NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG đẠM THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) đỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG đẠM THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) đỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ đÀO TẠOTRƯỜNG đẠI HỌC CẦN THƠKHOA KHOA HỌC -VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ee

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP đẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG đẠM THỦY

PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học Lớp Công Nghệ Sinh Học

Cần Thơ, Năm 2009

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

TÓM LƯỢC 1

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 2

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

I TRÙN QUẾ 3

1 Vị trí phân loại 3

2 Đặc tính sinh học 3

3 Đặc tính sinh lý 4

4 Công dụng của trùn quế 5

II VI SINH VẬT 5

1 Dinh dưỡng của vi sinh vật 5

a Nguồn carbon và năng lượng 7 b Nguồn Nitrogen .7 c Nguồn khoáng .8 d Các yếu tố sinh trưởng 8

2 Các yếu tố lý, hóa học ảnh hưởng lên vi sinh vật 10

a Ảnh hưởng của nhiệt độ 10

b Ảnh hưởng của oxi 10

c Ảnh hưởng của ẩm độ 11

d Ảnh hưởng của ánh sáng 11 e Ảnh hưởng của pH .11 f Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu 12

3 Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật 13

a Giai đoạn chậm 13 b Giai đoạn log 13 c Giai đoạn quân bình .13 d Giai đoạn chết 14

4 Cách đo sự tăng trưởng của vi sinh vật 14

a Đếm trực tiếp 14

b Phương pháp gián tiếp 14

III TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC NHÓM ENZYME PROTEASE 15

1 Trong nước 15

2 Ngoài nước 16

PHẦN III : PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

I PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 18

1 Nguyên liệu 18

2 Thiết bị và dụng cụ 18

3 Hóa chất 18

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

1 Chuẩn bị mẫu và xác định thành phần đạm nguyên liệu 19

a Chuẩn bị mẫu 19

b Xác định thành phần đạm nguyên liệu 19

2 Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật 20

a Thí nghiệm 1: xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli DH 5 20

b Thí nghiệm 2: theo dõi sự phát trển của vi khuẩn E Coli DH 5 theo thời gian 20

c Thí nghiệm 3: xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae 21

d Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae theo thời gian 22

PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

1 Thành phần đạm nguyên liệu 23

2 Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật 23

a Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi

trường nuôi cấy vi khuẩn E coli DH 5 23

b Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E coli DH 5 theo thời gian 24

c Kết quả xác định lượng đạm amin từ trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae 27

d Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae theo thời gian 28

3 Hiệu quả kinh tế giữa bột đạm từ trùn quế và bột pepton Hà Lan 31

PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

I Kết luận 33

II Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

Danh sách bảng

Bảng 1: Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn 6

Bảng 2: Nguồn carbon và nguồn năng lượng cần thiết ở một số nhóm vi sinh vật 7

Bảng 3: Một số vitamin và vai trò của chúng trong hoạt động tế bào 9

Bảng 4: Kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton 23

Bảng 5: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E coli DH 5 24

Bảng 6: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae 28

Bảng 7: Giá thành 1 lít môi trường LB 31

Bảng 8: Giá thành 1 lít môi trường YEB 32

Danh sách hình ảnh Hình 1 Trùn quế 3

Hình 2 Môi trường lỏng trước và sau khi nuôi vi khuẩn E coli DH 5 16 giờ 24

Hình 3 Sự tăng trưởng của vi khuẩn E coli DH 5 trên hai môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thủy phân theo thời gian 25

Hình 4 Khuẩn lạc vi khuẩn E coli DH 5X sau 16 giờ 26

Hình 5 Khuẩn lạc vi khuẩn E coli DH 5 sau 24 giờ 26

Hình 6 Khuẩn lạc vi khuẩn E coli DH 5 sau 36 giờ 27

Hình 7 Môi trường trước và sau khi nuôi Saccharomyces cerevisiae 24 giờ 28

Hình 8 Sự tăng trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên 2 môi trường đạm pepton và đạm thủy phân trùn quế theo thời gian 29

Hình 9 Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae sau 24giờ 30 Hình 10 Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisia sau 36 giờ 30

TÓM LƯỢC

Đề tài được thực hiện nhằm mở ra một hướng ứng dụng mới của sản phẩm tựthủy phân từ trùn quế Sản phẩm được thử nghiệm thay thế nguồn đạm pepton ởcác mức độ 0, 25, 50, 75 và 100% trên hai môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn

Escherichia coli DH 5 và môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae.

Kết quả cho thấy, với cùng một lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôicấy, nghiệm thức thay thế hoàn toàn đạm trùn quế 100% đạt kết quả cao nhất trên

cả hai chủng vi sinh vật Đồ thị tăng trưởng theo thời gian trên hai môi trườngđạm thủy phân từ trùn quế 100% và đạm pepton Hà Lan 100% tương tự nhau Ởgiai đoạn log, cả hai môi trường LB và YEB dịch đạm trùn quế thủy phân đượcthay thế 100% sự tăng sinh khối từ bằng đến cao hơn so với nuôi cấy trên môitrường chứa đạm pepton và đạt đến OD600nm cao nhất sau 18 giờ tăng trưởng.Trên môi trường thạch, với thành phần đầy đủ chất dinh dưỡng trong dịch đạmthủy phân trùn quế cũng đã cho kích thước khuẩn lạc lớn hơn khi nuôi cấy trênmôi trường chứa đạm pepton

Giá thành 1 lít môi trường nuôi cấy chứa đạm trùn quế thủy phân giảm một nửa

so với dùng đạm pepton Hà Lan Vì thế việc sử dụng nguồn đạm thủy phân từtrùn quế để thay thế bột pepton mang lại hiệu quả kinh tế đồng thời nâng cao giátrị thương phẩm của loài trùn đất đang được nuôi công nghiệp hiện nay

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong đời sống hàng ngày, từcác ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, nông nghiệp chế tạo phân bón sinhhọc đến sản xuất các enzyme thông dụng, vacxin phòng bệnh, kháng sinh và cácdược phẩm quan trọng Đặc biệt trong bảo vệ môi trường người ta đã sử dụng visinh vật làm sạch môi trường, xử lý các chất thải độc hại Trong đó nhu cầu vềdinh dưỡng cho chúng như các nguồn carbon, nitơ, khoáng chất…là rất cao Đặcbiệt chúng chỉ sử dụng các nguồn thức ăn đơn giản như glucose, đường đôi, acidamin và pepton mạch ngắn để giúp cho sự phát triển và tăng sinh khối tế bào,trong số đó nguồn đạm pepton có giá thành khá cao từ 1.000.000-3.000.000đồng/1kg

Hiện nay, trùn quế đã được nuôi rất phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông CửuLong và các vùng lân cận Thành phố Hồ Chí Minh

-việc tận dụng hệ

, 2006) Do vậy,

tôm sú (Phạm Thị Quỳnh Trâm, 2008) Nhằm làm phong phú hơn cho sản phẩm

tự phân giải từ trùn quế, dịch đạm từ trùn quế do có khá đầy đủ các acid amin cầnthiết nên việc sử dụng chúng làm nguồn đạm thay thế pepton trong môi trườngnuôi cấy một số chủng vi sinh vật thông dụng là điều có thể

Với lý do đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng nguồn đạm

thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus ) để nuôi cấy vi sinh vật”

Mục tiêu của đề tài: So sánh hiệu quả sử dụng giữa nguồn đạm thủy phân từ trùnquế với peptone thương mại hiện đang sử dụng trong nuôi cấy các chủng vikhuẩn và nấm men phổ biến

PHẦN II: LƯỢC KHÁO TÀI LIỆU

I Trùn quế

1 Vị trí phân loại

Trùn quế thuộc:

Ngành: Giun đốt (Annelida)

Ngành phụ: Có đai sinh dục (Clillata)

Lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta)

cơ chất, đẩy cơ thể di chuyển một cách dễ dàng

Hình 1: Trùn quế

Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu Oxy và thải CO2 trong môitrường nước, điều này giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều lần,thậm chí trong nhiều tháng.

Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm choviệc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng ammoniac và urea Trùn quế nuốtthức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa họcghi nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó Sau khi qua hệ thống tiêuhóa với nhiều vi sinh vật cộng sinh, phân được thải ra ngoài rất giàu dinh dưỡng(hệ số chuyển hóa ở đây vào khoảng 0,7), những vi sinh vật cộng sinh có íchtrong hệ thống tiêu hóa này theo phân ra khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn hoạtđộng ở “màng dinh dưỡng” trong một thời gian dài Đây là một trong nhữngnguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cảitạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường

3 Đặc tính sinh lý

Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độnhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn Nhiệt độ thích hợp nhất với Trùn quếnằm trong khoảng từ 20 – 30oC, ở nhiệt độ khoảng 30oC và độ ẩm thích hợp,chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừnghoạt động và có thể chết, hoặc khi nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đihoặc chết Chúng có thể chết khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúnglại có thể tồn tại trong môi trường nước có thổi Oxy

Trùn quế rất thích sống trong môi trường ẩm ướt và có độ pH ổn định, thích hợpnhất vào khỏang 7,0 – 7,5, nhưng chúng có khả năng chịu đựng được phổ pH khárộng, từ 4 – 9, nếu pH quá thấp, chúng sẽ bỏ đi

Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơnào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm…).Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn,giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn

Trong tự nhiên, Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, hoặc nơi cónhiều chất hữu cơ dễ phân hủy và thối rữa như trong các đống phân động vật, cácđống rác hoai mục Chúng rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơiđây có nhiều chất thải hữu cơ, có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thườngcao, không hấp dẫn và không đảm bảo điều kiện ẩm độ thường xuyên.

(Nguồn: http://Agriviet.com)

4 Công dụng của trùn quế

Trùn quế dễ nuôi, chóng lớn và có tốc độ sinh sản nhanh Hiện nay nuôi trùn quế

đã trở thành ngành chăn nuôi công nghiệp phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi,dược phẩm, mỹ phẩm…

Trùn quế có hàm lượng đạm cao nên được xem là nguồn dinh dưỡng bổ sung quýgiá cho gia súc, gia cầm và thuỷ hải sản

Trùn quế còn là nhà máy xử lý chất thải nông nghiệp và công nghiệp góp phầnbảo vệ môi trường sinh thái Quá trình xử lý chất thải đó đã tạo ra một loại phânhữu cơ vi sinh giàu đạm thích hợp cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cây cảnh

và sản xuất rau sạch Ngày nay người ta còn sử dụng phân trùn để xử lý ao tôm,cá

Trong y học cổ truyền Việt Nam, trùn vẫn được dùng trong một số bài thuốcchữa sốt rét, sốt nóng, suy nhược cơ thể, cao huyết áp, tai biến mạch máu não…Trùn quế còn chứa enzyme có thể thuỷ phân đặc hiệu sỏi fibrin với hoạt tính xúctác rất cao, có triển vọng khai thác để làm thuốc điều trị những căn bệnh đột quỵ,tim mạch Một số nơi còn sử dụng trùn quế làm thực phẩm, mỹ phẩm và thuốctây (Nguồn: www trunque ne t )

II Vi sinh vật

1 Dinh dưỡng của vi sinh vật

Để tăng trưởng, mỗi vi sinh vật phải tìm trong môi trường các chất dinh dưỡngcần thiết cho sự tổng hợp các cấu tử tế bào cũng như nguồn năng lượng để hoạtđộng Các nguyên tố cần thiết chính gồm C, H, O, N, S, P, K, Mg, Fe, Ca, Mn vàcác nguyên tố vi lượng như Zn, Cu, Co, Mo Các nguyên tố này có trong nước,các ion vô cơ, những phân tử nhỏ hay các đại phân tử Nguồn và vai trò của cácnguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn được trình bày trong bảng 1

Bảng 1: Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn.

hữu cơ

Thành phần chính của các hợpchất hữu cơ và nứơc trong tế bàoPhospho 3 Phosphate vô cơ Thành phần cấu tạo acid nhân,

nucleotid, phospholipid, acid teichoic

hợp chất sulfur hữu cơ

Thành phần của Cystein,methionin, glutathion, nhiềucoenzyme

Potassium 1 Muối potassium Cation vô cơ của tế bào và

cofactor của một số enzyme

maggnesium

Cation vô cơ của tế bào vàcofactor của một số enzymekhác

Calcium 0,5 Muối calcium Cation vô cơ của tế bào và

cofactor của một số enzyme và cấu tử của nội bào tử

có sắt và là cofactor cho một số phản ứng có enzyme xúc tác

(Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)

a Nguồn carbon và năng lượng

Vi sinh vật cần nguồn carbon thích hợp để tạo nên các cấu tử của tế bào cũngnhư cung cấp năng lượng cho tế bào Tuỳ theo nguồn carbon sử dụng mà người

ta chia vi sinh vật thành các nhóm như vi sinh vật quang tự dưỡng, quang dịdưỡng, hoá tự dưỡng, hoá dị dưỡng Nguồn carbon cung cấp năng lượng và tổnghợp chất hữu cơ tế bào được trình bày trong bảng 2:

Bảng 2: Nguồn carbon và nguồn năng lượng cần thiết ở một số nhóm vi sinh vật

Loại vi sinh vật Nguồn carbon cung cấp

năng lượng tế bào

Nguồn carbon để tổng hợp các cấu tử tế bào

, Fe2+, H2S

CO2

Vi sinh vật hoá dị dưỡng Hợp chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ

Vi sinh vật hoá dị dưỡng Hợp chất vô cơ, H2, NH3,

NO2

-, Fe2+, H2S

Hợp chất hữu cơ

(Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)

Nguồn carbon hữu cơ cần thiết cho các vi sinh vật hoá dị dưỡng rất đa dạng từcác loại đường đơn như glucose, fructose, sucrose, tinh bột, glycogen, cellulose, vàacid nucleic đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như dầu mỏ, nhựa dẻo (plastic),naphthalen, lipid và protein Tùy theo loài vi sinh vật mà nguồn carbon thích hợp

thay đổi Ví dụ, các loài vi khuẩn Pseudomonas có thể sử dụng đến 90 nguồn

carbon khác nhau, mỗi loài có thể sử dụng một số nguồn carbon khác nhau Cũng

có loài vi khuẩn rất chuyên biệt như vi khuẩn Bacillus fastidiousus chỉ có thể sử

dụng urea làm nguồn carbon và nguồn năng lượng

sinh vật cố định nitơ.Vi sinh vật cần có đủ đạm để tổng hợp các acid amin,protein, acid nhân, lipid, carbohydrate và các coenzyme cho cơ thể.

c Nguồn khoáng

Sulfur: thường được cung cấp từ các sulphate Cần thiết để tế bào tổng hợp acid

amin, vitamin và các carbohydrate

Phospho: thường được cung cấp dưới dạng vô cơ hay hữu cơ Phospho cần thiết

cho các phản ứng tổng hợp acid amin, phospholipid, ATP, coenzyme và protein Ởnồng độ phospho thấp có thể giới hạn sự tăng trưởng của tế bào

Sắt: cần cho chức năng của enzyme, hệ thống cytochrom.

Các nguyên tố khoáng khác như K, Na, Mg, Ca, Mn …cũng rất cần thiết đối với

vi sinh vật, thiếu nó vi sinh vật không thể sinh trưởng phát triển bình thườngđược Các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết cho vi sinh vật như Co, Mo, Cu,Zn…

d Các yếu tố sinh trưởng

Là các chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của một loài vi sinh vật nào đó

mà nếu thiếu thì tế bào không tự tổng hợp được nó Có 3 nhóm yếu tố tăngtrưởng chính là:

+ Acid amin: cần cho sự tổng hợp protein

+ Purin và pyrimidin: cần cho sự tổng hợp acid nhân

+ Vitamin: cần cho hoạt động của các enzyme và coenzyme Các vitamincần thiết cho nhu cầu dinh dưỡng của một số vi sinh vật được trình bày trongbảng 3

Bảng 3: Một số vitamin và vai trò của chúng trong hoạt động tế bào

Biotin (vitamin

H)

Biotin Các phản ứng sinh tổng hợp cần

sự cố định CO2

Acid lipoic Lipoamid Chuyển các nhóm acyl trong sự

oxit hóa các acid ketoAcid mercapto-

ethalsulfonat

Coenzyme M Sản xuất CH4 bởi các vi sinh vật

sinh mêtanAcid nicotinic NAD+ và NADP+ Vận chuyển điện tử trong các

phản ứng khử hydroAcid

pantothenic

Coenzyme A và proteinchuyên chở acyl

Oxit hóa các acid keto và chuyênchở nhóm acyl trong biến dưỡngPyridoxin (B6) Pyridoxal photphat Chuyển amin, khử amin, khử

carboxyl và kết hợp các acid aminRiboflavin (B2) Flavin mononucleotid

(FMN) và flavin adenin dinucleotid (FAD)

naptho-quinon

Vận chuyển điện tử

(Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)

2 Các yếu tố lý, hóa học ảnh hưởng lên vi sinh vật

a Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc không những đối với sự sinh sản của vi sinh vật

mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (do ảnh hưởng đến tốc độ của các phảnứng hóa học và sinh hóa học)

Căn cứ vào nhiệt độ tối ưu của sự phát triển, người ta phân biệt thành các loại vi sinh vật sau:

 Những vi sinh vật ưa ấm trung bình (Mesophiles) ưa thích ở nhiệt độ trung

bình khoảng 20oC - 40oC (tối ưu 30oC – 37oC)

 Những vi sinh vật ưa lạnh (Psychrophiles) có nhiệt độ tối ưu cho sự sinh

trưởng phát triển ở khoảng 10oC, nhưng chúng có thể phát triển ở 0oC,

 Những vi sinh vật ưa mát (Psychrotrophes) rất gần gũi với những vi sinhvật ưa ấm trung bình, chúng có nhiệt độ tối ưu ở khoảng 25oC, nhưng cũng có thểthích nghi ở 0oC

 Các vi sinh vật ưa nhiệt (Thermophiles) sinh sản tốt ở nhiệt độ khoảng 45oC

và 55oC

 Những vi sinh vật ưa (nóng) ở nhiệt độ cao (Thermophiles extremes hay

Hyperthermophiles) có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở khoảng 70 oC hay hơn nữa

b Ảnh hưởng của oxy

Tuỳ theo khả năng sử dụng oxy phân tử mà người ta phân biệt thành các nhóm:+ Các vi sinh vật hiếu khí đòi hỏi oxy tự do để phát triển

+ Các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc chỉ có thể phát triển trong điều kiện không

có oxy không khí (bởi vì chúng không có catalase, superoxyde dismutase, do đó

không có thể loại bỏ được các sản phẩm oxy hóa độc hại cho tế bào như nướcoxy già (H2O2) và các ion superoxyde )

+ Các vi sinh vật hiếu khí, kị khí hoặc kị khí không bắt buộc có thể sinhtrưởng phát triển khi có hoặc không có oxy tự do

+ Các vi sinh vật vi hiếu khí chỉ có thể phát triển trong môi trường có nồng

độ oxy phân tử thấp

Một số nấm men có thể sinh trưởng và phát triển chậm trong môi trường gần như

kị khí, khi đó chúng tiến hành lên men Có vài loài nấm mốc, như Penicilium

requeforti là những cơ thể hiếu khí nhưng có thể chịu sống trong môi trường có

hàm lượng oxy thấp Các vi khuẩn thì gồm nhiều loại, trải ra từ kị khí đến hoàntoàn hiếu khí

c Ảnh hưởng của ẩm độ

Nước chiếm hơn phân nửa trọng lượng tế bào vi sinh vật, vì vậy đa số vi sinh vậtchỉ phát triển được khi môi trường có nước Tuy nhiên, có một số nấm có khảnăng hấp thu nước từ không khí như các loại nấm phát triển trên quần áo haytrong các dụng cụ quang học Các vi sinh vật có kích thước nhỏ, vỏ dày, hình cầuchịu đựng được sự khô khan trong môi trường hơn các vi sinh vật hình que, vỏ

mỏng Ví dụ, loài Treponema palladium hình que có vỏ mỏng gây bệnh lậu thường chết nhanh chóng trong môi trường khô trong khi đó loài Mycobacterium

tuberculosis gây bệnh lao thường sống rất lâu trong môi trường khô.

Một số vi sinh vật khác thành lập các cơ quan đặc biệt như bào tử ở rong, nấm, vikhuẩn hay nang ở nguyên sinh động vật…để chống lại sự khô khan của môitrường Dựa vào các đặc điểm này người ta có thể giữ vật chất lâu dài bằng cáchlàm lạnh thật nhanh mẻ cấy rồi sấy khô trong chân không, khi cần thì đem cấyvào môi trường thích hợp,

e Ảnh hưởng của pH

Các loài vi sinh vật có pH tối hảo riêng để tăng trưởng và phân cắt ở cường độcao nhất Thông thường vi khuẩn phát triển ở pH từ 5-8 trong khi các loài nấmmốc lại thích hợp ở môi trường acid (pH= 4-5) Người ta chia vi sinh vật làm 3nhóm căn cứ vào độ pH thích hợp để chúng phát triển

+ Vi sinh vật ưa acid: phát triển ở pH=1-5,5

+ Vi sinh vật trung tính: phát triển ở pH= 5,5-8

+ Vi sinh vật ưa kiềm: phát triển ở pH =8,5-11,5

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng kháng được điều kiện acid và kiềm của môitrường chung quanh tế bào pH bên ngoài tế bào có thể rất biến động nhưng pHbên trong tế bào thì cố định

Trong việc bảo quản thức ăn, người ta muối thức ăn và cho thêm một ít acid vào.Acid sẽ có tác dụng ngăn cản vi sinh vật phát triển nên thức ăn không bị hỏng.Tuy nhiên, pH thấp chỉ có tác dụng với vi khuẩn mà thôi còn các loại nấm mốcthì không có tác dụng vì chúng thích hợp với môi trường acid

f Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu.

Nồng độ của muối khoáng trong môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tăngtrưởng của vi sinh vật.Thông thường vi sinh vật có thể phát triển ở các nồng độmuối khoáng rất khác nhau Khi nồng độ muối khoáng bên ngoài tế bào cao hơnbên trong tế bào thì nước từ tế bào sẽ thoát ra ngoài môi trường làm tế bào bị colại và ngược lại khi nồng độ muối khoáng trong tế bào cao hơn môi trường, nước

từ môi trường sẽ đi vào tế bào làm tế bào trương to Trong trường hợp này vỏ tếbào sẽ giúp giữ cho tế bào không bị vỡ ra Một số vi khuẩn có thể chịu được

nồng độ muối khoáng cao như trường hợp của Staphylococcus aureus có thể chịu

được nồng độ muối của môi trường bên ngoài tế bào lên đến 3M Có loài nấm

men Saccharomyces có thể chịu được nồng độ đường cao.

Căn cứ trên nhu cầu về muối cần thiết cho sự tăng trưởng, người ta chia vi sinhvật làm 3 loại:

- Vi sinh vật không chịu mặn, phát triển ở môi trường không có hay rất ít muối

như trường hợp vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas

- Vi sinh vật ưa mặn: cần muối để phát triển Vi sinh vật nhóm này có thể chialàm 3 loại:

+ Vi sinh vật ưa mặn ít: phát triển tốt trong môi trường có nồng độ muối

từ 1-6%

+ Vi sinh vật ưa mặn trung bình: phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối từ 6-15%

+ Vi sinh vật rất ưa mặn: phát triển ở môi trường có nồng độ muối rất cao

từ 15-30% như các Halobacterium salanarum

Vi sinh vật phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối trung bình và ở môitrường không có muối thì phát triển tốt nhất Các vi sinh vật này được gọi là vi

sinh vật chịu được mặn, ví dụ vi khuẩn Staphylococcus aureus

Ngoài ra, các nhóm vi sinh vật có thể phát triển được ở môi trường có nồng độđường cao

3 Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật

Vi sinh vật hấp thu thức ăn trong môi trường để tăng trưởng Sự tăng trưởng củamột tế bào vi sinh vật là sự gia tăng khối lượng của các cấu tử trong tế bào làmcho tế bào gia tăng kích thước và trọng lượng Đến cuối giai đoạn tăng trưởng thì

tế bào phân cắt cho ra tế bào con Tế bào vi sinh vật có thể sinh sản bằng nhiềucách như phân đôi, nảy chồi, bào tử…Sự tăng trưởng này được biểu diễn theo hệthống thập phân, log2 hay log10 Cách tăng trưởng này gọi là tăng trưởng nhảy vọthay tăng trưởng theo log Đường biểu diễn này được gọi là đường tăng trưởngbiểu diễn số tế bào mẻ cấy theo thời gian Đường biểu diễn theo log là mộtđường có độ dốc (hệ số góc) chính là cường độ tăng trưởng, độ dốc càng lớncường độ tăng trưởng càng nhanh

Các tập đoàn vi khuẩn có đường tăng trưởng giống nhau và gồm có 4 giai đoạn:

a Giai đoạn chậm

Trong giai đoạn này sự tăng trưởng và phân cắt của tế bào rất chậm Do đóđường biểu diễn có độ dốc nhỏ Giai đoạn này được giải thích là khi chuyển vikhuẩn từ môi trường cũ sang môi trường mới có thành phần thức ăn khác nhauhay từ mẻ cấy già sang mẻ cấy mới điều chế vi khuẩn cần có thời gian để tổnghợp các enzyme, coenzyme…để thích hợp với môi trường mới và nếu môitrường mới giống môi trường cũ thì giai đoạn chậm không xảy ra

b Giai đoạn log

Khi vi khuẩn bắt đầu thích hợp với môi trường mới thì cường độ tăng trưởngnhanh, đường biểu diễn có độ dốc lớn Cường độ này tùy thuộc vào thành phầnmôi trường và điều kiện ủ

c Giai đoạn quân bình

Khi thức ăn trong môi trường giảm và do sự tích tụ chất độc do vi khuẩn tiết ra,

số tế bào mới sinh bằng số tế bào chết đi nên đường biểu diễn nằm ngang

4 Cách đo sự tăng trưởng của vi sinh vật

Sự tăng trưởng của vi sinh vật chính là sự gia tăng trọng lượng của từng cá thể visinh vật và sự gia tăng số lượng của tập đoàn vi sinh vật Đối với sự gia tăngtrọng lượng ta không thể nào xác định một cách chính xác được vì cần phải cóhơn 1010 tế bào vi sinh vật Ngoài ra, sự gia tăng trọng lượng này không thể phảnánh cường độ tăng trưởng của mẻ cấy Đối với các vi sinh vật có kích thước lớnngười ta có thể đo sự tăng trưởng của chúng bằng cách lấy một thể tích dung dịchnhất định có chứa vi sinh vật đem sấy ở 800C trong 48 giờ rồi cân trọng lượngkhô Thông thường, sự tăng trưởng của vi sinh vật có thể xác định bằng cách đếm

số tế bào

a Đếm trực tiếp

tích nhất định kính mang vật, nhuộm đơn, quan sát dưới kính hiển vi Phươngpháp này khó thực hiện vì trải không đều

đổi tùy theo từng loại vi sinh vật muốn đếm Thể tích mỗi ô vuông của hộp đếm

đã được biết trước Điểm bất lợi là không thể phân biệt tế bào nào sống hay chết

và số tế bào phải cao

b Phương pháp gián tiếp:

trộn lẫn với môi trường chứa agar ở khoảng 45oC, để nguội, môi trường đặc lại,đem ủ trong tủ ủ và đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào trong dung dịch muốnđếm Phương pháp này gọi là phương pháp đếm sống vì chỉ có vi sinh vật sốngmới phát triển thành khuẩn lạc Phương pháp này mất nhiều thời gian

Phương pháp đếm điện tử: Người ta dung máy đếm điện tử Nguyên tắc là

sự thay đổi đột ngột của điện trở được ghi thành một chấn động Điện trở ở mộtkhe có chất lỏng chảy qua, số tế bào vi sinh vật làm điện trở gia tăng Điểm bấtlợi là chấn động được tạo ra với cả hạt bụi nên máy phải thật sạch

một ống nghiệm chứa vi khuẩn, độ đục của môi trường làm giảm cường độ củachùm tia sáng và được ghi nhận trên một khung chia thành đơn vị OD Vì số ánhsáng tương ứng với mật số tế bào nên người ta so sánh với đường biểu diễnchuẩn để suy ra mật số tế bào trong một đơn vị thể tích

III Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước nhóm enzyme protease

Hiện nay, ở nước ta và trên thế giới đã có nhiều công trình công bố về việcnghiên cứu sử dụng sản phẩm từ enzyme protease

1 Trong nước

của thịt cá nếu chỉ do một loại enzyme duy nhất tác động thì không bao giờ hoàntoàn, nếu có tác động của các loại enzyme khác thêm vào thì quá trình a

sẽ nhanh hơn

cá trong quá trình lên men nước mắm có bổ sung 10% nấm sợi Aspergillus

tăng hàm lượng đạm tổng số, đạm amin, giảm lượng đạm amôn, có khả năng ápdụng để sản xuất nước mắm nhanh

Nguyễn Mỹ Tín và Nguyễn Văn Bá (1998) nghiên cứu quá trình lên men nướcmắm cá trích có bổ sung 10% chế phẩm protease nấm sợi, kết quả trong haitháng đầu mật số vi sinh vật ưa muối trong nước bổi cao hơn so với nước bổikhông bổ sung nấm sợi Đạm tổng số và đạm amin tăng cao, đồng thời giảmđáng kể lượng đạm amôn

Vũ Ngọc Bội và Đồng Thị Thanh Thu (2003) nghiên cứu thu nhận protease từ

canh trường nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis

(Saurida tumbil) và thử nghiệm sản xuất nước mắm từ cá cơm thường (Stolephorus commersonii

tốt nhất ở nhiệt độ 50 C, pH tự nhiên của cơ chất,nồng độ protease 0,3%, lượng nước bổ sung 20% và có bổ sung 3% muối ănhoặc 8% ethanol hay 4% sorbitol để ức chế quá trình gây thối, trong đó sử dụngsorbitol cho bột đạm có hàm lượng acid amin cao hơn, mùi thơm hơn và đạt tiêu

chuẩn về vi sinh vật Sử dụng protease B subtilis

, sản phẩm có hàm lượng và thànhphần acid amin cao hơn phương pháp truyền thống và các phương pháp bổ sungcác enzyme thương mại : NFĐ, Neutrase, Flavourzyme

và ctv (2005) nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ một

số nguồn khác nhau và ứng dụng để sản xuất chitin từ phế liệu tôm và cải tiếnquy trình sản xuất nước chấm từ đậu nành Kết quả cho thấy nguồn thu nhận cóhiệu quả nhất là vi sinh vật Từ đó đã xây dựng được quy trình thu nhận chế

phẩm protease từ Bacillus subtilis

cồn tốt nhất ở nhiệt độ 50

5 giờ Sản xuấtnước chấm bằng phương pháp kết hợp enzyme-acid cho phép giảm lượng acid sử dụng, rút ngắn chu kỳ sản xuất và hạ giá thành sản phẩm

2 Ngoài nước

Nielsen P.M el al

Kết quả cho thấy phương pháp OPA dễ thực hiện, cho kết quảnhanh và chính xác hơn, phạm vi áp dụng rộng hơn và ít độc hại hơn so vớiphương pháp TNBS (trinitro-benzene-sulfonic acid)

Salem F M A et al (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm

papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ đầu quátrình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri vàshark) Kết quả cho thấy với 0,3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất

so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và caohơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%

Aspmo Stein Ivar et al

55của nó hoặc bổ sung một trong số bảy enzyme protease thương mại

PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Phương tiện nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme - ViệnNghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học

Một số dụng cụ như: bình tam giác, dĩa petri, beaker, bình định mức, ống đong,ống nghiệm, micropipet, que cấy…

3 Hóa chất

BSA (Biovin Serum Albumin) (Merck), NaCl (Merck), Borax (Disodiumtetraborate) (TQ), SDS (Sodium dodecyl sulfat) (Merck), OPA (Ortho-phthaldialdehyde) (Merck), DTT (Dithiothreitol) (Merck), Serine (Merck), Ethanol(Merck), HCl (Merck), Coomassie Blue G-250 (Merck), Acid phosphoric85% (Merck)

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: pepton (Hà Lan), dịch chiết thịt bò, dịch chiếtnấm men, agar, natri clorua, đường…

- Môi trường Luria Broth (LB):

Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH 7,2.

- Môi trường nuôi cấy nấm men (YEB):

Dịch chiết thịt bò 5 gam

Dịch chiết nấm men 1 gam

Pepton 5 gam

Đường 5 gam

Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH = 6

Môi trường đạm dịch trùn quế thủy phân được tính để thay thế dựa trên lượng đạm amin của 10 hoặc 5 gam pepton tùy theo môi trường nuôi cấy

II Phương pháp nghiên cứu

1 Chuẩn bị mẫu và xác định thành phần đạm nguyên liệu

a Chuẩn bị mẫu

- Sử dụng trùn quế đã rửa sạch, sấy đông khô (độ ẩm < 5%) và trữ lạnh ở -20oC.Đem xay mịn bằng máy xay sinh tố rồi tiến hành tự thủy phân với các điều kiệntối ưu cho quá trình tự thủy phân đã được nghiên cứu theo Phạm Thị QuỳnhTrâm (2008)

- Tiến hành: Cân 26,52 gam trùn quế sấy đông khô đã xay mịn, bổ sung 173,48

ml nước cất, dịch thủy phân đạt nồng độ protein 9% Thuỷ phân trong 24 giờ ởnhiệt độ 55oC

Cân lượng pepton Hà Lan (độ ẩm < 6 %) tương đương trùn quế sấy đông khô phatrong cùng lượng nước cất Tiến hành xác định hàm lượng protein hòa tan vàđạm amin

b Xác định thành phần đạm nguyên liệu

Hàm lượng đạm tổng số

Phương pháp: dùng phương pháp Kjeldahl (Phụ lục 1)

Hàm lượng protein hòa tan

Phương pháp: đo hàm lượng protein nguyên liệu theo phương pháp Bradford(Phụ lục 2)

Hàm lượng đạm amin

Phương pháp: Xác định theo phương pháp OPA (Nielsen et al, 2001) (Phụ lục 3)

2 Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật

a Thí nghiệm 1: Xác định lượng đạm amin của trùn quế thay thế đạm amin của pepton thích hợp môi trường nuôi cấy vi khuẩn E Coli DH 5

- Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton

trong môi trường LB nuôi cấy chủng vi khuẩn E Coli DH 5 Đây là chủng vi

khuẩn được dùng trong công nghệ gen và hiện đang sử dụng tại phòng Côngnghệ gen thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh họctrường Đại Học Cần Thơ

- Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại

Nhân tố A: lượng đạm amin thay thế pepton với 5 mức độ:

- Tiến hành: Vi khuẩn E coli DH 5 được nuôi trong môi trường Luria Broth.Pepton và dịch đạm trùn quế được xác định hàm lượng đạm amin bằng phươngpháp OPA (Nielsen, 2001) để quy về lượng đạm amin như nhau giữa các nghiệm

thức từ A1 đến A5 Sau đó chủng 0,1% (v/v) vi khuẩn E coli DH 5 Tiến hành ủ

ở 37oC với tốc độ lắc là 110 vòng/ phút Sau 16 giờ tăng trưởng sẽ đo độ đục ởbước sóng 600nm (OD600nm) để xác định mức độ tăng trưởng của vi khuẩn trêncác nghiệm thức

Kết quả: Chọn được lượng bột đạm thích hợp để tiến hành thí nghiệm 2

gian

Môi trường lỏng

- Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp để chủng vi khuẩn E Coli DH 5

sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có lượng đạm amin thay thế đã chọn từ thí

nghiệm 1 và so sánh sự tăng trưởng của vi khuẩn E coli DH 5 theo thời gian trên hai môi trường đạm pepton và đạm thay thế

- Bố trí thí nghiệm:

C1 = 0% C2 = 25% C3 = 50%

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại

Nhân tố B: Thời gian nuôi cấy với 9 mức độ:

B1 = 3 giờ B2 = 6 giờ B3 = 9 giờ

B4 = 15 giờ B5 = 18 giờ B6 = 21 giờ

B7 = 24 giờ B8 = 27 giờ B9 = 30 giờ

- Tiến hành: Vi khuẩn cũng được chủng 0,1% (v/v) vào môi trường Luria Broth

Và nuôi trên máy lắc ủ, 110 vòng/phút, nhiệt độ 37oC Mỗi nghiệm thức có 3 lầnlặp lại Cứ sau 3 giờ kể từ khi bắt đầu chủng vi khuẩn cho đến 30 giờ, lấy 1,5mlcho vào eppendorf, trữ ở 4oC để tiến hành đo độ đục ở OD600nm

Môi trường thạch đĩa.

- Mục đích: Quan sát và so sánh sự phát triển của khuẩn lạc E coli DH 5 theo

thời gian trên 2 môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thay thế

- Tiến hành: Môi trường thạch đĩa có thành phần giống môi trường lỏng (Luria

Broth) nhưng có thêm agar 2% Dùng que cấy chuyển vi khuẩn E.coli DH 5 lên

đĩa trong điều kiện vô trùng và ủ ở 37oC Quan sát và chụp hình khuẩn lạc của vikhuẩn sau 16, 24, 36 giờ

c Thí nghiệm 3: Xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae

- Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton

trong môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae Đây là chủng nấm

men được sử dụng lên men rượu phổ biến và hiện đang sử dụng tại phòng Vi sinhthực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường ĐạiHọc Cần Thơ

- Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại

Nhân tố C: lượng đạm amin thay thế pepton với 5 mức độ

- Tiến hành: Chủng 0,1%(v/v) nấm men vào các bình tam giác 100ml có chứamôi trường nuôi cấy nấm men với hàm lượng đạm amin bằng nhau giữa cácnghiệm thức Ủ lắc ở 30oC, 110vòng/phút Sau 24 giờ phát triển, tiến hành đo độđục môi trường nuôi ở OD600nm.

d Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae theo thời gian

Môi trường lỏng

- Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp để chủng nấm men YEB sinh trưởngtốt nhất trong môi trường có lượng bột đạm thay thế đã chọn từ thí nghiệm 3

- Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại

Nhân tố D: Thời gian nuôi cấy với 9 mức độ:

D1 = 3 giờ D2 = 6 giờ D3 = 9 giờ D4

D7 = 24 giờ D8 = 27 giờ D9 = 30 giờ

- Tiến hành: Thí nghiệm này cũng được tiến hành tương tự với thí nghiệm 2

Môi trường thạch dĩa

- Mục đích: Quan sát và so sánh sự phát triển của khuẩn lạc nấm men YEB theothời gian trên 2 môi trường đạm pepton và đạm bột trùn quế thay thế

- Tiến hành: Môi trường thạch đĩa có thành phần giống như trong môi trườnglỏng nhưng thêm 2% agar Dùng que cấy chuyển nấm men lên đĩa trong điềukiện vô trùng và ủ ở 30oC Quan sát và chụp hình khuẩn lạc của nấm men sau 24

và 36 giờ

PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

1 Thành phần đạm nguyên liệu

Mẫu trùn quế chuẩn bị trong phần thực nghiệm II.1.a, sau 24 giờ tự thủy phânđược đun sôi 30 phút, ly tâm 7000 vòng/phút, 20 phút Thu được 180 ml dịchđạm thủy phân xác định hàm lượng protein hòa tan và đạm amin cùng với mẫupepton (Hà Lan) làm đối chứng Kết quả ghi nhận được theo bảng 4

Bảng 4: Kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton.

Mẫu Protein tổng (mg) Đạm amin tổng (mgN)

Trong dịch đạm thuỷ phân và pepton, thành phần chiếm đa số là các peptid ngắn

và acid amin, do đó khi xác định protein bằng phương pháp Bradford cho kết quảrất thấp do thuốc thử này chỉ bắt màu với những protein có trọng lượng phân tửtrên 4000 Da (Nielsen S.S, 2003) Ngoài ra, với cùng một khối lượng mẫu 26,52gam thì hàm lượng đạm amin trong bột trùn quế đã được thủy phân cao hơn so vớipepton Hà Lan, gấp khoảng 1,8 lần Dự đoán đây có thể là môi trường rất thuậnlợi cho sự phát triển của vi sinh vật Vì vậy, kết quả này bước đầu rất có ý nghĩa

để tính lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các thí nghiệm tiếptheo

2 Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật

a Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli DH 5

Tính toán lượng đạm amin dịch thủy phân trùn quế đưa vào chuẩn bị môi trườngnuôi cấy ở các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% và100% (A1, A2, A3, A4 và A5), không thay đổi các thành phần khác Sau 16 giờnuôi cấy liên tục, tiến hành lấy mẫu đo độ đục ở độ hấp thụ OD600nm Kết quảcho ở bảng 5 cho ta thấy các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%,

50%, 75% có độ đục không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05).

Nghiệm thức thay thế đạm pepton bằng 100% đạm trùn quế có độ đục cao nhất,

khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại Điều này chứng tỏ với môi

trường đạm trùn quế thủy phân 100% vi khuẩn E coli DH 5 đã phát triển tốt

nhất và tốt hơn cả môi trường chỉ có đạm pepton thương mại (nghiêm thức A1)

Bảng 5: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E coli

DH 5 .

OD* 600nm 0,518b

0,517b 0,530ab 0,518b 0,540a

* Các giá trị trung bình có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05)

Kết quả thí nghiệm cũng tương tự của Nakajima và ctv (2000) dùng dịch đạm tự

thủy phân trùn đất Lumbricus rubellus nuôi cấy vi khuẩn E Coli XL 1-Blue cho

sự tăng trưởng vi khuẩn bình thường so với bột pepton đối chứng trên môitrường LB với tỉ lệ bột pepton là 1% (w/v) sau 30 giờ nuôi cấy Như vậy có thểkhẳng định dung dịch đạm trùn quế thủy phân 100% hoàn toàn có thể thay thếđạm pepton trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến LB Hình 2 sau đây

mô tả sự phát triển của vi khuẩn E coli DH 5 sau 16 giờ nuôi cấy.

Hình 2: Môi trường lỏng trước và sau khi nuôi vi khuẩn E coli DH 5 16 giờ

Trong môi trường lỏng

Sau thí nghiệm xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế lượng pepton thích

hợp cho nuôi cấy vi khuẩn E coli DH 5 , nhận thấy dịch trùn quế thủy phân