Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase

 Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án gồm các nội dung chính sau đây: + Thu nhận, tinh sạch và xác định đặc tính của enzyme từ chủng cải tạo 2 - Xây dựng quy trình

Tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu

Nhân dịp này cho tôi gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp và các bạn bè đồng nghiệp, Trường đại học Lâm nghiệp đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện, thư

ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án

Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức nhiệt tình của gia đình, bè bạn đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận án nghiên cứu này

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Vũ Kim Dung

LỜI CAM ĐOAN

Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất Pectic oligosaccharide (POS) bằng enzyme ứng dụng trong chế biến thực phẩm chức năng”

mã số ĐT.04.14/CNSHCB, thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 của Bộ Công thương

Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN 4

1.1 Prebiotic và pectic oligosaccharide 4

1.1.1 Prebiotic 4

1.1.2 Pectic oligosaccharide (POS) – nguồn prebiotic tiềm năng 5

1.1.2.1 Cấu tạo 5

1.1.2.2 Đặc tính sinh học của POS 6

1.2 Cơ chất pectin 8

1.2.1 Cấu tạo 8

1.2.2 Pectin từ vỏ chanh leo 11

1.2.3 Enzyme thủy phân pectin 12

1.3 Endopolygalacturonase 13

1.3.1 Vai trò và nguồn thu 13

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận endopolygalacturonase 14

1.3.2.1 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng và nguồn carbon 14

1.3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 15

1.3.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố khác 16

1.3.3 Đột biến cải tạo chủng 16

1.3.4 Tách và tinh sạch enzyme 18

1.3.4.1 Thu chế phẩm endopolygalacturonase thô 18

1.3.4.2 Các phương pháp kết tủa và lọc 18

1.3.4.3 Tinh sạch endopolygalacturonase 19

1.3.5 Đặc tính xúc tác 20

1.4 Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS) 21

1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân 23

1.4.2 Tách, tinh sạch 24

1.4.3 Sấy tạo sản phẩm 26

1.5 Các phương pháp đánh giá pectic oligosaccharide (POS) 26

1.5.1 Phân tích định tính 26

1.5.2 Phân tích định lượng 27

1.5.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 29

1.5.3.1 Đánh giá hoạt tính prebiotic trong điều kiện in vitro 29

1.5.3.2 Đánh giá hoạt tính prebiotic trong điều kiện in vivo 30

1.5.3.3 Các chỉ số định lượng hoạt tính prebiotic 30

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 32

2.1.1 Vật liệu 32

2.1.2 Môi trường 32

2.1.3 Hóa chất và enzyme 33

2.1.4 Thiết bị 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Phương pháp vi sinh 35

2.2.1.1 Phân lập chủng sinh endopolygalacturonase 35

2.2.1.2 Xác định nấm sợi bằng hình thái 35

2.2.1.3 Cải tạo chủng A niger sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao 35

2.2.1.4 Xác định điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp EPG cao 36

2.2.1.5 Xác định hoạt tính sinh học của POS 37

2.2.1.6 Xác định vi sinh vật tổng số hiếu khí 37

2.2.1.7 Xác định Escherichia coli 37

2.2.1.8 Xác định Staphylococcus aureus 37

2.2.1.9 Xác định Salmonella 37

2.2.1.10 Thử nghiệm độc tính cấp của pectic oligosaccharide 37

2.2.2 Phương pháp hóa lý – sinh 38

2.2.2.1 Định lượng đường khử bằng DNS 38

2.2.2.2 Xác định hàm lượng POS bằng Kit D-Galacturonic 38

2.2.2.3 Xác định hàm lượng POS bằng HPAEC 40

2.2.2.4 Xác định hoạt độ polygalacturonase 40

2.2.2.5 Xác định hoạt độ endopolygalacturonase 40

2.2.2.6 Xác định hàm lượng protein 40

2.2.2.7 Tinh sạch endopolygalacturonase 40

2.2.2.8 Điện di protein 42

2.2.2.9 Khảo sát đặc tính của endopolygalacturonase 42

2.2.2.10 Phương pháp thu pectin từ vỏ chanh leo 43

2.2.2.11 Xác định hàm lượng pectin 43

2.2.2.12 Xác định chỉ số este hóa của pectin 43

2.2.2.13 Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS 44

2.2.2.14 Xác định thành phần POS bằng sắc ký bản mỏng 44

2.2.2.15 Phương pháp tinh sạch POS 44

2.2.2.16 Chế độ sấy phun 44

2.2.2.17 Bảo quản POS 44

2.2.2.18 Thử nghiệm sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS 44

2.2.3 Phương pháp toán học 45

2.2.3.1 Tối ưu hóa sinh tổng hợp EPG từ A niger UV06-12-23 45

2.2.3.2 Tối ưu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS 46

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Nghiên cứu thu nhận endopolygalacturonase 48

3.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng A niger sinh tổng hợp EPG cao 48

3.1.2 Cải tạo chủng A niger CNTP 5037 có khả năng sinh tổng hợp EPG cao 51 3.1.2.1 Sàng lọc dòng đột biến sinh endopolygalacturonase cao 53

3.1.2.2 Cải tạo chủng bằng kỹ thuật chiếu UV nhiều lần 55

3.1.3 Thu nhận và đặc tính của endopolygalacturonase từ A niger UV06-12-23 56

3.1.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp EPG 56

3.1.3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp EPG từ A niger UV06-12-23 60

3.1.3.3 Tách và tinh sạch EPG từ chủng A niger UV06-12-23 63

3.1.3.4 Đặc tính của EPG từ chủng A niger UV06-12-23 66

3.2 Sản xuất pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo 72

3.2.1 Thu nhận và chuyển hóa HM pectin thành LM pectin 72

3.2.2 Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS 76

3.2.2.1 Lựa chọn nồng độ pectin 77

3.2.2.2 Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp 78

3.2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 79

3.2.2.4 Ảnh hưởng của pH 80

3.2.2.5 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy 81

3.2.2.6 Ảnh hưởng của thời gian 82

3.2.2.7 Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân pectin tạo POS 84

3.2.3 Thu hồi và tinh sạch POS từ dịch thủy phân 88

3.2.3.1 Tinh sạch POS bằng kỹ thuật lọc màng 88

3.2.3.2 Tinh sạch POS qua cột sắc ký 89

3.2.4 Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm POS 91

3.3 Nghiên cứu đánh giá hoạt tính và thăm dò khả năng ứng dụng của POS 100

3.3.1 Hoạt tính sinh học 100

3.3.1.1 Ảnh hưởng của POS đến sự phát triển của vi khuẩn có lợi và có hại 100

3.3.1.2 Khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi bởi POS và các prebiotic khác 103

3.3.1.3 Xác định điểm hoạt tính prebiotic của POS 104

3.3.2 Đánh giá chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS 105

3.3.2.1 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 105

3.3.2.2 Thử nghiệm độc tính cấp của sản phẩm trên chuột 107

3.3.3 Thử nghiệm sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS 109

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112

4.1 Kết luận 112

3.4 Kiến nghị 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

PHỤ LỤC 128

G2 Digalacturonic acid

G3 Trigalacturonic acid

HGA Homogalacturonan

HM Pectin có mức độ methyl hóa cao (High methyl este)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liqiquid chromatography) kDa Kilo Dalton

Kdo 2-keto-3-deoxy-mano-octulosonic

LM Pectin có mức độ methyl hóa thấp (Low metyl este)

NAOS Neoagaro oligosaccharides

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng pectin trong các loại trái cây 8

Bảng 1.2 Thành phần của vỏ chanh leo 12

Bảng 1.3 Khả năng tổng hợp polygalacturonase trên các nguồn cơ chất khác nhau 15

Bảng 1.4 Đặc tính của endopolygalacturonase 20

Bảng 2.1 Hóa chất, dụng cụ chính và enzyme 33

Bảng 2.2 Máy, thiết bị 34

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp 38

Bảng 2.4 Thành phần và trình tự thí nghiệm định lượng galacturonic acid theo 39

Kit D-galacturonic 39

Bảng 2.5 Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu sinh tổng hợp endopolygalacturonase từ chủng A niger UV06-12-23 45

Bảng 2.6 Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa sinh tổng hợp EPG từ A niger UV06-12-23 46

Bảng 2.7 Các biến số trong nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS 47

Bảng 2.8 Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS 47

Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm của các chủng nấm mốc phân lập từ nguồn vỏ quả 48

Bảng 3.2 Giá trị bán kính vòng thủy phân của các chủng nấm mốc thử nghiệm 49

Bảng 3.3 Hoạt độ polygalacturonase của các chủng nấm mốc thử nghiệm 50

Bảng 3.4 Hoạt độ endopolygalacturonase của 7 chủng nấm mốc thử nghiệm 51

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống của A niger CNTP 5037 52

Bảng 3.6 Khả năng tổng hợp endopolygalacturonase của chủng xử lý bằng UV 53

Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của chủng cải tạo qua các lần cấy truyền 54

Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của dòng xử lý bằng UV nhiều lần qua các lần cấy truyền 55

Bảng 3.9 Khả năng sinh EPG của A niger UV06-12-23 qua các lần cấy truyền 56

Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hoạt độ EPG thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau 61

Bảng 3.11 Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5 62

Bảng 3.12 Hoạt độ EPG tại các phân đoạn tương ứng với đỉnh thu được khi tinh sạch 64

Bảng 3.13 Các bước tinh sạch EPG từ A niger UV06-12-23 65

Bảng 3.14 Vận tốc phản ứng endopolygalacturonase tại các nồng độ cơ chất khác nhau 70

Bảng 3.15 Thành phần của pectin tách chiết từ vỏ chanh leo 75

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của thời gian đến chuyển hóa HM pectin thành LM pectin 76

Bảng 3.17 Ma trận thực nghiệm quá trình thủy phân pectin tạo POS 84

Bảng 3.18 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình 85

Bảng 3.19 Hiệu quả của quá trình thủy phân pectin vỏ chanh leo bằng enzyme 88

Bảng 3.20 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc dòng ngang 89

Bảng 3.21 Hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel 90

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô dịch POS trước khi sấy phun 92

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của chế độ sấy đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm 93

Bảng 3.24 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm của vi sinh vật sau 7 ngày bảo quản 95

Bảng 3.25 Kết quả đánh giá chất lượng POS lỏng sau 6 tháng bảo quản 96

Bảng 3.26 Chất lượng của POS dạng bột sau 12 tháng bảo quản 96

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và gây hại 100

Bảng 3.28 Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển đồng thời của vi khuẩn có lợi và có hại 101

Bảng 3.29 Kết quả phân tích hoạt tính sinh học của POS thô dạng bột 102

Bảng 3.30 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trong POS thành phẩm 106

Bảng 3.31 Bảng theo dõi trọng lượng chuột khi cho ăn POS 108

Bảng 3.32 Xác định công thức bánh quy xốp bổ sung POS 110

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Số cơ sở sản xuất và số lượng sản phẩm prebiotic ở Việt Nam 5

Hình 1.2 Cấu tạo của D - galacturonic acid và một pectic oligosaccharide 6

Hình 1.3 Cấu tạo của Pectic polysaccharide 9

Hình 1.4 Công thức của Homogalacturonan 9

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của pectinesterase 12

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của polymethylgalacturonase 13

Hình 1.7 Cơ chế hoạt động của polygalacturonase 13

Hình 1.8 Cơ chất và sản phẩm phân cắt của endopolygalacturonase 21

Hình 1.9 Sơ đồ qui trình chung sản xuất POS bằng pectinase 22

Hình 1.10 Bản sắc ký TLC của dịch thủy phân polygalacturonic acid của endopolygalacturonase từ A kawachii 27

Hình 1.11 Sắc ký đồ dịch POS được phân tích bằng hệ thống HPAEC – PAD 28

Hình 3.1 Khuẩn lạc, hệ sợi và bào tử chủng CF1 trên môi trường Czapeck 49

n Khuẩn lạc A niger CNTP 5037 với thời gian chiếu UV khác nhau 52

Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A niger UV06-12-23 57

Hình 3.4 Ảnh hưởng của độ dày môi trường đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A niger UV06-12-23 57

Hình 3.5 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của

A niger UV06-12-23 58

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A niger UV06-12-23 59

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A niger UV06-12-23 59

Hình 3.8 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu nuôi cấy thu EPG từ A niger UV06-12-23 62

Hình 3.9 Ảnh hưởng của phương pháp thu nhận đến hiệu suất thu hồi EPG 63

Hình 3.10 Sắc ký đồ tinh sạch EPG bằng cột Q-sepharose FF trên hệ thống FPLC 64

Hình 3.11 Kết quả điện di SDS-PAGE protein endopolygalacturonase 65

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ EPG từ A niger UV06-12-23 66

Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của endopolygalacturonase từ A niger UV06-12-23 và A niger CNTP5037 67

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ EPG từ A niger UV06-12-23 67

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của endopolygalacturonase từ A niger UV06-12-23 và A niger CNTP5037 68

Hình 3.16 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ của EPG từ A niger UV06-12-23 69

Hình 3.17 Ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hiệu suất thu pectin chanh leo 72

pH, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ ethanol: dịch lọc 72

Hình 3.18 Sơ đồ quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo 73

Hình 3.19 Pectin vỏ chanh leo tím trước và sau khi chuyển hóa 76

Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hàm lượng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 77

Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hàm lượng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 78

Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 79

Hình 3.23 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 80

Hình 3.24 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hàm lượng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 82

Hình 3.25 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 83

Hình 3.26 Bề mặt đáp ứng của hàm lượng POS 86

Hình 3.27 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để tạo POS và sản phẩm thủy phân giới hạn pectin tạo POS sau khi tối ưu 86

Hình 3.28 Bản sắc ký lớp mỏng dịch thủy phân pectin chanh leo bằng EPG từ A niger UV06-12-23 87

Hình 3.29 Các phân đoạn POS khi lọc gel và TLC sản phẩm khi tinh sạch 90

Hình 3.30 Các dạng chế phẩm POS 94

Hình 3.31 Sơ đồ quy trình thu nhận các loại chế phẩm POS từ pectin vỏ chanh leo 97

Hình 3.32 Một số hình ảnh của quá trình thu nhận POS trên quy mô pilot 99

Hình 3.33 Khả năng tăng sinh của các chủng vi khuẩn có lợi thử nghiệm trong môi trường chứa các loại prebiotic khác nhau 103

Hình 3.34 Điểm hoạt tính các loại prebiotic đối với các chủng vi khuẩn có lợi 104

Hình 3.35 Sắc ký đồ dịch POS khi ủ với enzyme tiêu hóa 105

Hình 3.36 Sắc ký đồ HPAEC dịch thủy phân pectin chanh leo 107

Hình 3.37 Kiểm tra thành phần POS trong bánh quy xốp 110

MỞ ĐẦU

Trong vài thập kỷ qua, do chế độ ăn thiếu dinh dưỡng, hút thuốc lá và uống rượu đã cho thấy sự gia tăng đáng báo động về tỷ lệ bị bệnh tật và tử vong của con người Số lượng người bị mắc các căn bệnh như: bệnh béo phì mãn tính, rối loạn tiêu hóa, bệnh tiểu đường, bệnh mạch vành, ung thư và các bệnh do sự thoái hóa dần tăng lên Do vậy, xu hướng dùng thực phẩm chức năng không chỉ để cung cấp dinh dưỡng thiết yếu mà đồng thời phòng chống bệnh tật được tăng cường Điều này đã thúc đẩy mạnh nhu cầu sử dụng prebiotic và nghiên cứu sản xuất các thế hệ prebiotic mới

Pectic oligosaccharide (POS) là một trong những prebiotic thế hệ mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây POS là một hợp chất carbohydrate, bao gồm từ 2 – 10 đơn phân D - galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α (1 – 4) glucoside và có nhiều đặc

tính quý

Là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên POS mang tính acid tương tự như một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại oligosaccharide trung tính Bên cạnh đó, POS được lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi trong đường ruột và sản phẩm của sự lên men này có ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe của vật chủ, tham gia vào quá trình điều hòa trao đổi lipid, glucose, làm giảm lượng glycemic và mức cholesterol trong máu, chống ung thư, điều biến miễn dịch, chống béo phì, có tính kháng khuẩn và chống oxi hóa… Với các hoạt tính sinh học có lợi như vậy,

POS được ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức năng và thức ăn chăn nuôi

Hiện nay POS được tạo ra bởi một số phương pháp như: tổng hợp hóa học, phân cắt pectin bằng chiếu xạ và sử dụng enzyme thủy phân Trong đó, phương pháp sử dụng enzyme thủy phân được coi là có hiệu quả tốt nhất do điều kiện phản ứng enzyme ở nhiệt

độ thấp, thân thiện với môi trường và cường lực xúc tác của enzyme mạnh

Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) là enzyme thuộc họ pectinase, có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm Enzyme này xúc tác thủy phân liên kết α-(1, 4) – D – galacturonic trong phân tử pectin để tạo thành pectic oligosaccharide (POS)

và acid galacturonic Bên cạnh đó, Việt Nam là nước nông nghiệp, có các nguồn nguyên liệu dồi dào từ phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin: vỏ cam, chanh, bưởi, chanh leo Vỏ quả chanh leo chiếm khoảng 60% trọng lượng quả và chứa 2 – 3% pectin, là một nguồn phụ

phẩm đáng kể để thu nhận pectin Việc chuyển hóa nguồn pectin chanh leo thành POS sẽ góp phần gia tăng thêm giá trị của nguồn nông sản này và làm phong phú thêm một nguồn prebiotic mới cho Việt Nam

Tuy nhiên cho tới nay, chưa có công trình nào trong nước công bố về công nghệ thủy phân pectin tạo POS bằng enzyme Từ những mối quan tâm trên, chúng tôi tiến hành

thực hiện luận án: “Ng iên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase”

 Mục tiêu nghiên cứu

- Thu nhận được nguồn endopolygalacturonase

- Xây dựng được quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo bằng phương pháp thủy phân giới hạn nhờ endopolygalacturonase

- Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu được trong sản xuất thực phẩm chức năng

 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án gồm các nội dung chính sau đây:

+ Thu nhận, tinh sạch và xác định đặc tính của enzyme từ chủng cải tạo

2 - Xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo

+ Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ chanh leo

+ Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS

+ Tách, tinh sạch và bảo quản chế phẩm POS

3 - Đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu được trong sản xuất thực phẩm chức năng

+ Đánh giá hoạt tính sinh học

+ Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm

+ Ứng dụng POS trong sản xuất bánh chức năng

 Những đóng góp mới của luận án

1 – Tạo đƣợc chủng Aspergillus niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp

endopolygalacturonase cao góp phần làm phong phú thêm nguồn chủng giống và pectinase

2 - Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo bằng enzyme thu nhận pectic oligosaccharide (POS) và chứng minh đƣợc khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi, giảm vi khuẩn có hại, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS thu đƣợc, góp phần làm phong phú thêm một nguồn prebiotic mới cho Việt Nam

Hiện nay, nhu cầu sử dụng prebiotic tăng dần theo từng năm dẫn tới sự phát triển mạnh mẽ số lượng công ty sản xuất các chế phẩm prebiotics và nghiên cứu sản xuất các thế

hệ prebiotic mới Năm 2006 trên thị trường thế giới chỉ có 160 sản phẩm prebiotic nhưng hiện nay đã có hơn 400 loại từ hơn 20 công ty sản xuất Sản lượng prebiotic trên toàn thế giới đạt 167 triệu tấn năm 2008 [10]

Theo báo cáo của các nhà phân tích, thị trường dành cho prebiotic ở Châu Âu và

Mỹ dự kiến đạt 1,17 tỷ và 225,31 triệu USD tương ứng vào năm 2015 [135] Nhu cầu prebiotic trên toàn thế giới ước đạt 4,5 tỷ USD trong năm 2018 và tốc độ tăng trưởng đạt 11,4% từ năm 2012 đến 2018 [122] Trong khi thị trường châu Âu thúc đẩy ứng dụng prebiotic vào lĩnh vực mới như thịt và các sản phẩm ăn nhẹ, thị trường Mỹ tiếp tục thúc đẩy sản xuất loại prebiotic có nguồn gốc fructans, vì đó là phân khúc sản phẩm lớn nhất trong thị trường prebiotic của Mỹ [135]

Báo cáo của GIA cũng dự đoán nhu cầu prebiotic bổ sung vào thực phẩm và đồ uống dự kiến sẽ đạt 3,7 tỷ USD trong năm 2018 [122] Bổ sung prebiotic vào sữa công thức cho trẻ sơ sinh cũng là một hướng phát triển mạnh Phân tích cho thấy rằng thị trường sữa công thức cho trẻ sơ sinh được dự kiến sẽ tăng trưởng với tốc độ 11,3% từ năm 2012 đến 2018 Các ứng dụng mới nhất của prebiotic trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi đã trở thành một thị trường sinh lợi cao Nhu cầu prebiotic cho các ứng dụng thức ăn chăn nuôi

dự kiến sẽ vượt qua 70.000 tấn vào năm 2018 [122]

Việc nghiên cứu phát hiện, đánh giá và thương mại hóa các sản phẩm mới có những thuộc tính ưu việt như khả năng điều biến hệ vi sinh vật cao, giảm nguy cơ ung thư ruột hiệu quả đang giành được sự quan tâm ngày một tăng của cả giới khoa học lẫn giới doanh nghiệp Xylooligosaccharide (XOS), soya oligosaccharide (SOS) và Pectic oligosaccharides (POS) là những ví dụ đại diện cho các dòng sản phẩm dạng này

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây đã có một số cơ sở trong nước nghiên cứu và đưa vào sản xuất một số sản phẩm prebiotic Tại Viện Công nghiệp thực phẩm, Trịnh Thị Kim Vân và Nguyễn Hoàng Anh đã thực hiện các đề tài nghiên cứu sản xuất fructooligosaccharide (FOS) bằng enzyme để ứng dụng sản xuất một số thực phẩm chức năng [6] Lê Thị Hồng Ánh (Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh) cũng đã áp dụng kỹ thuật lọc pha loãng với màng lọc DS-5-DL để nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm FOS [4] Nguyễn Thị Vân Anh đã nghiên cứu ứng dụng endoxylanase để sản xuất arabinoxylan từ cám gạo làm thực phẩm chức năng [5] Nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã sử dụng

endo-1,4-β-mannosidase từ Aspergillus niger BK01 để thủy phân bã cơm dừa, thu chế

phẩm đường chức năng Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng [1] Với các đặc tính ưu việt của enzyme tái tổ hợp, cùng hiệu suất biểu hiện cao, quá trình ứng dụng enzyme tái tổ hợp này trong sản xuất chế phẩm MOS cao độ đã được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn nuôi tôm [2]…

Hình 1.1 Số cơ sở sản xuất (A) và số lượng sản phẩm prebiotic ở Việt Nam (B) [3]

Tuy nhiên với nhu cầu trong nước ngày một gia tăng, sản lượng và chủng loại prebiotic không đủ cung cấp cho thị trường [3] Do đó, việc nghiên cứu các sản phẩm mới không chỉ để cung cấp dinh dưỡng thiết yếu mà còn có thể đồng thời phòng chống bệnh tật được khuyến khích và tăng cường

1.1.2 Pectic oligosaccharide (POS) – nguồn prebiotic tiềm năng

1.1.2.1 Cấu tạo

Pectic oligosaccharide là các oligosaccharide có nguồn gốc từ pectin, cấu tạo từ 2 -

10 đơn phân D - Galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside (hình 1.1) [93]

Hình 1.2 Cấu tạo của D - galacturonic acid và một pectic oligosaccharide

POS có phân tử lượng không lớn lắm và chúng có một số tính chất của một acid hữu cơ Chúng dễ tan trong nước và khi thủy phân giải phóng các đơn phân galacturonic acid và oligosaccharide mạch ngắn hơn POS mang điện tích âm, có độ nhớt thấp và ít năng lượng

1.1.2.2 Đặc tính sinh học của POS

Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy POS có tính chất của một prebiotic như: được lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi đường ruột và sản phẩm của sự lên men này có ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe của vật chủ [51]

Theo Olano-Martin E và cộng sự, POS có khả năng kích thích sự tăng sinh của vi

khuẩn Bifidobacterium lactis, B infantis, B pseudolongum, B adolescentis, Lactobacillus

casei shirota, L acidophilus, L casei subsp cremoiris LC5, làm giảm sự phát triển của vi

khuẩn Bacteroides distasonis, B ovatus, B fragilis, Clostridium perfringens, Enterococcus

faecalis và ức chế sự sinh trưởng của Bacteroides thetaiotaomincrom, Clostridium ramosum, C inocuum [92] POS kích thước nhỏ (DP<5) có khả năng tăng sinh số lượng vi

khuẩn có lợi, giảm số lượng vi khuẩn Clostridia [110] POS tạo bởi quá trình thủy phân

pectin bằng endopolygalacturonase có DP 2 – 7 có thể được sử dụng dễ dàng bởi các vi

sinh vật có lợi đường ruột và ức chế E coli [70] Digalacturonic acid và trigalacturonic

acid (POS có DP = 2 và 3) có khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic

Lactobacillus plantarum, ngăn cản sự bám dính của E coli vào tế bào biểu mô ruột người

[58, 111]

Thử nghiệm trên các tình nguyện viên trong giai đoạn đầu nhiễm HIV-1 uống một hỗn hợp của prebiotic oligosaccharides (GOS, FOS, POS) cho thấy có sự thay đổi hệ vi

sinh vật đường ruột như tăng số lượng Bifidobacteria và giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh

Clostridium lituseburense/ Clostridium histolyticum [44]

Ngoài ra, mức độ methyl hóa của pectin đóng một vai trò quan trọng quyết định các tính chất lên men POS POS có mức methyl hóa thấp được lên men bởi vi khuẩn tốt hơn POS có mức methyl hóa cao [33, 93]

POS là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên mang tính acid tương tự như một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại oligosaccharide trung tính, ví dụ digalacturonic acid ngăn ngừa sự bám dính của các tế bào

vi khuẩn E coli trong điều kiện in vitro [51] Đây sẽ là một lợi thế cho dòng sản phẩm này

để tăng cường hiệu quả cho các loại sữa bột trẻ em khi chúng được bổ sung cùng với các prebiotic trung tính thông dụng khác như FOS, GOS, MOS

Thử nghiệm bổ sung 15 – 25% POS vào sữa của trẻ sơ sinh cho thấy POS giúp trẻ tiêu hóa tốt hơn, hệ vi sinh đường ruột thay đổi và hạ thấp pH phân [36, 73] Năm 2010, Westerbeek E.A.M đã thử nghiệm bổ sung hỗn hợp 80% GOS/FOS và 20% POS với hàm lượng 1,5 g/kg/ngày cho 113 trẻ sơ sinh Kết quả cho thấy những trẻ này có khả năng hấp thụ và tiêu hóa tốt hơn, giảm mắc các bệnh do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa hơn nhóm đối chứng [127] Vì vậy, POS có thể sử dụng để bổ sung vào các sản phẩm sữa cũng như các loại sản phẩm thực phẩm khác

Một số nghiên cứu ảnh hưởng của POS in vivo và in vitro khác cũng đã được tiến

hành Kết quả cho thấy POS ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, tăng trưởng của vi khuẩn trong ruột kết, giảm nguy cơ ung thư, điều hòa hệ thống miễn dịch và giảm cholesterol [90, 104]

Olano - Martin E và cộng sự cũng cho thấy rằng POS có vai trò bảo vệ bằng cách

ức chế độc tố Shiga tiết ra bởi E coli O157: H7 [95] Ngoài ra, một số tác dụng chống ung

thư đã được báo cáo POS có khả năng thúc đẩy quá trình apoptosis của các tế bào ung thư tuyến HT-29 [94] Các kiểm tra trên dòng tế bào tủy và các tế bào ung thư tuyến tiền liệt cũng cho thấy tác dụng này [95]

POS làm tăng miễn dịch của cơ thể khi kết hợp với GOS và FOS [124]; bảo vệ cơ thể chống lại bệnh tim mạch, giảm thiệt hại do kim loại nặng, chống béo phì, chống độc, kháng khuẩn và chống oxy hóa [69]

POS mang điện tích âm do đó có thể kết hợp với các oligosaccharide điện tích dương khác như chitosan oligosaccharide để tạo ra sự tương tác tĩnh điện ứng dụng trong sản xuất màng y tế, túi phân hủy sinh học hoặc trong điều trị vết thương [28]…

POS có độ nhớt thấp nên thuận lợi trong việc bổ sung vào thực phẩm, ví dụ như kết cấu của sữa chua có thể được cải thiện Do độ nhớt thấp nên POS cũng có thể được sử dụng như là chất giữ ẩm

Ngoài ra, POS ít ngọt hơn đường saccharose và hàm lượng calo thấp nên có thể được

sử dụng để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cần độ ngọt thấp và ít béo [28]

1.2 Cơ c ất pectin

1.2.1 Cấu tạo

Pectin là một polysaccharide mạch thẳng do các acid galacturonic liên kết với nhau theo liên kết α (1 – 4) glucoside Ngoài ra, trong phân tử pectin có chứa một số các gốc đường khác như L – rhamnose, D – galactose, D – xylose và L – arabinose

Pectin có nguồn gốc từ thực vật, có nhiều trong vỏ quả táo, cam, chanh, quýt, mận, đào và thân, lá cây, (bảng 1.1) Pectin có mặt trong thành tế bào của tất cả các thực vật bậc cao và chiếm khoảng 22 – 35% khối lượng khô của tế bào

Bảng 1.1 Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [27]

Trái cây àm lượng pectin (% trọng lượng tươi)

Cà chua (Lycopersicon esculentum) 0,2 - 0,6

Phân tử lượng của các loại pectin tách từ các nguồn khác nhau thay đổi trong giới hạn rộng Ví dụ từ táo, mận pectin có phân tử lượng từ 25.000 – 35.000 g/mol, từ cam phân

tử lượng đạt tới 50.000 g/mol

Pectin là thành phần vô cùng phức tạp và gồm có ba loại chính: Homogalacturonan (HGA) và Rhamnogalacturonan (RG) I và II Sơ đồ minh họa các cấu trúc của HGA và RG-I được đưa ra trong hình 1.3

Hình 1.3 Cấu tạo của Pectic polysaccharide

Trong đó, homogalacturonan là thành phần chiếm tỷ lệ lớn và có mặt ở nhiều loại thực vật nên được nghiên cứu sâu và rộng hơn các thành phần khác

Homogalacturonan: là chuỗi bao gồm các phân tử D-galacturonic acid (galA) nối

với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside và thường bao gồm 100 – 200 gốc galA (hình 1.4) HGA được tổng hợp trong bộ máy Gongi sau đó được đưa vào thành tế bào, ở đó có khoảng 70 - 80% các gốc galA được methyl este hóa ở cacboxyl C-6 Sự dịch chuyển của các nhóm methyl este bên trong thành tế bào dẫn đến kết quả HGA có khả năng liên kết chéo bởi Ca2+ và hình thành các tập hợp và các gel đại phân tử Các gốc trong HGA có thể O-acetyl hóa chủ yếu ở đầu C-3 nhưng cũng có thể xảy ra ở C-2 Galactose của HGA có thể được thay thế ở vị trí C-3 với các gốc đường xylose tạo thành xylogalacturonan (XGA)

có nhiều ở vỏ hạt đậu, pectin táo, dừa và cà rốt GalA cũng có thể được thay thế bởi apiose

ở vị trí C-2 hoặc C-3 tạo ra apiogalacturonan (trong bèo tấm Lemna minor và Spiodela

polyrhise) Các dạng cấu trúc này có thể làm thay đổi các tính chất chức năng của dạng

HGA

Hình 1.4 Công thức của Homogalacturonan

Rhamnogalacturonan I: cấu tạo từ mạch thẳng là do acid galacturonic và rhamnose

liên kết với nhau: αDGalpA(1 - 2) - αLRHap(1 - 4) với các mạch bên là các phân tử đường trung tính như arabinan, galactan và các phân tử acid galacturonic bị acetyl hóa hoặc methyl este hóa

Rhamnogalacturonan II: là thành phần phức tạp nhất của pectic polysaccharides

RG-II được cấu tạo chuỗi mạch thẳng là sự lặp lại của liên kết α(1 - 4) DGalpA như Homogalacturonan, nhưng mạch bên chứa rất nhiều phân tử đường rhamnose và các phân

tử khác như: apiose, 2-O-methylxylose, 2-O-methylfucose, 2-keto-3-deoxy-mano-octulosonic

Acid polygalacturonic được este hóa từng phần với các gốc methyl và các nhóm acid tự do có thể được trung hòa từng phần hoặc toàn bộ với các ion Na+, K+ hoặc NH4+

Tỷ lệ các nhóm acid galacturonic được este hóa so với tổng số acid galacturonic được gọi là mức độ este hóa, ký hiệu là DE (Degree of esterication) Mức độ este hóa ảnh hưởng lớn đến các tính chất của pectin, đặc biệt là tính hòa tan và khả năng tạo gel

Khả năng este hóa của pectin chia làm 2 nhóm:

- Pectin este methyl hóa cao: (high methyl este - HM) với số gốc acid của pectin được methyl hóa lớn hơn 50%

- Pectin este methyl hóa thấp: (low methyl este - LM) với số gốc acid của pectin được methyl hóa nhỏ hơn 50%

Khả năng este hóa cao nhất có thể đạt được ở các dịch chiết nguyên liệu thô tự nhiên khoảng 75%

Pectin được xem là một trong những phụ gia thực phẩm an toàn và được chấp nhận nhiều nhất [82] Theo số liệu thống kê năm 2003, tổng tiêu thụ pectin trên toàn cầu là khoảng 30.000 tấn/năm với tỉ lệ tăng trưởng 6% Pectin được ứng dụng vào các lĩnh vực như chế biến quả (15 - 20%), sản xuất sữa và sữa chua (15 - 20%), công nghiệp sản xuất bánh kẹo (5%), phụ gia thay thế chất béo (20%) Trong công nghiệp chế biến thực phẩm pectin được sử dụng làm chất tạo gel cho mứt quả, chất ổn định trạng thái huyền phù trong sản xuất đồ uống, Trong dược phẩm, pectin là một loại chất xơ hòa tan trong nước Pectin không cung cấp năng lượng nhưng có nhiều giá trị phòng và chữa bệnh như kéo dài thời gian tiêu hóa thức ăn trong ruột, có tác dụng tăng hấp thu dưỡng chất trong thức ăn, giảm hấp thu lipid, chống táo bón và giảm béo [101]

Mặc dù có nhiều ưu điểm như trên nhưng do pectin có khối lượng phân tử lớn (khoảng 200 kDa, tương đương 800 đơn vị đường đơn) nên thường khó hòa tan, có độ nhớt cao hoặc dễ gây kết tụ trong một số sản phẩm chứa protein và môi trường pH thấp như sản

phẩm sữa chua uống Do vậy, pectin đã được chuyển hóa thành những mảnh phân tử có khối lượng thấp hơn, cải thiện được độ hòa tan, giảm độ nhớt và được bổ sung vào một số thực phẩm như những chất ổn định hoặc sợi thực phẩm (ví dụ các dòng sản phẩm pectin với tên thương mại GRINDSTED®Pectin của hãng Danisco)

1.2.2 Pectin từ vỏ chanh leo

Chanh leo (chanh dây) là cây leo thân gỗ, thuộc họ Passifloraceae và có nguồn gốc

từ Brazil Chanh leo vào Việt Nam có hai giống, phân biệt bằng xuất xứ và màu vỏ Giống chanh leo vỏ vàng có nguồn gốc từ Sirilanca, Urganda và Hawaii có mặt ở Việt Nam với tên gọi là chanh dây hay lạc tiên Giống chanh leo vỏ tím có nguồn gốc từ Australia và Đài

Loan, có tên khoa học là Passiflora edulis, trong đó thịt quả chỉ chiếm 50%, vỏ quả chiếm

50% [102] Trong vỏ quả chanh leo, hàm lượng pectin chiếm khoảng 2 - 3% [27] Chanh leo được trồng nhiều ở các tỉnh phía nam như trên địa bàn tỉnh Đăk Nông diện tích trồng khoảng 2.000 ha, ở Đăk Lăk cũng vào khoảng 300 ha Vài năm gần đây diện tích trồng loại cây này cũng tăng nhanh ở một số tỉnh phía bắc như Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An với năng suất đạt từ 40 - 50 tấn/ha [7] Nhiều cơ sở sản xuất, chế biến loại quả này đã được xây dựng cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước những sản phẩm như nước chanh leo cô đặc, pure lạc tiên hoặc nước lạc tiên, Ví dụ ở Đăk Nông có 8 cơ sở sơ chế, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ khoảng 50 tấn chanh leo tươi/ngày cho hai Công ty cung ứng giống là Chia Meei (Đài Loan) và Trường Hoàng (Lâm Đồng) Do vậy, nguồn vỏ quả thải ra từ quá trình chế biến này là rất lớn và khá tập trung đảm bảo cho việc tận thu nguồn pectin từ nguồn phụ phẩm này phục vụ cho sản xuất pectic oligosaccharide (POS)

Pectin từ chanh leo đã được tách chiết từ rất sớm (năm 1949 với vỏ chanh leo tím

và năm 1953 đối với chanh leo vàng) Phân tích thành phần của vỏ chanh leo vàng và tím cho thấy chúng đều chứa hàm lượng carbohydrate cao và lượng protein thấp [129, 130] Báo cáo năm 2008 của Pinheiro E.R và cộng sự về thành phần vỏ chanh leo (bảng 1.2) hàm lượng chất xơ hòa tan trong vỏ chanh leo chiếm lượng rất lớn 19,2% khối lượng khô,

do đó từ vỏ chanh leo có thể thu được hàm lượng pectin lớn

Bảng 1.2 Thành phần của vỏ chanh leo [102]

1.2.3 Enzyme thủy phân pectin

Enzyme phân cắt pectin hay pectinase là một họ bao gồm các enzyme: pectinesterase, polygalacturonase và transelimilase Trong số đó, pectinesterase và polygalacturonase là những enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng

- Pectinesterase (PE) (EC 3.1.1.11)

Pectinesterase hay còn được gọi với một số tên khác như pectin methylesterase, pectase, pectin methoxylase và pectin demethoxylase, thuộc nhóm enzyme thủy phân Pectinesterase xúc tác quá trình thủy phân liên kết este để tách nhóm methoxyl (OCH3) trong phân tử pectin, giải phóng ra methanol và acid pectic (hình 1.4) Pectinesterase được ứng dụng làm trong nước quả trong sản xuất rượu vang, sâm panh

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của pectinesterase

- Polymethylgalacturonase (PMG):

Enzyme này tác dụng chủ yếu lên các phân tử pectin đã bị methyl hóa 2/3 Các

enzyme này được chia làm hai nhóm nhỏ tùy theo liên kết glycoside bị cắt đứt:

+ Endopolymethylgalacturonase (EC 3.2.1.41): Là enzyme phân cắt liên kết glucoside ở trong mạch của phân tử pectin có mức độ methyl hóa cao (hình 1.6)

1,4-+ Exopolymethylgalacturonase (EC 3.2.1.67): Là enzyme phân cắt liên kết glucoside đầu mạch nằm giữa hai gốc acid galacturonic đã được methyl hóa

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của polymethylgalacturonase

- Polygalacturonase (PG) là các enzyme tác động chủ yếu lên acid pectic (hình 1.7)

Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng

kể Các enzyme polygalacturonase này cũng được chia làm hai nhóm dựa vào vị trí liên kết glycoside bị thủy phân

+ Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15): Là enzyme dịch hóa, chỉ phân cắt liên kết α-1,4 glucoside đứng cạnh nhóm COOH

+ Exopolygalacturonase (EC 3.2.1.82): Enzyme này chỉ có ái lực mạnh đối với liên kết glucoside ở cuối mạch của acid pectinic methoxyl (OCH3)

Hình 1.7 Cơ chế hoạt động của polygalacturonase

1.3 Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15)

1.3.1 Vai trò và nguồn thu

Endopolygalacturonase đã được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm cho sản xuất nước quả, rượu vang, lên men trà, cà phê và sản xuất tinh dầu [24] Endopolygalacturonase cũng được ứng dụng trong ngành công nghiệp khác như công nghiệp dệt, xử lý nước thải, sản xuất thức ăn chăn nuôi Hiện nay, một hướng mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, đó là sử dụng endopolygalacturonase để thủy phân giới

hạn pectin tạo pectic oligosaccharide (POS) - một prebiotic thế hệ mới có rất nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho con người [26]

Endopolygalacturonase (EPG) là enzyme đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau: thực vật, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Đã có nhiều báo cáo được công bố

về sinh tổng hợp cảm ứng enzyme trên đối tượng: Fusarium oxysporum, Aspergillus

japonicus, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Aspergillus awamori, Aspergillus pulverulentus, Penicillium viridicatum, Trichoderma reesei, Sclerotinia sclerotiorum…Tuy nhiên, đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất và sản xuất EPG trên quy

mô công nghiệp vẫn là Aspergillus niger [56, 89]

1.3.2 Các yếu tố ản ưởng đến thu nhận endopolygalacturonase

A niger có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme tác động lên phần

homogalacturonan của phân tử pectin Chúng bao gồm endopolygalacturonase, exopolygalacturonase và pectin acetylesterase [8, 72]

Các nhà khoa học đã xác định được rằng sự tổng hợp endopolygalacturonase thường

xảy ra đồng thời với sự sinh trưởng của A niger Trong khi đó pectinesterase bị chậm lại

do tác dụng ức chế của các sản phẩm thủy phân pectin [74]

Môi trường dinh dưỡng bao gồm: nguồn carbon, nito, phospho… ảnh hưởng rất lớn

đến sự sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và A niger nói riêng Môi trường dinh dưỡng

còn ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme và thành phần enzyme trong chế phẩm Như vậy, lựa chọn môi trường đặc hiệu sẽ đảm bảo sự tổng hợp định hướng enzyme

1.3.2.1 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng và nguồn carbon

Hệ pectinase một mặt là enzyme bản thể, nhưng mặt khác lại là enzyme cảm ứng như các enzyme thủy phân khác [74] Do đó, một trong các yếu tố quan trọng của sự sinh tổng

hợp PG là chọn đúng cơ chất đặc hiệu cho A niger [39]

Pectin được bổ sung vào môi trường sẽ cảm ứng sự tổng hợp EPG Như vậy, sự có mặt pectin trong môi trường dinh dưỡng là điều kiện bắt buộc [8] Cơ chất pectin cảm ứng

có thể dùng bột cà rốt, bột linh lăng, bột táo, cam,… (bảng 1.3)

Chủng A niger được nuôi cấy trên nguồn carbon khác nhau (pectin, tinh bột, inulin,

maltose, galactose ở nồng độ 2%, 4% và 6%) tạo PG cao nhất còn môi trường có monosaccharide và glycerin hoàn toàn không thu được enzyme này [13, 100] Bổ sung glucose vào môi trường có lactose và pectin sẽ gây hiện tượng ức chế sự tổng hợp EPG [74, 100]

Bảng 1.3 Khả năng tổng hợp polygalacturonase trên các nguồn cơ chất khác nhau [37]

(U/g)

Sử dụng hỗn hợp một số polysaccharide và pectin có thể nâng cao hoạt lực EPG ngoại bào gấp 4 - 6 lần so với môi trường không có pectin [39]

Với nguồn carbon là saccharose khi có thừa trong môi trường (>2%) sẽ ức chế sự tổng hợp cảm ứng PG Cũng cần lưu ý rằng tỷ lệ giữa pectin và carbohydrate cũng có ý nghĩa, đặc biệt là các tỷ lệ 1:2, 3:2 và 4:2 thường có tác dụng tốt cho sự sinh trưởng của

A niger cũng như cho quá trình tổng hợp EPG [41]

1.3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ cũng có vai trò rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp EPG bởi vi sinh vật

Nguồn nitơ vô cơ chủ yếu dưới dạng muối nitrate và muối amonium Đối với A niger sử

dụng sulphate amonia là hiệu quả hơn cả Khi sử dụng nguồn nitơ này, dịch canh trường bị acid hóa đến pH 2,5 - 3,0 Ở pH này có sự tích lũy EPG tốt hơn [13]

Tuy nhiên, muối nitrate của kim loại kiềm sẽ ức chế sự tổng hợp EPG Khi sinh trưởng trên môi trường có thêm muối nitrate của kim loại kiềm sẽ làm pH tăng 5,5 - 5,8

nên khả năng tiêu thụ nitơ nitrate của A niger sẽ giảm [87]

Các dạng nitơ hữu cơ (dịch whey, pepton, cám…) phối hợp với nguồn nito vô cơ có tác dụng tốt đến sự tổng hợp EPG [100] Trong môi trường có muối amonium sulphate ảnh

hưởng đến sự tổng hợp EPG của chủng A niger có thể tăng từ 7 - 10% Tỷ lệ tối thích giữa

C và N cho sự tổng hợp enzyme nằm trong giới hạn 7:1 đến 13:1 [87]

1.3.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Các nguyên tố vô cơ có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp EPG bởi A niger mà trước tiên là trạng thái sinh lý của A niger Nói chung hàm lượng phospho trong môi trường phải

không được ít hơn 8 - 10 mg Khi sử dụng nguồn nitơ của phosphate diamonium thì nhu

cầu về phosphor của A niger hoàn toàn được thỏa mãn Môi trường tổng hợp EPG có tỷ lệ

tối ưu giữa nitơ và carbon, pectin và carbohydrate bã củ cải là 3 - 4%, bột ngô 0,5%, (NH4)2HP04 0,7%, MgS04 0,05% [106]

Các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy,… đều có ảnh hưởng đến sự tổng hợp EPG [133]

Sự sinh trưởng cực đại của A niger và sự tổng hợp polygalacturonase diễn ra ở điều

kiện nhiệt độ 30oC, trong 2 - 5 ngày, còn polymethylesterase trong 5 - 7 ngày [81, 133]

1.3.3 Đột biến cải tạo chủng

Để nâng cao khả năng sinh tổng hợp EPG kỹ thuật đột biến bằng hóa chất methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) và tia cực tím (UV) thường được sử dụng

N-Antier P và cộng sự đã tiến hành đột biến A niger bằng UV để thu được pectinase

có kiểu hình kháng deoxyglucose Sử dụng môi trường có nồng độ ethylene glycol khác nhau, độ ẩm thấp, giúp phân lập được các thể đột biến có khả năng sản xuất pectinase trên các môi trường rắn, độ ẩm thấp, như vỏ cà phê [14] Loera O và Viniegra - González sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh đánh giá sự phát triển của sợi nấm để thu được các thể đột biến liên quan đến tốc độ tăng trưởng và khả năng tổng hợp pectinase Họ nhận thấy

một số thể A niger đột biến qua sinh sản hữu tính có khả năng sinh tổng hợp pectinase

tăng gấp đôi so với các chủng gốc [71] Vì vậy, chọn lọc các thể đột biến kháng deoxyglucose và tái tổ hợp qua sinh sản hữu tính, cùng với phân tích hình ảnh các khuẩn lạc là một phương pháp hiệu quả để tăng cường khả năng sản xuất pectinase

Nghiên cứu đột biến A niger có khả năng sản xuất pectinase cao và sử dụng hiệu

quả phế phẩm nông nghiệp là hướng nghiên cứu được rất nhiều nhà khoa học quan tâm

Uzoma O.A và cộng sự đã tiến hành đột biến chủng A niger bằng UV và chọn lọc trên

môi trường chứa 2 deoxy D glucose đã thu được chủng có khả năng tổng hợp pectinase cao nhất trong môi trường cám lúa mì (348,54 IU/mg protein) Chủng đột biến này có khả năng sản xuất pectinase cao hơn chủng gốc trong cả phương thức lên men rắn (SSF) và chìm (SMF) tương ứng 465% và 230% [123]

Cải thiện di truyền để nâng cao khả năng sản xuất pectinase bằng các kỹ thuật đột biến và dung hợp tế bào trần cũng đã được thực hiện thành công Cao J.W và cộng sự đã dùng giá trị P/C (tỷ lệ đường kính của vòng thủy phân (P) với đường kính của khuẩn lạc (C)) trên đĩa pettri để xác định các thể đột biến siêu tổng hợp pectinase Tác giả đã sử dụng

rifampin để cô lập các đột biến tự phát của Bacillus sp NTT33 và thu được hai thể đột biến

có khả năng tổng hợp polygalacturonase cao hơn chủng tự nhiên 82,4% [23]

Hadj – Taieb N và cộng sự thực hiện đột biến Penicillium occitanis bằng acid nitơ,

thu được chủng có khả năng sản xuất endo và exo polygalacturonase cao hơn 15 lần [45] Cũng trên chủng này Jain S và cộng sự đã tiến hành đột biến với N-methyl- N - nitro -N- nitrosoguanidine (NTG), ethyl methane sulphonate và UV đã thu được các chủng có khả năng tổng hợp cellulase và pectinase cao hơn chủng gốc [55]

Dung hợp tế bào trần cũng được sử dụng để tạo chủng lai có khả năng tăng cường sản xuất polygalacturonase Một dạng lai thu được sau khi dung hợp tế bào đột biến

Aspergillus sp CH- Y - 1043 và A flavipes ATCC 16.795 có khả năng sản xuất

endopolygalacturonase cao hơn 1,5 lần, trong khi khả năng sản xuất exopolygalacturonase

chỉ tương tự như chủng gốc Aspergillus sp [105] Thể dung hợp của A niger và A

carbonarius cũng có khả năng sản xuất pectinase cao hơn 6 lần và phát triển tốt trên môi

trường lên men rắn với cám lúa mì là nguồn dinh dưỡng duy nhất [100]

Cải biến chủng A niger bằng UV để nâng cao khả năng sinh tổng hợp EPG trải qua

3 giai đoạn: gây đột biến ngẫu nhiên bằng UV, tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp EPG cao và đánh giá sự ổn định của chủng đột biến qua các lần cấy truyền

Hiệu quả của gây đột biến ngẫu nhiên bằng UV phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nồng

độ bào tử, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu, khoảng cách từ nguồn tới đĩa đặt bào tử…

Để tăng hiệu quả người ta có thể chiếu UV nhiều lần (đột biến nhiều vòng) hoặc kết hợp với hóa chất gây đột biến Monlina S.M.G và cộng sự đã đột biến bằng UV 3 lần đối với

Penicillium chrysogenum IFO 4626 để tạo ra chủng đột biến có khả năng tổng hợp

pectinase tăng 9 lần so với chủng gốc [86]

Đánh giá sự ổn định của đột biến là công việc đòi hỏi thời gian dài và cần phải nuôi cấy nhiều lần để chứng minh sự bền vững của đột biến qua các lần cấy truyền Akbar S và

cộng sự đã tạo chủng đột biến A carbonarius E8 có khả năng tổng hợp pectinase cao gấp

1,8 lần so với chủng gốc và ổn định qua 3 lần cấy truyền [12] Sangkharak K và cộng sự

khẳng định sự ổn định về sinh tổng hợp cellulase của chủng đột biến Cellulomonas sp

TSU-03 qua 12 lần cấy truyền [114]

1.3.4 Tách và tinh sạch enzyme

1.3.4.1 Thu chế phẩm endopolygalacturonase thô

Sau khi nuôi cấy, dịch enzyme được chiết khỏi môi trường rắn bằng đệm theo các

tỷ lệ, pH và thời gian khác nhau Buga M.L và cộng sự chiết enzyme từ môi trường rắn

A niger SA6 bằng đệm acetate 0,05M pH 5,0 với tỷ lệ chiết đệm: môi trường nuôi là 8: 1,

trong 20 phút rồi lọc qua vải và giấy lọc Whatman No1 Tiếp đó, ly tâm dịch ở 5000 vòng/phút trong 30 phút và bảo quản ở 4oC [18]

Soroor M.A.M và cộng sự chiết polygalacturonase từ 5g môi trường rắn

Trichoderma reesei F418 bằng 10ml đệm acetate 0,05M pH 5,0 trong 15 phút rồi lọc lấy

dịch Quá trình trên được lặp lại 3 lần sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút [118]

1.3.4.2 Các phương pháp kết tủa và lọc

Hiện nay, kết tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 được sử dụng cho hầu hết các loại enzyme như pectinase, protease, lactase, amylase… [74] Deshmukh N và cộng sự kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 để thu nhận enzyme từ canh trường A niger, A flavus, A oryze ở

90% độ bão hòa Kết quả cho thấy có thể thu nhận polygalacturonase với độ tinh sạch khác nhau từ cùng một hoạt độ riêng của enzyme [31]

Trong khi đó polygalacturonase từ A niger SA6 được tinh sạch ở nồng độ

ammonium sulfate bão hòa 40 – 80% Kết quả nghiên cứu của Buga M L và cộng sự cho thấy polygalacturonase kết tủa tốt nhất ở nồng độ 70% ammonium sulfate [18]

Như vậy, để thu nhận enzyme từ các nguồn vi sinh vật khác nhau cần phải tiến hành nghiên cứu khả năng thu hồi enzyme trên các nồng độ muối ammonium sulfate sử dụng để kết tủa

Trong nhóm các phương pháp siêu lọc sử dụng cho enzyme, lọc tiếp tuyến (lọc dòng ngang, lọc cut-off) là phương pháp thường được ứng dụng cho

endopolygalacturonase Trải qua quá trình lọc, dung dịch enzyme vừa được cô đặc vừa loại

bỏ bớt các thành phần không mong muốn

Gadre R.V và cộng sự thu nhận EPG từ canh trường nấm Mucor flavus sau đó lọc

cut-off với màng 10 kDa Sau khi lọc, từ 3,2 lít dịch thô có hoạt độ 1120 U cô đặc được thành 400 ml enzyme có hoạt độ 1086 U Như vậy lọc cut-off thu hồi được 97% EPG [40]

Do enzyme được tổng hợp từ A niger SA6 có khối lượng 35 – 40 kDa nên dịch

enzyme thô từ canh trường cũng được Buga M L và cộng sự lọc qua màng siêu lọc cellulose acetate 10 kDa để loại bỏ các protein, amino acid có khối lượng phân tử thấp [18]

1.3.4.3 Tinh sạch endopolygalacturonase

Enzyme sau khi tổng hợp trong môi trường nuôi cấy được thu hồi và tinh chế theo nhiều phương pháp với độ tinh sạch khác nhau như:

Gadre R.V và cộng sự thu nhận EPG từ nấm Mucor flavus và tinh sạch bằng sắc ký

trao đổi ion CM-Sepharose CL 6B [40]

Endopolygalacturonase từ canh trường lỏng được lọc cut-off màng 10 kDa để cô đặc dịch và ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 10o

C Tiếp theo dịch enzyme được điều chỉnh bằng HCl 3M tới pH 5,0 và bơm mẫu lên cột CM Sepharose CL 6B (21 cm) với tốc độ 4 ml/phút Cột được cân bằng trong đệm natri acetate (pH 5) và rửa giải bằng đệm natri acetate (pH 5) trong gradient NaCl 100 - 300 mM với tốc độ 3 ml/phút Theo phương pháp trên 85% protein tạp đã được loại bỏ [40]

Nhằm nghiên cứu phương pháp tinh sạch dịch endopolygalacturonase từ A niger SA6, Buga M L và cộng sự đã tiến hành thu nhận enzyme thô từ canh trường rắn sau 3

ngày nuôi cấy ở 30oC bằng đệm acetate 0,05 M (pH 5) sau đó lọc qua giấy lọc Whatman

No 1 và ly tâm dịch ở 5000 vòng/phút trong 30 phút Tiếp theo, siêu lọc bằng màng 10 kDa, kết tủa bằng muối ammonium sulphate bão hòa 40 – 80%, sắc ký trao đổi ion qua cột DEAE Sepharose và sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-75 Kết quả cho thấy sau khi lọc gel endopolygalacturonase được tinh sạch 9 lần [18]

Saeed A và cộng sự thu polygalacturonase từ nấm mốc Macrophomina phaseolina nuôi cấy trên môi trường chứa polygalacturonic acid Dịch enzyme thô sau khi kết tủa bởi muối ammonium sulfate 85% (w/v) sau đó được tiếp tục tinh sạch bằng cách phân đoạn qua sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose 2 lần thu được enzyme ở phân đoạn 56 có khối lượng 60 kDa [113]

Endopolygalacturonase thô thu từ Wickerhamomyces anomalus được tinh sạch trực

tiếp bằng sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel Enzyme sau khi qua các cột sắc ký này có hiệu suất thu hồi lần lượt là 21% và 56% với độ tinh sạch 1,3 lần [80]

Endopolygalacturonase cũng được nghiên cứu tổng hợp trên nấm Alternaria

cepulae Sau 2 bước tinh sạch: kết tủa muối ammonium sulphate và sắc ký trao đổi ion

DEAE cellulose, Brindha S và cộng sự thu được 2 loại EPG I, EPG II ở các phân đoạn với

độ tinh sạch lần lượt là 245,18 và 270,93 lần [17]

1.3.5 Đặc tính xúc tác

Endopolygalacturonase có đặc tính khác nhau về khối lượng phân tử, điểm đẳng điện

pI, nhiệt độ phản ứng tối ưu và pH tối ưu tùy thuộc vào nguồn gốc thu enzyme Tuy nhiên, nhiệt độ phản ứng enzyme tối ưu nằm trong khoảng 40 - 50oC và pH nằm trong vùng acid yếu (bảng 1.4)

Bảng 1.4 Đặc tính của endopolygalacturonase [27]

EPG

Phân tử lượng (kDa) pI

Hình 1.8 Cơ chất và sản phẩm phân cắt của endopolygalacturonase

Cơ chế tác dụng của endopolygalacturonase trên cơ chất pectin đã được nghiên cứu

và chứng minh [40]

1.4 Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS)

Pectic oligosaccharide là một prebiotic có nguồn gốc từ pectin Hiện nay có một số phương pháp sản xuất POS bao gồm: tách chiết từ thực vật [34], tổng hợp và phân cắt pectin tạo POS [25]

Việc chuyển hóa nguồn cơ chất pectin bởi các chủng vi sinh vật hoặc các chế phẩm pectinase hiện đang được coi là những quá trình sinh học có nhiều hứa hẹn bởi chúng cho phép thu được những oligosaccharide mong muốn và không tạo sản phẩm phụ

Bên cạnh đó, enzyme hoạt động trong điều kiện êm dịu, thân thiện với môi trường, cường lực xúc tác của enzyme mạnh,… nên thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme là phương pháp đơn giản, hiệu quả và khắc phục được nhược điểm của phương pháp vật lý và hóa học Cơ chất pectin có thể được chuyển hóa thành POS nhờ endopolygalacturonase [15,

26, 29, 75, 78, 91, 92]

Quy trình chung để sản xuất POS theo phương pháp thủy phân giới hạn như hình 1.9 Với mỗi công đoạn đều phải khảo sát, lựa chọn các thông số kỹ thuật phù hợp đảm bảo hiệu quả cao và đạt chất lượng như mong muốn

endopolygalacturonase

Hình 1.9 Sơ đồ qui trình chung sản xuất POS bằng pectinase Nguyên liệu đầu: Mục đích của quá trình xử lí hoặc loại bỏ các đường tan có trong

nguyên liệu hoặc khử gốc methyl nhằm làm tăng tốc độ phản ứng của quá trình thủy phân tiếp theo hay cải thiện thuộc tính sinh học cho sản phẩm Nguồn enzyme cũng được lựa chọn theo các tiêu chí như tính đặc hiệu, điều kiện hoạt động, giá cả…

Thủy phân giới hạn pectin: công đoạn này đóng vai trò quyết định hiệu suất quá

trình và chất lượng sản phẩm hơn cả, chúng phụ thuộc vào các điều kiện thủy phân như nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng, tỷ lệ enzyme/cơ chất, nồng độ cơ chất, vận tốc khuấy hay

sự phối trộn các loại enzyme thủy phân cơ chất [22]

Cô đặc, tinh sạch và hoàn thiện sản phẩm: là những công đoạn thông thường cho

hầu hết các qui trình sản xuất các dạng sản phẩm oligosaccharide [15, 25, 66]

Thủy phân giới hạn

(Nồng độ pectin, enzyme, pH, to, thời gian)

1.4.1 Các yếu tố ản ưởng tới quá trình thủy phân

Cho tới nay, đã có khá nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố về các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS

Sabajanes M.M và cộng sự dưới các điều kiện lựa chọn (37oC, pH 5) thủy phân

pectin từ vỏ cam sau 20 giờ thu được 13 kg POS/100 kg nguyên liệu (hiệu suất 13%) [112]

Nhóm nghiên cứu của Concha J và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu chiết rút

pectin từ bã củ cải đường để sản xuất POS [29]

Nikolic M.V và cộng sự thủy phân pectin táo ở điều kiện (1% pectin, enzyme 162 U/l, pH 4,5, 50oC) sau 12 giờ đạt hiệu suất thủy phân khoảng 29% với dạng trimer chiếm 28,4% Trong đó giá trị pH tối ưu của polygalacturonase được sử dụng là 4,5 nằm trong khoảng pH tối ưu đã khảo sát là 3,8 – 5,0, nhiệt độ tối ưu là 40oC trong khoảng nhiệt độ tối

ưu đã khảo sát là 20 - 60o

C [91]

Trên nguồn cơ chất pectin củ cải đường Martinez M và cộng sự đã thí nghiệm trên

mô hình tối ưu cho thấy sử dụng hỗn hợp polygalacturonase 10 U/g pectin, cellulase 0,725

U/g trong 12,8 giờ từ 100 kg pectin thu được 26,7 kg oligosaccharide [78, 79]

Trong sáng chế châu Âu số EP 0 868 854 A2 các nhà nghiên cứu đã thủy phân dịch pectin 3% lần lượt với 3 loại enzyme: polygalacturonase, polygalacturonate lyase và pectinesterase thu được hỗn hợp các pectic oligosaccharide với mức độ trùng hợp nằm

trong khoảng từ 2 đến 10 đạt hiệu suất gần 67% [22]

Combo A.M.M và cộng sự đã tiến hành thủy phân 0,2% polygalacturonic acid bằng endopolygalacturonase trong 2 giờ ở 40oC tại pH 5,5, thu được các oligosaccharide

có hàm lượng DP 3> DP 2> DP 1 lần lượt là 58%, 18% và 13% Tác giả cũng đã tiến hành thử nghiệm với sáu loại enzyme thương phẩm (Endopolygalacturonase M2, Pectinase, Viscozyme L, Pectinex Ultra SP-L, Pectinase 62L và Macer8 FJ) để thủy phân pectin tạo POS Kết quả phân tích dịch thủy phân bằng sắc kí trao đổi anion với detector điện hóa (HPEAC-PAD) cho thấy cả sáu chế phẩm đều tạo ra các oligogalacturonic với các mức độ trùng hợp khác nhau và endopolygalacturonase M2 cho hiệu suất tạo POS cao nhất 76% [26]

Các mảnh oligogalacturonic có DP<7 thu được nhờ endopolygalacturonase thủy phân pectin cam, chanh Quá trình thủy phân thu POS cũng được thực hiện trên các nguồn

cơ chất: pectin cam, nhân sâm, táo, củ cải đường, quả sơn trà [54, 69, 76, 79, 131] Hiệu suất chuyển hóa thành POS từ HM pectin và LM pectin bằng endopolygalacturonase đạt 95% nhờ quá trình thủy phân liên tục [93]

Sử dụng hỗn hợp nhiều loại enzyme tác động tương hỗ nhau để bẻ gãy và thay đổi cấu hình của cơ chất pectin tạo POS là xu hướng mới hiện nay

Nikolic M.V và cộng sự tiến hành thủy phân 1% (w/v) pectin táo (DP 134, DE 95%)

bằng hỗn hợp polygalacturonase (162 U/l) và pectinase (27 U/l) từ A niger ở 40oC, pH 4,5 trong 12 giờ thu được hỗn hợp các oligogalacturonic DP<8 với hàm lượng DP3 chiếm 29,1% Nếu tăng thời gian thủy phân lên 24 giờ lượng DP3 chiếm 34,1% [91]

Từ pectin oliu (chiết từ khô dầu oliu) kết hợp cả 3 loại enzyme pectinesterase, polygalacturonase và pectin lyase thủy phân ở 40oC trong 72 giờ thu được POS <3000 Da [66]

Thành phần và tỷ lệ các oligosaccharide trong sản phẩm cũng khác nhau theo tỷ lệ enzyme trong chế phẩm và thời gian phản ứng Chế phẩm endopolygalacturonase của Megazyme cho sản phẩm thủy phân sau 2 giờ chủ yếu là các digalacturonic 18% (Wt) và trigalacturonic 58% (Wt), còn Pectinase 62L sau 1 giờ thủy phân cho lượng mono galacturonic cao nhất 47% (Wt) [26]

Khi sử dụng hỗn hợp cả 4 loại enzyme (pectin-methyl esterase, endopolygalacturonase, endoarabinase và endogalactase) thủy phân pectin thu được các oligogalacturonic có DP lên đến 18 [107, 108]

Các nghiên cứu trên cho kết quả thủy phân khác nhau là do sự khác nhau về: nguồn gốc của cơ chất, mức độ methyl hóa của cơ chất, enzyme thủy phân giới hạn, tỷ lệ enzyme/

cơ chất, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ và tốc độ khuấy

1.4.2 Tách, tinh sạch

Trong thành phần dịch sau khi thủy phân pectin bằng enzyme có thể chứa một số tạp chất cần được loại bỏ trước khi được sử dụng làm thực phẩm chức năng Các phương pháp chính được sử dụng bao gồm: phương pháp kết tủa, lọc màng và các phương pháp sắc ký POS sau khi tách và tinh sạch được tạo chế phẩm dạng bột bằng các phương pháp sấy để bảo quản lâu dài và thương mại hóa

 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Việc bổ sung các dung môi hữu cơ vào các dung dịch làm giảm khả năng hòa tan của hợp chất có hoạt tính sinh học do làm giảm hằng số điện môi của môi trường Các dung môi hữu cơ thường dùng bao gồm ethanol, acetone và iso propanol Trong số đó, ethanol là dung môi thông dụng nhất và thường được sử dụng để kết tủa POS Onumpai C

và cộng sự đã sử dụng ethanol với nồng độ cuối 64% kết tủa POS ở 4oC trong 18 giờ để nghiên cứu khả năng sử dụng POS của vi khuẩn đường ruột [96] Dịch POS thu từ bã ép

quả oliu được Lama-munoz A và cộng sự kết tủa phân đoạn bằng ethanol 20%, 40%, 60%, 80% và 90% Kết quả cho thấy kết tủa bằng ethanol > 80% thu được POS có kích thước 0,3 – 1 kDa [66]

Chen J và cộng sự sử dụng màng 5 kDa để lọc cut-off dịch POS thu từ pectin táo [25] Trong khi đó, A Lama-Munoz và cộng sự sử dụng nhiều loại màng kích thước khác nhau: 10 kDa, 5 kDa, 3 kDa và 1 kDa để thu nhận POS từ LM – pectin oliu Kết quả nghiên cứu cho thấy POS chủ yếu nằm ở phân đoạn 1 – 3 kDa và chiếm 23% đường tổng

Lọc nano là một phương pháp có nhiều tiềm năng trong tinh sạch và cô đặc POS ở quy mô công nghiệp Màng kích thước nano có giới hạn khối lượng phân tử (MWCO) trong khoảng 200 – 1000Da Đường kính lỗ của hầu hết các màng kích thước nano trong khoảng 0,6 – 2,0 nm, trung bình 0,8 – 0,9 nm Đường kính của monosaccharides là 0,6 – 0,8 nm Bên cạnh đó, màng nano có thể tách riêng ion đơn (monovalent ions) ra khỏi hỗn hợp chất đa ion (multivalent ions) Vì vậy, màng kích thước nano có thể phân riêng monogalacturonic ra khỏi digalacturonic và oligogalacturonic

Manderson K và cộng sự tiến hành lọc dịch POS (sản xuất từ pectin vỏ cam) bằng màng lọc nano DS-5-DL để loại muối và monosaccharide Sau đó POS sau lọc được sử dụng để nghiên cứu hoạt tính prebiotic trên các vi khuẩn đường ruột [77]

Như vậy, lọc nano có thể là một phương pháp tiềm năng để tinh sạch và cô đặc POS ở quy mô công nghiệp

Sấy phun đã đƣợc áp dụng trong sản xuất POS Trong sáng chế của Canada số CA

2 428 473 các nhà nghiên cứu đã thủy phân dịch pectin tạo POS có DP 2 - 10 chiếm 93%, DP>10 chiếm 4% sau đó sấy phun tạo chế phẩm có hàm ẩm 4,4% [22]

1.5 Các p ƣơng p áp đán giá pectic oligosacc aride (POS)

pectin từ quả sơn trà bằng endopolygalacturonase đƣợc tách từ A niger Các tác giả đã sử

dụng hệ dung môi n-butanol: acetic acid: H2O với tỷ lệ 4: 6: 3 (v/v/v), hiện màu ở 100oC bằng dung dịch acid sulfuric có 99,5% ethanol với tỷ lệ 1:1 [67]

Trong khi đó, Nikolic M.V và Mojovic L sử dụng hệ dung môi ethyl acetate: acetic acid: H2O tỷ lệ 4:2:3 (v/v/v), hiện màu bằng dung dịch amonium 10% trong bromophenol blue khi nghiên cứu quá trình thủy phân pectin táo bằng polygalacturonase từ

Hình 1.10 Bản sắc ký TLC của dịch thủy phân polygalacturonic acid của

endopolygalacturonase từ A kawachii [35]

1: mono galacturonic acid; 2, 10: hỗn hợp monogalacturonic, trigalacturonic acid và

polygalacturonic acid; 3 – 9: dịch thủy phân polygalacturonic acid với hiệu suất 0; 0,9; 3; 6; 13; 28; 45%

1.5.2 P ân tíc địn lượng

Hiện nay, có một số phương pháp khác nhau để định lượng POS, chủ yếu gồm phương pháp HPLC và phương pháp so màu

 Phương pháp HPLC

Dịch POS sau khi thủy phân pectin là một hỗn hợp gồm nhiều thành phần với DP 2

- 10 nên để định lượng POS cần thiết phải tách riêng sau đó định lượng từng thành phần riêng rẽ Các phương pháp phân tách thường được sử dụng gồm phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion

Bằng cột chứa gel Superdex Peptide HR 10/30 (30x1cm) của Pharmacia Biotech, Thụy Điển, từ dịch thủy phân pectin bã oliu Lama-Munoz A và cộng sự phân tách monosaccharide ra khỏi POS và thu được POS với nồng độ 10 mg/ml [66]

Laere V và cộng sự đã sử dụng Bio-Gel P2 cho việc tách POS với DP 5 – 9 [65] Trong khi Yu L và cộng sự đã phân tách được 5 phân đoạn POS khi cho dịch thủy phân lần lượt qua ba cột Sephadex G-25, Sephadex G-75 và Sepharose CL-6B [131]

Olano-Martin E và cộng sự đã sử dụng cột TSK G6000 PWXL nối tiếp với cột TSK G4000 PW để phân tách và xác định được khối lượng phân tử của POS sản xuất từ HM pectin và LM pectin [93]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10