II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật
a. Thí nghiệm 1: Xác định lượng đạm amin của trùn quế thay thế đạm amin của pepton thích hợp môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. Coli DH 5
- Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton trong môi trường LB nuôi cấy chủng vi khuẩn E. Coli DH 5 . Đây là chủng vi khuẩn được dùng trong công nghệ gen và hiện đang sử dụng tại phòng Công nghệ gen thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại Học Cần Thơ.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố A: lượng đạm amin thay thế pepton với 5 mức độ:
A1 = 0% A2 = 25% A3 = 50%
A4 = 75% A5 = 100%
- Tiến hành: Vi khuẩn E. coli DH 5 được nuôi trong môi trường Luria Broth. Pepton và dịch đạm trùn quế được xác định hàm lượng đạm amin bằng phương pháp OPA (Nielsen, 2001) để quy về lượng đạm amin như nhau giữa các nghiệm thức từ A1 đến A5. Sau đó chủng 0,1% (v/v) vi khuẩn E. coli DH 5 . Tiến hành ủ ở 37oC với tốc độ lắc là 110 vòng/ phút. Sau 16 giờ tăng trưởng sẽ đo độ đục ở bước sóng 600nm (OD600nm) để xác định mức độ tăng trưởng của vi khuẩn trên các nghiệm thức.
Kết quả: Chọn được lượng bột đạm thích hợp để tiến hành thí nghiệm 2.
b. Thí nghiệm 2: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. Coli DH 5 theo thời
gian
Môi trường lỏng
- Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp để chủng vi khuẩn E. Coli DH 5
sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có lượng đạm amin thay thế đã chọn từ thí nghiệm 1 và so sánh sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5 theo thời gian trên hai môi trường đạm pepton và đạm thay thế.
C1 = 0% C2 = 25% C3 = 50%
C4 = 75% C5 = 100%
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố B: Thời gian nuôi cấy với 9 mức độ:
B1 = 3 giờ B2 = 6 giờ B3 = 9 giờ
B4 = 15 giờ B5 = 18 giờ B6 = 21 giờ
B7 = 24 giờ B8 = 27 giờ B9 = 30 giờ
- Tiến hành: Vi khuẩn cũng được chủng 0,1% (v/v) vào môi trường Luria Broth. Và nuôi trên máy lắc ủ, 110 vòng/phút, nhiệt độ 37oC. Mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại. Cứ sau 3 giờ kể từ khi bắt đầu chủng vi khuẩn cho đến 30 giờ, lấy 1,5ml cho vào eppendorf, trữ ở 4oC để tiến hành đo độ đục ở OD600nm.
Môi trường thạch đĩa.
- Mục đích: Quan sát và so sánh sự phát triển của khuẩn lạc E. coli DH 5 theo thời gian trên 2 môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thay thế.
- Tiến hành: Môi trường thạch đĩa có thành phần giống môi trường lỏng (Luria Broth) nhưng có thêm agar 2%. Dùng que cấy chuyển vi khuẩn E.coli DH 5 lên đĩa trong điều kiện vô trùng và ủ ở 37oC. Quan sát và chụp hình khuẩn lạc của vi khuẩn sau 16, 24, 36 giờ.
c. Thí nghiệm 3: Xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae
- Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton trong môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae. Đây là chủng nấm men được sử dụng lên men rượu phổ biến và hiện đang sử dụng tại phòng Vi sinh thực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại Học Cần Thơ.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố C: lượng đạm amin thay thế pepton với 5 mức độ.
- Tiến hành: Chủng 0,1%(v/v) nấm men vào các bình tam giác 100ml có chứa môi trường nuôi cấy nấm men với hàm lượng đạm amin bằng nhau giữa các nghiệm thức. Ủ lắc ở 30oC, 110vòng/phút. Sau 24 giờ phát triển, tiến hành đo độ đục môi trường nuôi ở OD600nm.
d. Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae theothời gian thời gian
Môi trường lỏng
- Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp để chủng nấm men YEB sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có lượng bột đạm thay thế đã chọn từ thí nghiệm 3. - Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố D: Thời gian nuôi cấy với 9 mức độ:
D1 = 3 giờ D2 = 6 giờ D3 = 9 giờ D4
= 15 giờ D5 = 18 giờ D6 = 21 giờ
D7 = 24 giờ D8 = 27 giờ D9 = 30 giờ
- Tiến hành: Thí nghiệm này cũng được tiến hành tương tự với thí nghiệm 2.
Môi trường thạch dĩa
- Mục đích: Quan sát và so sánh sự phát triển của khuẩn lạc nấm men YEB theo thời gian trên 2 môi trường đạm pepton và đạm bột trùn quế thay thế.
- Tiến hành: Môi trường thạch đĩa có thành phần giống như trong môi trường lỏng nhưng thêm 2% agar. Dùng que cấy chuyển nấm men lên đĩa trong điều kiện vô trùng và ủ ở 30oC. Quan sát và chụp hình khuẩn lạc của nấm men sau 24 và 36 giờ.
PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
1. Thành phần đạm nguyên liệu
Mẫu trùn quế chuẩn bị trong phần thực nghiệm II.1.a, sau 24 giờ tự thủy phân được đun sôi 30 phút, ly tâm 7000 vòng/phút, 20 phút. Thu được 180 ml dịch đạm thủy phân xác định hàm lượng protein hòa tan và đạm amin cùng với mẫu pepton (Hà Lan) làm đối chứng. Kết quả ghi nhận được theo bảng 4.
Bảng 4: Kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton.
Mẫu Protein tổng (mg) Đạm amin tổng (mgN)
Dịch đạm thuỷ phân 20,88 1299
Pepton Hà Lan 49,06 719
Trong dịch đạm thuỷ phân và pepton, thành phần chiếm đa số là các peptid ngắn và acid amin, do đó khi xác định protein bằng phương pháp Bradford cho kết quả rất thấp do thuốc thử này chỉ bắt màu với những protein có trọng lượng phân tử trên 4000 Da (Nielsen S.S, 2003). Ngoài ra, với cùng một khối lượng mẫu 26,52 gam thì hàm lượng đạm amin trong bột trùn quế đã được thủy phân cao hơn so với pepton Hà Lan, gấp khoảng 1,8 lần. Dự đoán đây có thể là môi trường rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, kết quả này bước đầu rất có ý nghĩa để tính lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các thí nghiệm tiếp theo.
2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật
a. Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5
Tính toán lượng đạm amin dịch thủy phân trùn quế đưa vào chuẩn bị môi trường nuôi cấy ở các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% và 100% (A1, A2, A3, A4 và A5), không thay đổi các thành phần khác. Sau 16 giờ nuôi cấy liên tục, tiến hành lấy mẫu đo độ đục ở độ hấp thụ OD600nm. Kết quả cho ở bảng 5 cho ta thấy các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% có độ đục không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05). Nghiệm thức thay thế đạm pepton bằng 100% đạm trùn quế có độ đục cao nhất,
khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại. Điều này chứng tỏ với môi trường đạm trùn quế thủy phân 100% vi khuẩn E. coli DH 5 đã phát triển tốt nhất và tốt hơn cả môi trường chỉ có đạm pepton thương mại (nghiêm thức A1).
Bảng 5: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E. coli DH 5 .
Nghiệm thức A1 A2 A3 A4 A5
OD* 600nm 0,518b
0,517b 0,530ab 0,518b 0,540a
* Các giá trị trung bình có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05)
Kết quả thí nghiệm cũng tương tự của Nakajima và ctv (2000) dùng dịch đạm tự thủy phân trùn đất Lumbricus rubellus nuôi cấy vi khuẩn E. Coli XL 1-Blue cho sự tăng trưởng vi khuẩn bình thường so với bột pepton đối chứng trên môi trường LB với tỉ lệ bột pepton là 1% (w/v) sau 30 giờ nuôi cấy. Như vậy có thể khẳng định dung dịch đạm trùn quế thủy phân 100% hoàn toàn có thể thay thế đạm pepton trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến LB. Hình 2 sau đây mô tả sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 sau 16 giờ nuôi cấy.
A1 A2 A3 A4 A5 A1 A2 A3 A4 A5
Hình 2: Môi trường lỏng trước và sau khi nuôi vi khuẩn E. coli DH 5 16 giờ
b. Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 theo thời gian
Trong môi trường lỏng
Sau thí nghiệm xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế lượng pepton thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 , nhận thấy dịch trùn quế thủy phân
O D 6 00 n m
hoàn toàn có thể thay thế bột đạm pepton, nên trong thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng nhóm vi khuẩn này theo thời gian được nuôi cấy trên hai môi trường 100% dịch thủy phân trùn quế và 100% lượng pepton theo môi trường LB. Kết quả hình 3 cho thấy đường tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5 theo thời gian trên hai môi trường đều như nhau. Ở thời điểm ban đầu vi khuẩn có mật số bằng nhau, nhưng sau 3 giờ tăng trưởng vi khuẩn bắt đầu tăng sinh khối mạnh (giai đoạn log) và đạt đến cực đại ở móc thời gian 18 giờ. Sau đó thì chuyển sang giai đoạn cân bằng và chết.
Tuy nhiên, trong môi trường đạm trùn quế thủy phân, vi khuẩn phát triển mạnh hơn khoảng 1,5 lần so với môi trường đạm pepton. Ngay từ đầu giai đoạn log, E. coli DH 5 trong môi trường đạm trùn quế đã có xu hướng phát triển vượt trội và đạt giá trị OD600nm tối đa (0,650) ở 18 giờ. Trong khi đó, nếu sử dụng đạm pepton thì giá trị OD600nm chỉ đạt 0,436. Sau thời điểm này thì ở cả hai môi trường đạm khác nhau vi khuẩn đều chuyển sang giai đoạn cân bằng. Kết quả thống kê ở từng thời điểm từ 6 giờ đến 30 giờ giữa hai nghiệm thức đều có sự khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) (bảng 11, phụ lục 1).Từ kết quả trên, một lần nữa khẳng định khả năng thay thế đạm trùn quế trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn là rất khả thi, mở ra một hướng ứng dụng mới từ trùn quế. Đây là nguồn đạm dồi dào vừa rẻ tiền lại vừa cho hiệu quả cao.
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 5 10 15 20 25 30
Thời gian tăng trưởng (giờ)
Pepton
Trùn quế thủy phân
Hình 3: Sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5 trên hai môi
Môi trường thạch đĩa
Trong cùng điều kiện nuôi cấy, mật số vi khuẩn, thành phần dinh dưỡng là như nhau, hai môi trường chỉ khác nhau ở nguồn đạm pepton và đạm từ trùn quế. Sự khác biệt về kích thước tăng trưởng của vi khuẩn trên hai loại đạm pepton và đạm trùn quế được thể hiện rõ trên hình 4, 5 và 6 nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa LB.
Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế
Hình 4: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5X sau 16 giờ
Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế
Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế
Hình 6: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5 sau 36 giờ
Quan sát khuẩn lạc trên hai đĩa môi trường ở mỗi điểm thời gian, nhận thấy chúng to dần từ 16 giờ đến 36 giờ. Khuẩn lạc trên môi trường đạm trùn quế luôn luôn có kích thước lớn hơn trên môi trường đạm pepton. Như vậy kết quả này đã kiểm chứng lại về mặt dinh dưỡng nhờ thành phần đạm amin có mặt trong dịch trùn quế thủy phân cao hơn bột pepton nên đã giúp cho khuẩn lạc phát triển tốt.
c. Kết quả xác định lượng đạm amin từ trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae. cho môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Tương tự như thí nghiệm 1, tính toán lượng đạm amin dịch thủy phân trùn quế đưa vào chuẩn bị môi trường nuôi cấy ở các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% và 100% (C1, C2, C3, C4 và C5), không thay đổi các thành phần khác. Kết quả đo OD600nm (bảng 6) cho thấy với hàm lượng đạm amin của trùn quế thay thế cho đạm pepton tăng dần thì mức độ tăng trưởng của nấm men cũng tăng theo và hoàn toàn khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05). Nghiệm thức 100% đạm trùn quế thủy phân (nghiệm thức C5) cho giá trị OD cao nhất (0,975), khác biệt có ý nghĩa với tất cả các nghiệm thức còn lại. Do đó, C5 vẫn là nghiệm thức được chọn thay thế cho đạm pepton hiệu quả nhất.
Bảng 6: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae . Nghiệm thức C1 C2 C3 C4 C5 OD* 600nm 0,802e 0,850d 0,902c 0,942b 0,975a
* Các giá trị trung bình có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05)
C1 C2 C3 C4 C5 C1 C2 C3 C4 C5
Hình 7: Môi trường trước và sau khi nuôi Saccharomyces cerevisiae 24 giờ
Với kết quả này một lần nữa chứng tỏ dịch đạm thủy phân từ trùn quế tương tự dịch đạm từ loài trùn đất Lumbricus rubellus, đều cho sự tăng trưởng tốt cả trên môi trường nuôi cấy nấm men bánh mì với tỉ lệ bột pepton thay thế 0,2%.
d. Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae theo thời gian theo thời gian
Môi trường lỏng
Thí nghiệm xác định lượng đạm amin trùn quế sử dụng trong môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae cho thấy có thể thay thế 100% lượng pepton Hà Lan. Vì vậy, trong thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng chủng nấm men này theo thời gian được thực hiện với nghiệm thức 100% dịch thủy phân trùn quế và nghiệm thức 100% lượng pepton làm đối chứng. Kết quả được thể hiện ở hình 8 cho thấy giữa hai môi trường đạm trùn quế thủy phân và pepton đều có đường tăng trưởng theo thời gian như nhau và có sự khác biệt không nhiều về độ đục được đo OD600nm ở các thời điểm giữa hai nghiệm thức có thể do trong thí nghiệm này nguồn đạm từ trùn quế trong môi trường YEB sử dụng không nhiều (0,5% theo w/v). Kết quả được thống kê ở bảng 14 (phụ lục 1) cũng cho thấy nhận định trên là chính xác vì chỉ có các thời điểm 6, 9, 21, 27 và 30 giờ
O
D
6
00
nm
khác biệt có ý nghĩa. Nhìn chung, các thời điểm ở nghiệm thức sử dụng đạm từ trùn quế thủy phân đều cao hơn so với nghiệm thức nuôi cấy trên môi trường đạm pepton Hà lan nhưng độ lệch không rõ như thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn
E.Coli DH 5 có thể do môi trường LB sử dụng nguồn đạm khá cao (1% theo w/v). Như vậy, một lần nữa chứng minh nguồn đạm thủy phân từ trùn quế có thể thay thế cho đạm pepton để nuôi cấy nấm men hiệu quả hơn, đồng thời giảm giá thành cho môi trường nuôi cấy.
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 5 10 15 20 25 30
Thời gian tăng trưởng (giờ)
Pepton
Trùn quế thủy phân
Hình 8: Sự tăng trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên 2
môi trường đạm pepton và đạm thủy phân trùn quế theo thời gian
Môi trường thạch đĩa
Quan sát khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae sau 24 và 36 giờ ủ trên môi trường YEB nhưng có thêm agar 2% ở hình 9 và 10 cho thấy các khuẩn lạc trên môi trường đạm trùn quế có kích thước từ bằng đến to hơn trên môi trường đạm pepton. Từ đó, khẳng định rằng nguồn đạm từ trùn quế hoàn toàn có khả năng thay thế cho đạm pepton để nuôi cấy vi sinh vật với hiệu quả tối ưu.
Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế
Hình 9: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae sau 24giờ