NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG đẠM THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) đỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG đẠM THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) đỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT

BỘ G I Á O DỤC VÀ đÀO T Ạ O TRƯỜNG đẠI HỌC CẦN T H Ơ KHOA KHOA HỌC - V I ỆN NC&PT CÔNG NGHỆ S I N H H ỌC ee LUẬN VĂN TỐT NG H I Ệ P đẠI H ỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ S I N H H ỌC NG H I ÊN CỨU ỨNG DỤNG đẠM THỦY P H  N TỪ TRÙN QUẾ ( P e r i o nyx e x c a v a t u s ) đỂ NUÔ I CẤY VI S I N H VẬ T C Á N BỘ H Ư Ớ NG D ẪN: S I N H V I ÊN THỰC H I ỆN Ths. PHAN THỊ BÍCH T R  M CN. NGUYỄN THỊ XUÂN DUNG N g uy ễ n Thị Xuân Thanh V i ệ n NC và PT Công Nghệ S i nh Học Lớp Công Nghệ S i nh Học T r ư ờ n g đ ạ i Học Cần Thơ Khóa 31 Cần Thơ, Năm 2009 MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH Ả NH TÓM LƯỢC 1 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 2 PHẦN II: L Ư Ợ C KHẢO TÀI LIỆU .3 I. TRÙN QUẾ .3 1. Vị trí phân loại .3 2. Đặc tính sinh học .3 3. Đặc tính sinh lý 4 4. Công dụng của trùn quế 5 II. VI SINH VẬT 5 1. Dinh dưỡng của vi sinh vật .5 a. Nguồn carbon và năng l ư ợ ng .7 b. Nguồn Nitrogen .7 c. Nguồn khoáng 8 d. Các yếu tố sinh trưởng .8 2. Các yếu tố lý, hóa học ảnh hưởng lên vi sinh v ậ t 10 a. Ảnh hưởng của nhiệt độ .10 b. Ảnh hưởng của oxi .10 c. Ảnh hưởng của ẩm độ 11 d. Ảnh hưởng của ánh sáng 11 e. Ảnh hưởng của pH .11 f. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu .12 3. Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật 13 a. Giai đoạn chậm 13 b. Giai đoạn log 13 c. Giai đoạn quân bình .13 d. Giai đoạn chết 14 4. Cách đo sự tăng trưởng của vi sinh v ậ t .14 a. Đếm trực tiếp .14 b. Phương pháp gián tiếp 14 III. TÌNH HÌNH NGHIÊN C Ứ U TRONG VÀ NGO ÀI NƯỚC NHÓM ENZYME PROTEASE .15 1. Trong nước 15 2. Ngoài nước 16 PHẦN III : PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 I. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 18 1. Nguyên liệu 18 2. Thiết bị và dụng cụ .18 3. Hóa chất 18 II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 1. Chuẩn bị mẫu và xác định thành phần đạm nguyên liệu .19 a. Chuẩn bị m ẫ u .19 b. Xác định thành phần đạm nguyên li ệ u 19 2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật 20 a. Thí nghiệm 1: xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5  20 b. Thí nghiệm 2: theo dõi sự phát trển của vi khuẩn E. Coli DH 5  theo thời gian .20 c. Thí nghiệm 3: xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae .21 d. Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae theo thời gian .22 PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .23 1. Thành phần đạm nguyên liệu 23 2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh v ậ t .23 a. Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5  .23 b. Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5  theo thời gian .24 c. Kết quả xác định lượng đạm amin từ trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae .27 d. Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae theo thời gian .28 3. Hiệu quả kinh tế giữa bột đạm từ trùn quế và bột pepton Hà Lan 31 PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGH Ị .33 I. Kết luận 33 II. Đề nghị .33 TÀI LIỆU THAM KH Ả O PHỤ L Ụ C DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Danh sách bảng Bảng 1: Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn .6 Bảng 2: Nguồn carbon và nguồn năng lượng cần thiết ở một số nhóm vi sinh vật 7 Bảng 3: Một số vitamin và vai trò của chúng trong hoạt động tế bào .9 Bảng 4: Kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton .23 Bảng 5: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E. coli DH 5  24 Bảng 6: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae .28 Bảng 7: Giá thành 1 lít môi trường LB .31 Bảng 8: Giá thành 1 lít môi trường YEB 32 Danh sách hình ảnh Hình 1. Trùn quế .3 Hình 2. Môi trường lỏng trước và sau khi nuôi vi khuẩn E. coli DH 5  16 gi ờ 24 Hình 3. Sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5  trên hai môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thủy phân theo thời gian 25 Hình 4. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5X sau 16 gi ờ .26 Hình 5. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5  sau 24 giờ .26 Hình 6. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5  sau 36 giờ .27 Hình 7. Môi trường trước và sau khi nuôi Saccharomyces cerevisiae 24 giờ 28 Hình 8. Sự tăng trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên 2 môi trư ờ ng đạm pepton và đạm thủy phân trùn quế theo thời gian .29 Hình 9. Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae sau 24giờ 30 Hình 10. Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisia sau 36 gi ờ .30 1 TÓM L ƯỢ C Đề tài được thực hiện nhằm mở ra một hướng ứng dụng mới của sản phẩm tự thủy phân từ trùn quế. Sản phẩm được thử nghiệm thay thế nguồn đạm pepton ở các mức độ 0, 25, 50, 75 và 100% trên hai môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn Escherichia coli DH 5 và môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae. Kết quả cho thấy, với cùng một lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nghiệm thức thay thế hoàn toàn đạm trùn quế 100% đạt kết quả cao nhất trên cả hai chủng vi sinh vật. Đồ thị tăng trưởng theo thời gian trên hai môi trường đạm thủy phân từ trùn quế 100% và đạm pepton Hà Lan 100% tương tự nhau. Ở giai đoạn log, cả hai môi trường LB và YEB dịch đạm trùn quế thủy phân được thay thế 100% sự tăng sinh khối từ bằng đến cao hơn so với nuôi cấy trên môi trường chứa đạm pepton và đạt đến OD 600nm cao nhất sau 18 giờ tăng trưởng. Trên môi trường thạch, với thành phần đầy đủ chất dinh dưỡng trong dịch đạm thủy phân trùn quế cũng đã cho kích thước khuẩn lạc lớn hơn khi nuôi cấy trên môi trường chứa đạm pepton. Giá thành 1 lít môi trường nuôi cấy chứa đạm trùn quế thủy phân giảm một nửa so với dùng đạm pepton Hà Lan. Vì thế việc sử dụng nguồn đạm thủy phân từ trùn quế để thay thế bột pepton mang lại hiệu quả kinh tế đồng thời nâng cao giá trị thương phẩm của loài trùn đất đang được nuôi công nghiệp hiện nay. 2 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong đời sống hàng ngày, từ các ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, nông nghiệp chế tạo phân bón sinh học đến sản xuất các enzyme thông dụng, vacxin phòng bệnh, kháng sinh và các dược phẩm quan trọng. Đặc biệt trong bảo vệ môi trường người ta đã sử dụng vi sinh vật làm sạch môi trường, xử lý các chất thải độc hại. Trong đó nhu cầu về dinh dưỡng cho chúng như các nguồn carbon, nitơ, khoáng chất…là rất cao. Đặc biệt chúng chỉ sử dụng các nguồn thức ăn đơn giản như glucose, đường đôi, acid amin và pepton mạch ngắn để giúp cho sự phát triển và tăng sinh khối tế bào, trong số đó nguồn đạm pepton có giá thành khá cao từ 1.000.000-3.000.000 đồng/1kg. Hiện nay, trùn quế đã được nuôi rất phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và các vùng lân cận Thành phố Hồ Chí Minh. (chiếm - việc tận dụng hệ , 2006). Do vậy, tôm sú (Phạm Thị Quỳnh Trâm, 2008). Nhằm làm phong phú hơn cho sản phẩm tự phân giải từ trùn quế, dịch đạm từ trùn quế do có khá đầy đủ các acid amin cần thiết nên việc sử dụng chúng làm nguồn đạm thay thế pepton trong môi trường nuôi cấy một số chủng vi sinh vật thông dụng là điều có thể. Với lý do đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng nguồn đạm thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus ) để nuôi cấy vi sinh vật” Mục tiêu của đề tài: So sánh hiệu quả sử dụng giữa nguồn đạm thủy phân từ trùn quế với peptone thương mại hiện đang sử dụng trong nuôi cấy các chủng vi khuẩn và nấm men phổ biến. PHẦN II: L ƯỢ C KHÁO TÀI L I Ệ U I. Trùn qu ế 1. Vị trí phân loại Trùn quế thuộc: Ngành: Giun đốt (Annelida). Ngành phụ: Có đai sinh dục (Clillata). Lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta). Họ: Megascolecidae. Tên khoa học: Perionyx excavatus 2. Đặc tính sinh họ c Trùn quế có kích thước tương đối nhỏ, độ dài vào khoảng 10 –15 cm, thân hơi dẹt, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ. Khi di chuyển, các đốt co duỗi kết hợp các lông tơ phía bên dưới các đốt bám vào cơ chất, đẩy cơ thể di chuyển một cách dễ dàng. Hình 1: Trùn qu ế Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu Oxy và thải CO 2 trong môi trường nước, điều này giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều lần, thậm chí trong nhiều tháng. Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm cho việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng ammoniac và urea. Trùn quế nuốt thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa học ghi nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó. Sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều vi sinh vật cộng sinh, phân được thải ra ngoài rất giàu dinh dưỡng (hệ số chuyển hóa ở đây vào khoảng 0,7), những vi sinh vật cộng sinh có ích trong hệ thống tiêu hóa này theo phân ra khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn hoạt động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời gian dài. Đây là một trong những nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường 3. Đặc tính sinh lý Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn. Nhiệt độ thích hợp nhất với Trùn quế nằm trong khoảng từ 20 – 30 o C, ở nhiệt độ khoảng 30 o C và độ ẩm thích hợp, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh. Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt động và có thể chết, hoặc khi nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi hoặc chết. Chúng có thể chết khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng lại có thể tồn tại trong môi trường nước có thổi Oxy. Trùn quế rất thích sống trong môi trường ẩm ướt và có độ pH ổn định, thích hợp nhất vào khỏang 7,0 – 7,5, nhưng chúng có khả năng chịu đựng được phổ pH khá rộng, từ 4 – 9, nếu pH quá thấp, chúng sẽ bỏ đi. Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm…). Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn, giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn. [...]... của vi sinh vật Vì vậy, kết quả này bước đầu rất có ý nghĩa để tính lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các thí nghiệm tiếp theo 2 Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật a Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli DH 5 Tính toán lượng đạm amin dịch thủy phân trùn quế đưa vào chuẩn bị môi trường nuôi cấy. .. trường đạm trùn quế có kích thước từ bằng đến to hơn trên môi trường đạm pepton Từ đó, khẳng định rằng nguồn đạm từ trùn quế hoàn toàn có khả năng thay thế cho đạm pepton để nuôi cấy vi sinh vật với hiệu quả tối ưu Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 9: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae sau 24giờ Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 10: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisia... các thời điểm ở nghiệm thức sử dụng đạm từ trùn quế thủy phân đều cao hơn so với nghiệm thức nuôi cấy trên môi trường đạm pepton Hà lan nhưng độ lệch không rõ như thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn E.Coli DH 5 có thể do môi trường LB sử dụng nguồn đạm khá cao (1% theo w/v) Như vậy, một lần nữa chứng minh nguồn đạm thủy phân từ trùn quế có thể thay thế cho đạm pepton để nuôi cấy nấm men hiệu quả hơn, đồng... chỉ khác nhau ở nguồn đạm pepton và đạm từ trùn quế Sự khác biệt về kích thước tăng trưởng của vi khuẩn trên hai loại đạm pepton và đạm trùn quế được thể hiện rõ trên hình 4, 5 và 6 nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa LB Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 4: Khuẩn lạc vi khuẩn E coli DH 5X sau 16 giờ Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 5: Khuẩn lạc vi khuẩn E coli DH 5... nguồn năng lượng cần thiết ở một số nhóm vi sinh vật Loại vi sinh vật Nguồn carbon cung cấp Nguồn carbon để tổng năng lượng tế bào hợp các cấu tử tế bào Vi sinh vật quang tự Ánh sáng CO2 dưỡng Vi sinh vật quang dị Ánh sáng Hợp chất hữu cơ dưỡng Vi sinh vật hoá tự dưỡng Hợp chất vô cơ, H2, NH3, - CO2 2+ NO2 , Fe , H2S Vi sinh vật hoá dị dưỡng Hợp chất hữu cơ Vi sinh vật hoá dị dưỡng Hợp chất vô cơ, H2,... và ctv (2000) dùng dịch đạm tự thủy phân trùn đất Lumbricus rubellus nuôi cấy vi khuẩn E Coli XL 1-Blue cho sự tăng trưởng vi khuẩn bình thường so với bột pepton đối chứng trên môi trường LB với tỉ lệ bột pepton là 1% (w/v) sau 30 giờ nuôi cấy Như vậy có thể khẳng định dung dịch đạm trùn quế thủy phân 100% hoàn toàn có thể thay thế đạm pepton trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến LB Hình 2... cho sự tăng trưởng, người ta chia vi sinh vật làm 3 loại: - Vi sinh vật không chịu mặn, phát triển ở môi trường không có hay rất ít muối như trường hợp vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas - Vi sinh vật ưa mặn: cần muối để phát triển Vi sinh vật nhóm này có thể chia làm 3 loại: + Vi sinh vật ưa mặn ít: phát triển tốt trong môi trường có nồng độ muối từ 1-6% + Vi sinh vật ưa mặn trung bình: phát triển... pH Các loài vi sinh vật có pH tối hảo riêng để tăng trưởng và phân cắt ở cường độ cao nhất Thông thường vi khuẩn phát triển ở pH từ 5-8 trong khi các loài nấm mốc lại thích hợp ở môi trường acid (pH= 4-5) Người ta chia vi sinh vật làm 3 nhóm căn cứ vào độ pH thích hợp để chúng phát triển + Vi sinh vật ưa acid: phát triển ở pH=1-5,5 + Vi sinh vật trung tính: phát triển ở pH= 5,5-8 + Vi sinh vật ưa kiềm:... đạm amin của trùn quế thay thế đạm amin của pepton thích hợp môi trường nuôi cấy vi khuẩn E Coli DH 5 - Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton trong môi trường LB nuôi cấy chủng vi khuẩn E Coli DH 5 Đây là chủng vi khuẩn được dùng trong công nghệ gen và hiện đang sử dụng tại phòng Công nghệ gen thực vật thuộc Vi n Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường... một hướng ứng dụng mới từ trùn quế Đây là nguồn đạm dồi dào vừa rẻ tiền lại vừa cho hiệu quả cao 0.7 0.6 OD 600nm 0.5 0.4 Pepton Trùn quế thủy phân 0.3 0.2 0.1 0.0 0 5 10 15 20 25 Thời gian tăng trưởng (giờ) 30 Hình 3: Sự tăng trưởng của vi khuẩn E coli DH 5 trên hai môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thủy phân theo thời gian Môi trường thạch đĩa Trong cùng điều kiện nuôi cấy, mật số vi khuẩn, thành