả ựều ựược bồi dưỡng ở tủ ấm 37◦C trong 24 giờ.
Thắ nghiệm ựược bố trắ như sau: Canh trùng của mỗi chủng vi khuẩn sau khi nuôi cấy ựược tiêm cho 2 lợn, mỗi lợn gây nhiễm với 5 ml canh trùng qua ựường khắ quản. Lô ựối chứng 2 lợn ựược tiêm 5 ml nước muối sinh lý theo ựường tương tự. Theo dõi các biểu hiện triệu chứng của lợn thắ nghiệm sau khi gây nhiễm. Khi lợn chết tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tắch và lấy mẫu phân lập lại vi khuẩn.
2.4.5 Phương pháp chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn
* Lựa chọn chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida vàS. suis ựể chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn
Tiến hành lựa chọn các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida
và S. suis thuộc serotype ựặc trưng, mang ựầy ựủ các yếu tố gây bệnh và có ựộc lực cao ựể sử dụng làm giống chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn.
* Phương pháp chế tạo thử nghiệm vacxin
Vacxin ựược chế tạo thử nghiệm theo quy trình sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có bổ trợ keo phèn, bằng phương pháp lên men sục khắ tại Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y. Quy trình tóm tắt ựược trình bày ở hình 2.1.
Kiểm tra thuần khiết
đếm số và kiểm tra thuần khiết
Kiểm tra vô trùng
Hình 2.1 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn
* Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin chế tạo ựược
Do hiện nay chưa có quy trình kiểm nghiệm riêng cho vacxin viêm phổi vô hoạt có bổ trợ keo phèn, nên vacxin sau khi chế tạo ựược tiến hành kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn 10 TCN 160-92 và 10 TCN 161-92 (2003) ựối với vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn (Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương 1).
Giống vi khuẩn
Thạch máu, thạch PPLO
Giống nhỏ
Giống sản xuất
Lên men sục khắ
Vô hoạt bằng formol 0,5%
Bổ sung keo phèn 20%