Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng

coli tái tổ hợp mang gen mã hóa một số enzyme quan trọng của con đường sinh tổng hợp CoQ10 như dxs và dps, song khả năng tổng hợp CoQ10 còn thấp so với các chủng đột biến.. tumefaciens

LỜI CAM ĐOAN

Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài.“Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo

chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB của Bộ Công thương

Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các công trình nghiên cứu nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

GS.TS Đặng Thị Thu PGS.TS Trương Quốc Phong Nguyễn Việt Phương

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu, nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, PGS.TS Trương Quốc Phong, Trưởng phòng Proteomic - Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cám ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Vi Sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử cùng các thầy giáo, cán bộ bộ môn Vi sinh – Hóa sinh

và Sinh học Phân tử, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cám ơn tới Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bố mẹ, vợ, con và các anh chị em, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 CẤU TẠO COENZYME Q10 3

1.2 NGUỒN THU COENZYME Q10 4

1.2.1 Tổng hợp hóa học 4

1.2.2 Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật 6

1.2.3 Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 6

1.3 CON ĐƯỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT 7

1.4 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A TUMEFACIENS 10

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon 10

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ 11

1.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng 12

1.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12

1.4.5 Ảnh hưởng của pH 13

1.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan 13

1.5 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 14

1.5.1 Lên men gián đoạn 14

1.5.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch) 14

1.6 TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10 15

1.6.1 Tách chiết Coenzyme Q10 15

1.6.2 Tinh sạch Coenzyme Q10 17

1.6.3 Đặc tính của Coenzyme Q10 18

1.7 CẢI BIẾN CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 21

1.7.1 Đột biến chủng 21

1.7.2 Chủng tái tổ hợp 21

1.8 VAI TRÕ VÀ ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 29

1.8.1 Vai trò của Coenzyme Q10 29

1.8.2 Ứng dụng của Coenzyme Q10 31

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 35

2.1.1 Chủng vi sinh vật và plasmid 35

2.1.2 Hóa chất 35

2.1.3 Thiết bị sử dụng 36

2.1.4 Môi trường và các dung dịch sử dụng 37

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.2.1 Phương pháp vi sinh 38

2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 39

2.2.3 Phương pháp hóa lý, hóa sinh 46

2.2.4 Phương pháp toán học 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 55

3.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 55

3.1.2 Định tên chủng A tumefaciens TT4 59

3.2 NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN A TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 61

3.2.1 Tách dòng gen dps và dxs từ A tumefaciens TT4 61

3.2.2 Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs 66

3.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP 73

3.3.1 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 74

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đầu môi trường 78

3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống 78

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 79

3.3.5 Ảnh hưởng của thời gian 80

3.4 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A TUMEFACIENS 81

3.4.1 Chọn miền khảo sát 81

3.4.2 Thiết lập mô hình 82

3.4.3 Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 84 3.5 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH COENZYME Q10 TỪ CHỦNG A TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP 85

3.5.1 Đánh giá các phương pháp phá vỡ tế bào 85

3.5.2 Xác định điều kiện xử lý tế bào bằng ethanol 86

3.5.3 Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 88

3.5.4 Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 93

3.6 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 95

3.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của Coenzyme Q10 95

3.6.2 Ảnh hưởng của pH tới độ bền của Coenzyme Q10 96

3.6.3 Ảnh hưởng của ánh sáng tới độ bền của Coenzyme Q10 97

3.7 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 98

3.7.1 Hoạt tính chống oxy hóa của Coenzyme Q10 98

3.7.2 Khả năng ức chế tế bào ung thư của Coenzyme Q10 99

3.8 ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DƯỚI DẠNG VIÊN NANG 101

3.8.1 Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin 101

3.8.2 Khảo sát một số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin 102

3.8.3 Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10 105

3.8.4 Phân tích, đánh giá viên nang chứa Coenzyme Q10 107

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

PHỤ LỤC 124

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

DXS 1- deoxy-D- xylulose 5- phosphate synthase

HPLC High-performance liquid chromatography

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Các trạng thái khác nhau của CoQ10 3

Hình 1 2 Vị trí của CoQ10 trong lớp kép lipid 4

Hình 1.3 Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 5

Hình 1.4 Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 7

Hình 1.5 Cấu tạo của β – cyclodextrin 19

Hình 1.6 Chuỗi vận chuyển điện tử 30

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dps……….…43

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dxs 44

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang đồng thời hai gene dps và dxs 45

Hình 2.4 Phản ứng giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10 48

Hình 2.5 Phương trình phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa 50

Hình 3.1 Hình ảnh nhuộm Gram một số chủng phân lập (TT4, ML5), chủng chuẩn A tumefaciens ứng EHA và AA2 ……….55

Hình 3.2 Khả năng sinh 3-ketolactose của các chủng lựa chọn A: Màu của khuẩn lạc khi mới thêm thuốc thử Benedict B: Màu của khuẩn lạc khi thêm thuốc thử Benedict sau 75 phút 56

Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho gene dps (B) Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dps từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước và sau khi cắt bằng PstI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) 58

Hình 3 4 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho gene dxs (B) Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dxs từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước và sau khi cắt bằng NdeI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) 58

Hình 3.5 Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 các chủng A tumefaciens phân lập 59

Hình 3.6 Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ A tumefaciens TT4 61

Hình 3.7 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số của A tumefaciensTT4 M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ) 62

Hình 3 8 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của các dòng tái tổ hợp C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6 TT4 là khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A tumefaciens TT4 Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 63

Hình 3 9 Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3 mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B) Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương ứng với clone 3 và 6 Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 63

Hình 3.10 Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dps được tách dòng 64

Hình 3.11 Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dxs được tách dòng 66

Hình 3 12 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dps Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen Đường chạy (+) là sản phẩm PCR từ khuôn gốc Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 67 Hình 3.13 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dxs Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn ĐC là sản

phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen M là thang

DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 68

Hình 3.14 Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R (A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B) Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2) 69

Hình 3.15 Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) 70

Hình 3.16 Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A tumefaciens tái tổ hợp Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng thời hai gen pCAM-dps-dxs Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301 71

Hình 3.17 Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs 72

Hình 3.18 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B), sản phẩm cắt enzyme hạn chế SacI/BamHI từ DNA plasmid của A tumefaciens DPSX12 73

Hình 3.19 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens 74

Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 75

Hình 3 21 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens 76

Hình 3 22 Ảnh hưởng của nồng độ cao ngô đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 77

Hình 3 23 Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 78

Hình 3.24 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens 79

Hình 3.25 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 80

Hình 3 26 Ảnh hưởng của thời gian đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens 81

Hình 3.27 Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CoQ10 84

Hình 3.28 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng A tumefacienstái tổ hợp 84

Hình 3.29 Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10 85

Hình 3.30 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ 86

Hình 3.31 Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A tumefaciens tái tổ hợp 87

Hình 3.32 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A tumefaciens tái tổ hợp 88

Hình 3.33 Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A tumefaciens tái tổ hợp (B) 89

Hình 3.34 So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn, S dịch CoQ10 chuẩn 90

Hình 3.35 Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau 91

Hình 3.36 So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn 92

Hình 3.37 So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn L3, dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn 93

Hình 3.38 Quy trình thu nhận CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 94Hình 3.39 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A tumefaciens 96Hình 3.40 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A tumefaciens 97Hình 3.41 Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A tumefaciens 97Hình 3.42 Khả năng chống oxi hóa của CoQ10 98Hình 3.43 Phản ứng của CoQ10 các nồng độ khác nhau với DPPH (T-mẫu trắng) 99Hình 3.44 Ảnh hưởng của CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B)

và tế bào thận thỏ bình thường RK13 (C) Một số hình ảnh tế bào đại diện ở nồng độ 0, 20

và 80 µM CoQ10 100Hình 3.45 Hiệu suất thu hồi CoQ10 theo tỷ lệ phối trộn giữa CoQ10 với β-cyclodextrin 102Hình 3.46 Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước CoQ10 tạo phức với Cyclodextrin theo các tỷ lệ khác nhau 103Hình 3.47 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10 104Hình 3.48 Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10 105Hình 3.49 Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10 106Hình 3.50 Viên nang thực phẩm chức năng bổ sung chứa CoQ10 107

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác tới quá trình tổng hợp CoQ10 9

Bảng 1.2 Chủng chủ và hệ biểu hiện vi khuẩn được dùng để sinh tổng hợp CoQ10 26

Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng………35

Bảng 2.2 Máy và thiết bị 36

Bảng 2.3 Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dps 40

Bảng 2.4 Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dxs 40

Bảng 2.5 Các biến số và khoảng chạy của chúng 52

Bảng 2.6 Ma trận thực nghiệm 53

Bảng 3.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng phân lập……….57

Bảng 3.2 Mã số trình tự một số chủng A tumfaciens trên ngân hàng gen 60

Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được 82 Bảng 3.4 Phân tích phương sai ANOVA của mô hình 83

Bảng 3 5 Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước 102

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH đến độ hòa tan của phức β-CDQ10 103

Bảng 3.7 Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng 107

Bảng 3.8 Kết quả đo độ rã 108

Bảng 3.9 Kết quả định lượng CoQ10 trong viên nang 109

Bảng 3.10 Kết quả phân tích viên nang thực phẩm chức năng CoQ10 110

Bảng 3.11 Bảng theo dõi trọng lượng chuột……… 110

MỞ ĐẦU

Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), là một trong những coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử bám màng ở cả prokaryote và eukaryote, được cấu tạo bởi vòng benzoquinone và chuỗi isoprenoid kị nước CoQ10 có vai trò quan trọng trong việc sản xuất ra ATP - nguồn năng lượng sinh học của cơ thể Do có tính chất chống oxy hóa mạnh, trung hòa các gốc tự do nên CoQ10 ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp cơ thể trẻ hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp [5, 71, 72, 74]

Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên Để đáp ứng nhu cầu đó đã có nhiều giải pháp được đưa ra như tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và công nghệ sinh học Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay CoQ10 được sản xuất

chủ yếu bằng con đường lên men nhờ vi khuẩn như Agrobacterium tumefaciens,

Escherichia coli, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans [34, 36, 43, 54, 67, 91, 102]

Để nâng cao hiệu quả sản xuất CoQ10, từ năm 1993 nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tập trung vào tối ưu hóa quá trình lên men chủng tự nhiên hoặc cải biến chủng Việc cải biến chủng được thực hiện bằng cách gây đột biến ngẫu nhiên hoặc tạo chủng tái tổ hợp Mặc dù các chủng đột biến có khả năng tổng hợp CoQ10 cao hơn so với chủng gốc, tuy nhiên hàm lượng CoQ10 từ các chủng này vẫn chưa được như mong đợi

Hiện nay nhiều nghiên cứu đã và đang tập trung vào việc tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen mã hóa một số enzyme quan trọng của con đường sinh tổng hợp CoQ10 như dxs

và dps, song khả năng tổng hợp CoQ10 còn thấp so với các chủng đột biến Ngoài ra, các chủng E coli tái tổ hợp không chỉ tổng hợp CoQ10 mà còn tổng hợp cả CoQ8 và CoQ9

Đây là điều bất lợi cho việc tách tinh sạch thu CoQ10 đặc biệt là khi sản xuất ở quy mô công nghiệp

A tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10

hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở

quy mô công nghiệp [16, 33, 34, 101] Chiến lược sử dụng chính vi khuẩn A tumefaciens

làm chủng chủ để cải biến gen tạo chủng tái tổ hợp có khả năng tổng hợp CoQ10 tăng lên

là một giải pháp khả thi và đã bước đầu thành công bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc năm 2008 [16] Ở Việt Nam hiện nay các nghiên cứu về hướng này mới chỉ là các nghiên cứu về phân lập các chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 [2, 4]

Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng A tumefaciens tái tổ hợp”

 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10

- Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10

- Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng

 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn chủng A tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10

- Nghiên cứu tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10

- Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 và xác định đặc tính của Coenzyme Q10 từ

chủng A tumefaciens tái tổ hợp

 Khảo sát khả năng ứng dụng của Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực

phẩm chức năng dưới dạng viên nang

 Những đóng góp mới của luận án

- Đã phân lập và tuyển chọn được chủng A tumefaciens TT4 sinh tổng hợp CoQ10 cao

- Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dps và dxs mã hóa cho 2 enzyme chìa khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A tumefaciens TT4 phân lập ở VN và tạo được chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng suất sinh tổng

hợp CoQ10 cao

- Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng dưới dạng viên nang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 CẤU TẠO COENZYME Q10

Coenzyme Q10 (2,3-dimethoxy-5-methyl-6-multiprenyl-1,4-benzoquinone) còn gọi là (ubiquinone, ubidecarenone, CoQ10) lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957 [21] CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các dung môi phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [60, 63]

Cấu trúc hóa học của coenzyme Q10 bao gồm một vòng quinone liên kết với chuỗi mạch bên isoprene Coenzyme Q10 có công thức phân tử C59H90O4, khối lượng mol: 863.34 g/ mol [63]

Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol (CoQH2), dạng trung gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [24, 63]

Hình 1 1 Các trạng thái khác nhau của CoQ10

CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ CoQ10H2 là một phân tử rất kỵ nước nằm ở

giữa lớp phospholipid kép

Coenzyme Q10 có cấu trúc một đầu quinone, nó có thể chuyển giao điện tử và đuôi là một chuỗi isoprenoid dài bên trong màng ti thể hay màng tế bào chất của các sinh vật hô hấp hiếu khí Đuôi này giúp cho các phân tử CoQ10 có thể khuếch tán dễ dàng trong lớp màng lipid [63]

Hình 1 2 Vị trí của CoQ10 trong lớp kép lipid [63]

1.2 NGUỒN THU COENZYME Q10

CoQ10 được sản xuất từ ba phương pháp: lên men (tổng hợp sinh học), tổng hợp hóa học hoặc tách chiết từ mô động vật, thực vật

1.2.1 Tổng hợp hóa học

CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [51, 80, 100] Trong số

đó sử dụng solanesol cho quá trình tổng hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn xuất quinone là phương pháp đầy tiềm năng Solanesol có thể dễ dàng thu được bằng cách chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này ở quy mô công nghiệp vẫn còn bị hạn chế bởi việc thiếu một phương pháp hiệu quả cho việc tổng hợp các dẫn xuất quinone, là chìa khóa trung gian của CoQ10 Do đó, phương pháp tổng hợp các dẫn xuất quinone một cách hiệu quả là rất cấp thiết

Terao và Fujita đã chứng minh một quy trình hiệu quả để tổng hợp dẫn xuất quinone [30, 88] Tuy nhiên quy trình tổng hợp phải trải qua nhiều bước phức tạp và tốn kém Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trọng sản xuất công nghiệp Min và cộng sự (2003) đã đề xuất một phương pháp hiệu quả hơn cho quá trình tổng hợp các chất trung gian quan trọng tổng hợp CoQ10 qua một loạt các phản ứng alkyl hóa Friedel-Crafts bằng cách gắn thêm các mạch (–R) bất kì vào các vòng thơm [61] Tuy nhiên, thời gian phản ứng dài và hiệu suất thấp Một số phương pháp mới để tổng hợp

CoQ10 như chloromethyl mạch vòng CoQo với các ion, tuy nhiên những phương pháp này vẫn không áp dụng được trong quy mô công nghiệp [13, 51, 76]

Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp hóa học một cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2 ,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền thân của vòng quinone Hợp chất này là chất trung gian quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl CoQ10 được tổng hợp bắt đầu từ toluenesulfonyl p- (TsCl) với isoprene để có được (2E)-1-p-toluenesulfonyl-2-methyl-4-hydroxy-2-butene bằng cách kết hợp phương pháp este hóa và thủy phân Tiếp theo với việc bổ sung 2,3,4,5-

tetramethoxytoluene (TeMT), đã kết hợp 2 thành phần thành

(2‟E)-1-(3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5 tetramethoxybenzene Hợp chất này là chìa khóa quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl [64]

Hình 1.3 Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 [64]

(1): methyl-4-chloride-2-butene; (2): methyl-4-acetoxy-2-butene; (3): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-methyl-4-hydroxy-2-butene; (4): (2'E) -1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2 ,3,4,5-tetramethoxybenzene

(2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-(a): isoprene, copper (I) chloride (CuCl), triethylamine hydrochloride (Et 3 N·HCl), 90°C, 75.9%; (b): NaOAc, glacial acetic acid, 120°C, 90.7%; (c): MeOH, 20% Na 2 CO 3 , 0°C, 68.8%; (d): 2,3,4,5-tetramethoxytoluene (TeMT), 1,2-dichloroethane, boron trifluoride etherate (BF3·OEt 2 ), 80°C, 58.8%

1.2.2 Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật

CoQ10 hiện diện trong tự nhiên với số lượng nhỏ trong nhiều loại thực phẩm, nhưng mức độ đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận, cũng như thịt bò, dầu đậu nành CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957 Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên có chứa hàm lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [24, 63, 81, 85] Hàm lượng CoQ10 trong thịt là 8 - 200 μg/g, gia cầm 17 - 21 μg/g, cá 4 - 64 μg/g [24] Ngoài ra CoQ10 cũng

có trong trái cây, cây thuốc lá và rau nhưng với hàm lượng nhỏ [60, 95] Mặc dù có thể thu nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể chiết tách ở quy mô công nghiệp do hiệu suất thấp và chi phí cao Đây là lí do chính khiến cho các nghiên cứu về CoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế

1.2.3 Coenzyme Q10 từ vi sinh vật

1.2.3.1 Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc

Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp coenzyme Q10,

một số giống có hàm lượng CoQ10 cao như Cyptococcus,Trichosporon, Dexomyces,

Rhdoporium Một số chủng vi sinh vật khác có sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng

thấp hơn như Bullera, Candida, Rhodoturola, Sporobolomyces, Utilago [2, 4].

Schizosaccharomyces pombe cũng là một hệ thống phổ biến để sản xuất protein và CoQ10

[15] Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên cứu tối ưu quá trình sản xuất CoQ10

[66] Trong một số loài nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng

sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [45]

1.2.3.2 Coenzyme Q10 từ vi khuẩn

CoQ10 từ vi khuẩn đã được hai nhà khoa học là Carr và Exell nghiên cứu từ năm

1965 [12] Đặc biệt, các nghiên cứu chọn lọc các chủng dại sinh CoQ10 cao đã tìm được

các loài A tumefaciens [19], Rhodopseudomonas spheroids và P denitrificans [54] CoQ10 cũng được tìm thấy ở một số vi khuẩn quang hợp như R sphaeroides, R

sulfidophilus [91], Rhodospirillum rubrum [89] Trong đó hàm lượng CoQ10 đạt cao nhất

trong R Rubrum đạt 10 mg/l Ngoài ra CoQ10 cũng được thu nhận từ vi khuẩn

Sphingomnas sp [106], Rhizobium radiobacter [84], P dentrificans [99], P seudomonas

Các loài A tumefaciens, R sphaeroides, P denitrificans đã được sử dụng cho sản xuất

CoQ10 ở quy mô công nghiệp và đạt nồng độ từ 30 † 130 mg/l [34, 91]

Trong số các chủng vi sinh vật thì vi khuẩn A tumefaciens là một trong những vi

khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp [16, 33, 34]

1.3 CON ĐƯỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT

Con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật bao gồm 3 phần (Hình 1.4): tổng hợp mạch vòng quinonoid, tổng hợp mạch nhánh decaprenyl diphosphate, và biến đổi vòng quinonoid [18, 41, 58] Sơ đồ chi tiết con đường sinh tổng hợp được trình bày ở phụ lục 8

Hình 1.4 Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật [41]

 Tổng hợp vòng quinonoid (A)

Sự tạo thành 4-hydroxybenzoate (pHBA) từ chorismate là bước đầu tiên trong quá

trình sinh tổng hợp CoQ10 Phản ứng này, được xúc tác bởi enzym chorismate

pyruvatelyase được mã hóa bởi gen ubiC

Ở E coli, pHBA, tiền chất của vòng quinonoid thu được tạo thành từ con đường

shikimate, đây là con đường quan trọng để tổng hợp các axit amin thơm thông qua

chorismate pHBA được sử dụng cho quá trình prenyl hóa và biến đổi vòng

Ở động vật có vú, pHBA được tạo thành từ axit amin tyrosine do thiếu con đường

shikimate

Con đường MVA Con đường MEP

Ở nấm men pHBA được tổng hợp trực tiếp từ chorismate giống với E coli hoặc từ

tyrosine giống với các vi sinh vật nhân chuẩn bậc cao [18, 41, 63]

 Tổng hợp mạch nhánh (decaprenyl diphosphate) (B, C)

Isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó dimethylallyl diphosphate (DMAPP) là một tiền chất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp CoQ10 Để tổng hợp IPP, có hai con đường: con đường mevalonate (MVA) (C) và con đường 2-C-methyl- D-erythritol 4-phosphate (MEP) (non-MVA) (B)

Ở E coli, tảo lục và có thể là hầu hết các vi khuẩn khác, IPP bắt đầu được tổng hợp từ

con đường MEP theo một phản ứng tổng hợp khởi đầu giữa pyruvate và

glyceraldehyde-3-phosphate (GA3P) để tạo ra IPP và DMAPP [25, 47] Thực vật và Streptomycetes sử dụng

cả 2 con đường MVA và MEP

Phản ứng đầu tiên của tổng hợp IPP của con đường MEP ở E coli là hình thành deoxy-D-xylulose-5-phosphate (DXP) dưới sự xúc tác của gen dxs DXP sau đó bị khử thành MEP dưới sự xúc tác của EXP reductoisomerase (DXR) được mã hóa bởi gen ispC

1-(dxr) Sau đó MEP chuyển hóa thành IPP dưới sự xúc tác của các enzym được mã hóa bởi

các gen ispD (ygbP), ispE (ychB), ispF (ygbB), ispG (gcpE), và ispH (lytB) trong các phản ứng tiếp và bị đồng phân hóa thành DMAPP bởi gen idi

Vi sinh vật nhân chuẩn như nấm mốc và nấm men không có con đường MEP nên tổng hợp IPP dựa vào con đường MVA[42] Sinh tổng hợp IPP sử dụng con đường MVA bắt đầu với sự chuyển 3 phân tử của acetyl-CoA thành MVA thông qua acetoacetyl-CoA

và HMG-CoA MVA được chuyển thành MVA diphosphate bằng 2 quá trình phosphoryl hóa nhờ xúc tác bởi lần lượt 2 enzym MVA kinase và phospho-MVA kinase Sau đó, MVA diphosphate trải qua quá trình dehydate hóa-decarboxyl hóa trong một phản ứng cần ATP, tạo ra IPP Enzym IPP isomerase xúc tác quá trình đồng phân hóa của IPP thành DMAPP

Ở bước tiếp theo của con đường này, farnesyl diphosphate (FPP) synthase xúc tác sự bắt cặp 1‟-4 của IPP với DMAPP và geranyl diphosphate (GPP) dẫn đến sự hình thành lần lượt GPP và FPP Sản phẩm này được kéo dài bởi decaprenyl diphosphate synthase (DPS)

[41]

 Biến đổi vòng quinonoid (D)

Bước đầu tiên trong quá trình biến đổi vòng là pHBA bị prenyl hóa bởi một enzyme

bám màng 4- hydroxybenzoate decaprenyltransferase, chuyển các loại decaprenyl diphosphate [6, 59] Các phản ứng sau đó bao gồm 1 phản ứng decarboxyl hóa, 3 phản ứng hydroxyl hóa và 3 phản ứng methyl hóa xảy ra với các thứ tự khác nhau ở sinh vật nhân sơ

và sinh vật nhân chuẩn [58] CoQ cuối cùng được tổng hợp là kết quả của các phản ứng biến đổi vòng Ở nấm men, tiền chất chuỗi phụ được sử dụng cho prenyltransferase là

hexaprenyl diphosphate Sản phẩm của phản ứng này, 3-hexa prenyl pHBA, trải qua các phản ứng biến đổi vòng tiếp theo trong một thứ tự khác so với ở E coli Do đó, 3-hexa prenyl pHBA trải qua hydroxyl hóa, methyl hóa, và decarboxyl hóa thành 2-polprenyl-6- methoxyphenol O-methylase được mã hóa bởi gen CoQ3 như UbiG chuyển 2-polyprenyl-

3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1,4-benzoquinol thành ubiquinol Ở con đường sinh tổng

hợp CoQ này, pHBA:polyprenyl diphosphate transferase, chuyển chuỗi phụ isoprenoid thành khung quinone pHBA:polyprenyl diphosphate transferase có tính đặc hiệu cơ chất

rộng, và chiều dài của cơ chất isoprenoid không làm thay đổi hoạt tính chuyển đổi của nó

Chiều dài của chuỗi phụ không được xác định bởi tính đặc hiệu cơ chất của pHBA:

polyprenyl diphosphate transferase, nhưng được xác định bởi tính chất của isoprenoids Ở

E coli, quá trình prenyl hóa của pHBA thành 3-octaprenyl pHBA được xảy ra bởi enzym

liên kết màng pHBA:octaprenyltransferase Enzym này là không đặc hiệu và có thể sử

dụng nhiều prenyl diphosphate như là các tiền chất chuỗi phụ Enzym này cũng không có tính đặc hiệu đối với cơ chất thơm này Chiều dài của chuỗi phụ prenyl là một hằng số đối với mỗi sinh vật, điều này được quyết định bởi sự sẵn có của prenyl diphosphate trong tế

bào 3-octaprenyl pHBA được decarboxyl hóa thành 2-octaprenylphenol bởi 3-octaprenyl

pHBA decarboxylase 2-octaprenylphenol này trải qua 3 phản ứng hydroxyl hóa và 3 phản

ứng methyl hóa dẫn đến sự tạo thành ubiquinol và sau đó là CoQ10 [18, 41]

Bảng 1.1 Các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác tới quá trình tổng hợp CoQ10 [41]

phbA mvS mvaA mvaK1 mvaK2 mvaD dxs dxr ispD ispE

Acetoacetyl-CoA thiolase (PhbA) HMG-CoA synthase (MvaA) HMG-CoA reductase (MvaS) Mevalonate kinase (MvaK1) Phosphomevalonate kinase (MvaK2) Mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MvaD) 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS) 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) 4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-D-erythritol synthase (IspD) 4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (IspE)

ispF ispG ispH idi ispA ispB ddsA ubiA ubiG ubiE ubiH ubiF ubiB

2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase 4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate synthase 4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate reductase Isopentenyl pyrophosphate isomerase (Idi)

Farnesyl diphosphate synthase (IspA) Polyprenyl diphosphate synthase (IspB) – CoQ1 Decaprenyl diphosphate synthase (DdsA or DPS) – CoQ10 pHB-polyprenyltransferase (UbiA) – CoQ2

O-Methyltransferase (UbiG) – CoQ3 C-Methyltransferase (UbiE) – CoQ5 Monooxygenase (UbiH) – CoQ6 Monooxygenase (UbiF) – CoQ7 Monooxygenase (UbiB)

1.4 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A

TUMEFACIENS

Để sử dụng CoQ10 có hiệu quả hơn cho những ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và hiểu rõ hơn những đặc tính của CoQ10, việc sản xuất CoQ10 với chi phí thấp là một yêu cầu cần thiết Giảm chi phí sản xuất CoQ10 bằng cách tối ưu trong quá trình lên men là các

nghiên cứu cơ bản để ứng dụng trong sản xuất công nghiệp A tumefaciens được coi là vi

khuẩn sản sinh CoQ10 đạt hiệu quả cao [16, 31, 99] Do đó, đã có rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn cacbon, nguồn nitơ và hàm lượng nitơ, pH và các điều kiện môi trường khác đến sự sản xuất CoQ10

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon

Nguồn cacbon cũng như nồng độ cacbon trong môi trường đóng vai trò quan trọng để sinh tổng hợp CoQ10 Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon là đến khả năng sinh

CoQ10 của A tumefaciens, Ha và cộng sự (2007) đã nhận thấy rằng sucrose là nguồn

cacbon có hiệu quả hơn so với fructose, glucose trong sản xuất CoQ10 của chủng đột biến

A tumefaciens KCCM 10413 Sản phẩm CoQ10 đạt cao nhất (89,5 mg/l) khi sucrose được

sử dụng là nguồn cacbon [34] Cheong (2008) cũng chứng minh sucrose là nguồn cacbon

hiệu quả nhất trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens

KCCM-10554 tái tổ hợp hàm lượng CoQ10 thu được khi tiến hành lên men theo mẻ có bổ sung đường sucrose trong quá trình lên men tăng gấp 1,26 lần so với lên men theo mẻ gián đoạn

đạt 352 mg/l [16] Gu và cộng sự (2006) khi tiến hành nghiên cứu động học quá trình lên

men theo mẻ có bổ sung nguồn cacbon là 15% đường sucrose kết hợp với 33% mật đường

mía của chủng A tumefaciens ATCC4452 hàm lượng CoQ10 thu được đạt 71,5 mg/l sau

96 giờ nuôi cấy tăng gấp 3,5 lần so với lên men gián đoạn [31] Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã chứng minh đường sucrose là nguồn cacbon hiệu quả cho quá trình lên men

sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens [90, 99]

Sử dụng nồng độ cacbon cao trong môi trường lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ vi khuẩn có thể giúp cho sinh trưởng của vi khuẩn nhưng có thể hạn chế sự tổng hợp CoQ10 trong canh trường do nồng độ cơ chất cao làm tăng độ nhớt của dịch lên men, giảm hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường Để khắc phục hiện tượng này, trong môi trường lên men có thể bổ sung nguồn sucrose ở nồng độ thấp rồi bổ sung dần trong quá trình lên men đảm bảo đồng thời hai quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CoQ10

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ

Sinh tổng hợp CoQ10 không chỉ phụ thuộc vào nguồn nitơ mà còn phụ thuộc vào hàm lượng nitơ được sử dụng Hiện nay trong lên men sinh tổng hợp CoQ10, ta có thể cung cấp nitơ bằng cách sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu nitơ vô cơ hay hữu cơ Các nguồn nitơ bao gồm cao ngô, cao nấm men, peptone, trypton, soytone, cao malt, (NH4)2SO4 Tuy nhiên trong quá trình lên men sinh tổng hợp

CoQ10 từ A tumefaciens nguồn nitơ là cao ngô được đánh giá là có hiệu quả hơn cả Ha và

cộng sự (2007) khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ tới hàm lượng CoQ10 của

chủng đột biến A tumefaciens KCCM 10413 các nguồn nitơ được lựa chọn là (cao ngô,

cao nấm men, peptone, cao malt, casein, troytone và soytone) Kết quả cho thấy vi khuẩn

sử dụng cao ngô làm nguồn nitơ cho hàm lượng CoQ10 và sinh khối tế bào cao nhất lần lượt là (2,05 mg/ g sinh khối) và (41,8 g/l) so với các nguồn nitơ khác [16, 34] Gu và cộng

sự (2006) đã sử dụng nguồn nitơ là 4% cao ngô trong quá trình lên men chủng A

tumefaciens ATCC4452 hàm lượng CoQ10 thu được đạt 71,5 mg/l [31] Cũng có nhiều

công trình nghiên cứu sử dụng cao ngô làm nguồn nitơ cho quá trình lên men sinh tổng

hợp CoQ10 từ A tumefaciens [90, 99, 101]

Nguồn nitơ vô cơ như (NH4)2SO4 cũng được sử dụng trong nuôi cấy tổng hợp CoQ10 Một số các nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa các nguồn nitơ khác nhau trong sinh tổng hợp CoQ10 Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ như cao nấm men, peptone, cao ngô thì (NH4)2SO4 cũng được sử dụng là nguồn nitơ vô cơ kết hợp cho sinh tổng hợp CoQ10

Nuôi cấy trong điều kiện lên men gián đoạn 5 lít CoQ10 từ A tumefaciens 1.2554 đạt

20,62 mg/l khi kết hợp cao ngô với (NH4)2SO4 [99, 101]

1.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng

Trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 sử dụng A tumefaciens ta phải cung

cấp các nguyên tố đa lượng và vi lượng để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn Các nguyên

tố đa lượng cho sinh tổng hợp CoQ10 trong vi khuẩn thường sử dụng là S, P, K, Ca, Mg Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của vi khuẩn Phospho tham gia cấu tạo nên nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế bào vi khuẩn Lưu huỳnh tham gia vào thành phần một số axit amin Kali tham gia vào quá trình trao đổi gluxit Mg2+

mang tính chất là một cofactơ đối với nhiều enzyme, nó tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng

80 enzyme trong tế bào (enzyme thủy phân, enzyme oxy hóa khử ) Canxi chiếm khoảng vài phần trăm trong phần khoáng của tế bào vi khuẩn Canxi không tham gia vào thành phần các chất hữu cơ nhưng nó đóng vai trò trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng (như giữa các nucleotit, protein, axit nucleic) Trong nuôi cấy vi khuẩn để tổng hợp CoQ10 các nguyên tố khoáng đa lượng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng các muối

vô cơ như K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCO3 [16, 90, 99, 101]

1.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong môi trường nuôi cấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp

CoQ10 Thông thường A tumefaciens được nuôi cấy ở nhiệt độ 25o

-35oC là nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp CoQ10 Khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao hơn 35oC hoặc thấp hơn 25oC thì sinh trưởng chậm dẫn đến hàm lượng CoQ10 bị giảm [16, 34, 101]

Nhiệt độ tối ưu trong sự tổng hợp CoQ10 của chủng đột biến A tumefaciens KCCM

10413 là 32oC Khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn ở 25oC, 28oC, 30oC, 32oC, 35oC, kết quả cho thấy tại 32oC trọng lượng sinh khối tế bào, hàm lượng CoQ10, nồng độ CoQ10 cao nhất tương ứng là (32,4 mg/l, 6,90 mg/ g sinh khối, 223 mg/l) Từ 25 – 32oC tế bào tăng trưởng và hàm lượng CoQ10 được cải thiện đáng kể [34] Cũng theo Cheong (2008) nhiệt

độ tối ưu trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens KCCM-10554

tái tổ hợp là 32oC hàm lượng CoQ10 thu được sau 96 giờ lên men gián đoạn đạt 280 mg/l

[16] Tian (2010) trong quá trình nghiên cứu các phương pháp tách chiết CoQ10 đã tiến

hành lên men chủng A tumefaciens 1.2554 trong điều kiện nhiệt độ 28oC [90, 101] Theo

Yoshida (1998) nhiệt độ lên men chủng A tumefaciens KY-3085 (ATCC4452) là 30oC

hàm lượng CoQ10 đạt 180 mg/l sau 58 giờ lên men gián đoạn [99]

1.4.5 Ảnh hưởng của pH

Điều kiện pH có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp CoQ10 ở

A tumefaciens Hàm lượng CoQ10 thu được là lớn nhất khi tiến hành nuôi cấy các chủng

A tumefaciens trong điều kiện pH từ 7 – 7,5 Ha và cộng sự tiến hành nuôi cấy chủng đột

biến A tumefaciens KCCM 10413 trong điều kiện pH từ 6 - 8 hàm lượng CoQ10 tại pH

7.0 (7,04 mg/ g sinh khối) cao hơn tại pH 7,5 (5,43 mg/g sinh khối) Tại pH 8,0 hàm lượng CoQ10 giảm đi 4,11 mg/ g sinh khối Tại pH 6,0 trọng lượng sinh khối và hàm lượng CoQ10 giảm đi tương ứng là 24 g/l và 6.58 mg/g sinh khối Sản phẩm CoQ10 cao nhất tại

pH 7,0 và giảm dần tại pH axit và pH kiềm [34] Yoshida (1998) cũng tiến hành lên men

chủng A tumefaciens KY-3085 (ATCC4452) tại pH 7,0 Trong khi đó, Tian (2010) và Yuan (2012) đã tiến hành lên men chủng đột biến A tumefaciens PK38 tại pH 7,2 [90,

101]

1.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan

Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan tới trọng lượng sinh khối tế bào và hàm lượng

CoQ10 của chủng đột biến A tumefaciens KCCM 10413 được nghiên cứu thực hiện trong

96 giờ Nồng độ oxy hòa tan được kiểm soát tại 0-10, 10-20, và 20-30% được điểu chỉnh bằng tốc độ khuấy từ 500-900, 500-1,000 và 500-1,100 rpm Kết quả cho thấy, ban đầu thì nồng độ DO chưa được kiểm soát nhưng sau 24 giờ nuôi cấy, nồng độ DO được giới hạn

từ 0-10, 10-20, và 20-30% bằng cách điều chỉnh tốc độ khuấy Trọng lượng sinh khối tế bào của quá trình nuôi cấy khi chưa kiểm soát nồng độ DO là 36,5 g/l sau 24 giờ và không tăng thêm nữa Khi nồng độ DO tăng lên hàm lượng CoQ10 cũng tăng, tuy nhiên trọng lượng sinh khối tế bào (48,4 g/l) và sản phẩm CoQ10 (320 mg/l) cao nhất tại nồng độ DO

từ 0-10% [34] Cheong (2008) đã tiến hành nghiên cứu tốc độ khuấy và cấp khí ảnh hưởng

tới quá trình lên men chủng A tumefaciens tái tổ hợp đã nhận thấy rằng tại tốc độ khuấy

500 (rpm), cấp khí 1.0 (vvm) hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất đạt 250,4 mg/l [16]

1.5 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10

Lên men là quá trình phức tạp với nhiều yếu tố ảnh hưởng khác nhau, trong đó quá trình sinh trưởng và quá trình hình thành sản phẩm không chỉ bị ảnh hưởng bởi các thông

số trong môi trường mà đặc biệt còn bị ảnh hưởng bởi kỹ thuật quá trình lên men, bao gồm dạng thức lên men, chế độ cấp dinh dưỡng, tốc độ thông khí, tốc độ khuấy trộn [57]

Có hai kỹ thuật lên men chính trong sinh tổng hợp CoQ10 ở vi khuẩn, đó là lên men gián đoạn và lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng Tùy theo đặc điểm từng quá trình, nhằm kiểm soát tốt hơn tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành sản phẩm

1.5.1 Lên men gián đoạn

Quá trình lên men trên môi trường lỏng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, bao gồm thành phần môi trường, mức độ và hình thức thông khí, tốc độ khuấy, nồng độ oxy hòa tan, điều kiện nuôi

Hệ thống lên men gián đoạn là một hệ thống khép kín, tại đó các chất dinh dưỡng cần thiết được cung cấp cho sự phát triển của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm ngay từ đầu quá trình lên men Vi sinh vật sau khi được cấy vào hệ thống lên men sẽ tăng trưởng

và phát triển Hệ thống lên men có thể được kiểm soát các thông số như: nhiệt độ, oxy, pH Trong hệ thống lên men gián đoạn, mọi thông số của quá trình lên men đều biến động: nồng độ cơ chất, nồng độ gam sinh khối, nồng độ sản phẩm [57] Tuy vậy, lên men gián đoạn dễ kiểm soát và thường phải sử dụng khi quá trình yêu cầu phải tiệt trùng nghiêm

ngặt Trong quá trình lên men gián đoạn chủng đột biến A tumefaciens KCCM 10413 hàm

lượng CoQ10 thu nhận được là 320 mg/l, hiệu suất đạt 6,61 mg/g sinh khối [34] Cheong

và cộng sự lên men gián đoạn chủng A tumefaciens tái tổ hợp hàm lượng CoQ10 thu được

là 280,2 mg/l, hiệu suất đạt 5,47 mg/g sinh khối [16]

1.5.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dƣỡng (Fed – batch)

Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – bath) hay còn gọi là lên men bán liên tục là dạng lên men nằm giữa lên men gián đoạn và lên men liên tục Trong lên men dạng này, quá trình lên men được khởi động tương tự như lên men gián đoạn, sau một thời gian nhất định, chất dinh dưỡng sẽ được bổ sung vào trong hệ thống lên men Fed-batch có thể được thực hiện nhiều cách khác nhau: thay thế hoàn toàn môi trường dinh dưỡng của canh trường (tiến hành lên men đạt đến mức độ nhất định-bao gồm dinh dưỡng trong môi trường được tiêu thụ - môi trường cũ sẽ được rút ra và thay vào đó môi trường mới với đầy

đủ các chất dinh dưỡng mới; hoặc bổ sung thêm vào hệ thống lên men chất dinh dưỡng mới nhằm mục đích giữ cho sinh khối của vi sinh vật trong hệ thống lên men ở trạng thái

ổn định khi sinh khối tế bào đạt đến một giới hạn nhất định nào đó Chiến lược này cho phép vi sinh vật phát triển với một tốc độ tăng trưởng như mong muốn, hạn chế tối đa sự tạo thành các sản phẩm phụ không mong muốn, và cho phép đạt được mật độ tế bào cao và

nồng độ sản phẩm lớn Trong quá trình lên men chủng đột biến A tumefaciens KCCM

10413, đường sucrose được bổ sung trong lên men bán liên tục làm tăng hàm lượng

CoQ10 (458 mg/l) so với lên men gián đoạn là 320 mg/l [34] Đối với A tumefaciens tái

tổ hợp quá trình lên men fed-batch có bổ sung đường sucrose cho CoQ10 đạt 352,6 mg/l

gấp 1,25 lần so với quá trình lên men gián đoạn đạt 280,2 mg/l [16] Trong khi đó chủng E

coli tái tổ hợp có chứa gen dps mã hóa cho decaprenyl diphosphatte synthase từ Gluconobacter suboxydans trong quá trình lên men gián đoạn có bổ sụng đường glucose

cho hàm lượng CoQ10 vượt trội so với lên men gián đoạn (25,5 mg/l so với 0,97 mg/l) [73]

Vì vậy, lên men fed-batch vượt trội hơn so với lên men gián đoạn, vì nó cho phép duy trì được mật độ tế bào mong muốn và sản xuất sản phẩm lớn mà không tạo ra các sản phẩm

ức chế cho quá trình lên men

1.6 TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10

1.6.1 Tách chiết Coenzyme Q10

1.6.1.1 Phương pháp tách chiết sử dụng phương pháp phá vỡ tế bào bằng tác nhân cơ học

 Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm

Tian (2010) tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng A tumefaciens 1.2554 theo quy

trình: sinh khối sau ly tâm bổ sung đệm 2mM Tris HCl (pH 7.5), tiến hành siêu âm (12 giây on, 10 giây off) năng lượng sóng siêu âm 500W, tổng thời gian siêu âm 12 phút Thể tích nước sử dụng là 40 mL/g sinh khối Bổ sung Petroleum ether tỉ lệ 1:1, vortex thu pha trên, lặp lại bước chiết 2 lần Tiến hành làm khô, hòa tan CoQ10 trong 100% ethanol [90]

 Phá vỡ tế bào bằng hạt thủy tinh

Yoshida cũng tiến hành thu nhận CoQ10 từ 3 chủng vi khuẩn A tumefaciens

Y-3085 (ATCC4452), P denitrificans KY-3940 (ATCC19367) và R sphaeroides KY-4113

(FERM-P4675) bằng phương pháp như sau: 5 ml dịch nuôi cấy vi sinh vật bổ sung 6 ml

n-propanol, 10 ml n-hexane và 5 g hạt thủy tinh được khuấy trộn 15,000 rpm trong 5 phút để chiết xuất CoQ10 từ tế bào Chiết xuất 2 lần bằng 3 ml hexane, làm khô và hòa tan trong dioxane [99]

1.6.1.2 Phương pháp tách chiết sử dụng phương pháp phá vỡ tế bào không bằng tác nhân cơ học

 Tách chiết bằng dung môi Prafull Ranadive và cộng sự (2011) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng

Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490 20 ml dịch nuôi được ly tâm 1000 vòng/phút trong

20 phút để thu sinh khối Để chiết CoQ10, sinh khối được bổ sung 20 ml 100% ethanol lắc trong nước 60o

C trong 3 giờ Tế bào được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm và thu dịch, ethanol được chiết lại với 20 ml n-hexane Thu lấy pha n-hexane có chứa CoQ10, cô đặc tới 1 ml và đưa vào sắc ký để định lượng [75]

Narendra và cộng sự tiến hành thu nhận CoQ10 từ S cerevisiae như sau: sinh khối

ướt tế bào được ủ với ethanol tỷ lệ (1:5) ở 60o

C trong 1 giờ Chiết xuất lặp lại 3 lần bằng hexane [66]

n-Theo Kiên (2010) CoQ10 từ R sphaeroides đột biến được thu nhận theo phương

pháp sau: 10 g sinh khối ướt được hòa trong 70 ml methanol, ủ 55oC trong 5 phút Bổ sung

140 ml chloroform và khuấy ở 30oC trong 20 phút, sau đó được lọc qua giấy lọc (Whatman no.1) Bổ sung NaCl (0.58%, w/v) bằng 1/5 so với thể tích dịch lọc Dịch lọc và dung dịch muối NaCl được đảo trộn, để yên, thu pha dưới, làm khô và hòa tan lại trong ethanol [67]

 Tách chiết bằng axit kết hợp với dung môi

CoQ10 được tách chiết từ S pombe theo phương pháp biến đổi của Cheng và cộng

sự Các tế bào được xử lý với 3M HCl, khuấy ở 90oC trong 80 phút Sau khi bổ sung dung dịch NaOH để duy trì pH 7, tế bào được chiết ở nhiệt độ phòng trong 2,5 giờ với acetone Hỗn hợp này được ly tâm và thu pha trên, làm khô bằng bay hơi chân không ở 30o

C Hòa tan CoQ10 trong petroleum ether [15]

Tian (2010) cũng tiến hành nghiên cứu phá vỡ tế bào bằng axit HCl Thí nghiệm được thực hiện như sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung axit HCl 3M với tỷ lệ 10.8 ml/g sinh khối, ủ 85oC trong 35 phút Bổ sung petroleum ether (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), vortex thu pha trên, lặp lại bước chiết 2 lần Tiến hành làm khô, hòa tan CoQ10 trong ethanol [90]

 Phương pháp phá vỡ tế bào bằng enzyme

Theo Ha và cộng sự (2007b), khi thực hiện với chủng A tumefaciens KCCM 10413

sinh khối được bổ sung dung dịch ly giải tế bào Cellytic B, ủ 30 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi propanol và n-hexane (3:5) vào dịch ly giải tế bào và khuấy mạnh Chiết thu pha trên sau đó đem cô đặc, hòa tan trong ethanol [34]

Dung giải bằng enzym cũng được Zahiri và cộng sự lựa chọn Lysozym thường thủy phân liên kết β (1-4) glucosid của các peptidoglucan vốn tạo ra độ cứng cho tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm Lysozym thường được liên kết với EDTA để tạo phức với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysacarit và phá hủy tế bào đặc biệt là vỏ tế bào vi

khuẩn gram âm Nhóm nghiên cứu tách CoQ10 từ các tế bào E coli tái tổ hợp theo phương

pháp sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung dung dịch ly giải tế bào [8% sucrose, 5%, Triton

X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA (pH 8.0) và 1 mg/ml of lysozym] ủ 37oC trong 30 phút Bổ sung n-hexane: n-propanol (5:3) (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), thu pha trên, lặp lại bước chiết 2 lần Cô đặc, và hòa tan sản phẩm trong ethanol [102]

Theo Choi (2005), tế bào A tumefaciens ATCC4452 được thu bằng ly tâm 13,000

rpm Sau đó được rửa bằng nước vô trùng và rửa lại bằng đệm 20 mM Tris-Cl (pH 7.5) Tế bào được hòa tan trong 450 µl Cell Lytic B trộn với 50 µl lysozyme (10 mg/ml) và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút Để chiết xuất CoQ10, 900 µl hexane và n-propanol (5:3) được bổ sung vào 500 µl dịch phân giải tế bào Sau đó vortex trong 5 phút, thu pha trên, bổ sung 600 µl hỗn hợp dung môi để chiết xuất lần nữa Làm khô dung môi trong 120 phút, hòa tan bằng 100% ethanol Park (2005) và Zhang D (2007) cũng tiến hành thu nhận

CoQ10 từ E coli tái tổ hợp theo phương pháp trên [73, 104]

1.6.2 Tinh sạch Coenzyme Q10

CoQ10 được sản xuất theo một trong 3 phương thức như sau: tách chiết từ mô động vật, sinh khối vi sinh vật và tổng hợp hóa học Quá trình sản xuất được thực hiện bởi các bước tách chiết phức tạp sử dụng các dung môi hữu cơ khác nhau và tinh sạch Quá trình tinh sạch có thể được thực hiện bằng phương pháp chiết với dung môi, sắc ký hấp phụ trên cột silica và tái kết tinh,… Cao và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phương pháp sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) Một hệ dung môi hai pha khan bao gồm heptane-acetonitrile-dichloromethane (12:7:3.5; v/v/v) được lựa chọn cho phân tích HSCCC và được sử dụng để tinh sạch CoQ10 từ 500 mg dịch chiết thô Hiệu suất tinh sạch đạt được là

130 mg với độ tinh sạch HPLC đạt được là 99% Hiệu suất tinh sạch (bao gồm % tinh

sạch, % thu hồi) bằng phương pháp HSCCC cao hơn so với phương pháp sắc ký cột Tuy nhiên, phương pháp HSCCC đã sử dụng các dung môi độc như dichloromethane và được thực hiện bởi một thiết bị đặc biệt chuyên dụng [11] Đối với phương pháp chiết pha rắn đây là một phương pháp dùng để làm sạch và cô đặc các hợp chất Rodriguez-Acuna và cộng sự (2008) đã công bố kết quả tinh sạch CoQ9 và CoQ10 từ dầu thực vật bằng phương pháp sử dụng chất nền SPE aminopropyl sử dụng hệ dung môi rửa giải heptanes:ethyl ether (80:20, v/v) Kỹ thuật này có thể loại bỏ triacylglycerides [78] Hagerman và cộng sự

(2001) đã sử dụng SPE để tinh sạch CoQ6 từ Saccharomyces cerevisiae (nấm men bia)

bằng cách sử dụng silica gel như là một chất hấp phụ và hỗn hợp dichloromethane và hexane (2.5:1, v/v) làm hệ dung môi rửa giải Tinh sạch pha rắn này có thể loại bỏ ergosterol và các dẫn xuất ergosterol và giảm thời gian lưu trong quá trình phân tích từ 70 phút xuống còn 15 phút [35] Silica gel cũng đã được sử dụng để nghiên cứu tinh sạch các hợp chất ubiquinone như CoQ9, CoQ10 trong canh trường nuôi cấy tế bào thực vật sau khi được chiết với chloroform và methanol [39]

Sắc ký cột thường được sử dụng với nhiều ưu điểm để tinh sạch lượng nhỏ hỗn hợp hữu cơ Nguyên lý của nó là dựa vào phân đoạn cấu tử cần phân tích giữa pha cố định và pha linh động Hiệu quả phân tách phụ thuộc vào kiểu chất hấp phụ và hệ dung môi Đối với việc chọn một dung môi sử dụng làm dung môi rửa giải, cần phải xem xét đến khả năng hòa tan của các cấu tử phân tách trong dung môi đó và việc dễ dàng loại bỏ nó ở giai đoạn sau Các phân đoạn sau khi được rửa giải thường được đo bằng UV hoặc ánh sáng thường và sắc ký bản mỏng thường được sử dụng để xác định các thành phần trong đó

1.6.3 Đặc tính của Coenzyme Q10

1.6.3.1 Bảo quản Coenzyme Q10

CoQ10 rất nhạy cảm với ánh sáng [26, 98] Vì vậy, để bảo quản CoQ10 cần tránh ánh sáng trong suốt quá trình sản xuất và lưu giữ Để cải thiện độ hòa tan, độ bền với ánh sáng

và một số đặc tính của CoQ10 đã có rất nhiều những nghiên cứu bao gồm bao gói CoQ10 trong carbohydrate như gum arabic, β – cylodextrin và ϒ – clyclodextrin [10, 27, 98], kết hợp với poly (methyl methacrylate), trong hạt nano [48] và dạng thuốc bán nhũ tương hóa CoQ10 [70] Dạng đóng gói siêu vi CoQ10 trong gum arabic được tiến hành với dầu dừa

và muối sodium stearoyl lactylate sử dụng như là chất nhũ hóa trong khi dạng bao gói CoQ10 với cyclodextrins được tiến hành tạo phức với nước Dạng thuốc bán nhũ tương hóa CoQ10 được chuẩn bị bằng cách sấy phun hệ nhũ hóa gồm CoQ10, glycerin, este của

đường sucrose với axit béo và hyroxypropyl cellulose Tuy nhiên việc sử dụng cyclodextrin như là một chất ổn định dường như là một phương pháp đầy hứa hẹn để bảo quản CoQ10 một cách dễ dàng và đầy hiệu quả

 β – cyclodextrin

β – cyclodextrin là hợp chất được tạo thành từ các phân tử đường liên kết với nhau trong một vòng cyclic oligosaccharides β – cyclodextrin gồm 7 đơn vị α-D-glucopyranoside liên kết tạo thành [7, 92]

Hình 1.5.Cấu tạo của β – cyclodextrin

 Ứng dụng của β – cyclodextrin

β – cyclodextrin có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm cũng như thực phẩm Trong công nghiệp thực phẩm, β – cyclodextrin giúp ổn định các hợp chất dễ bay hơi, giảm mùi hôi và khẩu vị không mong muốn Phức β – cyclodextrin với một số carotenoid đã được chứng minh là làm tăng cường màu sắc, làm tăng độ hòa tan trong nước và cải thiện sự ổn định ánh sáng β – cyclodextrin còn được sử dụng để loại bỏ cholesterol Trong công nghê dược và thực phẩm chức năng, do có cấu tạo hình nón, bên trong kị nước, bên ngoài ưa nước nên β – cyclodextrin có thể tạo phức với các hợp chất kị nước Do đó, có thể nâng cao khả năng hòa tan và hoạt tính sinh học của các hợp chất [7,

27, 92]

1.6.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo Kommuru và cộng sự (2001) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính của CoQ10 trong vòng 16 tháng ở các nhiệt độ 37, 45 và 55oC Kết quả thu được là ở nhiệt độ 45 và 55oC có tổn thất CoQ10, trong khi CoQ10 tương đối ổn định ở 37o

C Kommuru cho rằng CoQ10 khá ổn định ở nhiệt độ phòng CoQ10 vẫn còn 90% hoạt tính

sau 6,3 năm [44]

Fir và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10 Kết quả cho thấy ở nhiệt độ cao 80oC và giữ trong tối sau 92 giờ hàm lượng CoQ10 bị tổn thất 3,7% Còn theo dõi ở điều kiện nhiệt độ phòng nhóm tác giả thấy rằng hàm lượng CoQ10 hầu như không thay đổi

Trong khi đó khi CoQ10 được tạo phức với cyclodextrin thì độ bền của CoQ10 tăng lên nhiều so với CoQ10 tinh khiết Sau 120 phút ở nhiệt độ 80oC và bị chiếu sáng bởi tia cực tím CoQ10 tinh khiết bị phá hủy khoảng 72,3% trong khi đó với việc tạo phức với ϒ – cyclodextrin CoQ10 chỉ bị phá hủy khoảng 35,1% CoQ10 được bảo vệ tốt nhất khi tạo phức với β – cylodextrin, hàm lượng CoQ10 bị tổn thất chỉ khoảng 20% khi có sự kết hợp chiếu sáng UV và ở nhiệt độ cao [27]

1.6.3.3 Ảnh hưởng của ánh sáng

Trong nghiên cứu của Fir và cộng sự về độ bền của CoQ10 dưới ánh sáng của tia cực tím, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng CoQ10 bị phá hủy 27,7% dưới ánh sáng của tia cực tím sau 120 phút ở nhiệt độ phòng Trong khi CoQ10 tạo phức với β-cyclodextrin thì CoQ10 gần như không bị tổn thất dưới tác dụng của tia cực tím ở nhiệt độ phòng Tuy nhiên ở nhiệt độ 80oC khoảng 72,3% CoQ10 bị tổn thất dưới tác dụng của tia cực tím Một

số nghiên cứu trước đây cũng cho thấy CoQ10 bị nhạy cảm với ánh sáng và bị phân hủy đến 80% sau 15 ngày chiếu sáng bởi ánh sáng tự nhiên Molyneux (2006) cho rằng CoQ10

bị nhạy cảm với ánh sáng và bị phân hủy gần như hoàn toàn sau 24 giờ tiếp xúc với ánh sáng (ánh sáng huỳnh quang), trong khi đó CoQ10 được bảo vệ tránh ánh sáng (gói trong giấy nhôm) thì hàm lượng không thay đổi Vì vậy cần bảo vệ mẫu khỏi ánh sáng trong quá trình tách chiết là rất cần thiết Khi tiến hành định lượng CoQ10 có thể được tiến hành trong điều kiện ánh sáng bình thường của phòng thí nghiệm với thời gian không quá 2 giờ [63]

1.6.3.4 Tính hòa tan

CoQ10 không tan trong nước, chỉ tan trong dung môi hữu cơ Vì vậy, nhằm mục đích cải thiện tính hòa tan trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo phức CoQ10 với cyclodextrin Fir và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu khả năng hòa tan của CoQ10 với β, ϒ-

cyclodextrin tại các giá trị pH từ 2 – 6.5 Kết quả cho thấy khả năng hòa tan tương đối cao

của CoQ10 tạo phức β, ϒ- cyclodextrin ở pH 6,5 và ở nhiệt độ 37o

Chủng đột biến A tumefaciens AU-55 có thể sản sinh 180 mg CoQ10/l dịch lên men trong 58 giờ với hàm lượng CoQ10 là 4,5 mg/g sinh khối khô Chủng đột biến R

sphaeroides Co-22-11 có thể sản xuất CoQ10 được 346,8 mg/l với hàm lượng 8,7 mg/g

sinh khối khô dưới điều kiện thông khí giới hạn [99]

Một số chủng đột biến khác như R sphaeroides KACC 91339P [67], R radiobacter,

S johnsonii -ATCC 20490 [75], A tumefaciens PK38 cũng cải thiện đáng kể hàm lượng

CoQ10 trong quá trình lên men [101]

Chủng đột biến A tumefaciens ATCC 4452 cho hàm lượng CoQ10 cao hơn và giảm

độ nhớt do sự hình thành các polysaccharides sau khi tiến hành tối ưu hóa quá trình sản xuất CoQ10 với nồng độ đường 8%, 0.16 – 0,26% amoni, nhiệt độ 32 – 34o

C, O2 0,84 mmol/l/1 phút Hàm lượng CoQ10 thu được đạt 66 mg/l tương ứng 3,2 mg/g sinh khối khô.[46]

1.7.2 Chủng tái tổ hợp

Để đáp ứng nhu cầu ứng dụng CoQ10 đang gia tăng mạnh, bên cạnh việc nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng tự nhiên hoặc chủng đột biến bằng

các biện pháp thay đổi điều kiện lên men, đột biến hóa học, một giải pháp có hiệu quả là tạo các chủng tái tổ hợp Trình tự nguyên vẹn hoặc cải biến của các gen tăng cường quá trình tổng hợp CoQ10 được đưa vào vật chủ không sinh độc tố, đã được nghiên cứu kỹ các đặc tính và dễ dàng điều khiển quá trình biểu hiện gene ngoại lai Phương pháp đang được nghiên cứu nhiều là đưa các gen mã hóa các enzym chìa khóa của quá trình tổng hợp CoQ10 vào các chủng vi sinh vật tái tổ hợp

Một số chiến lược cải biến di truyền để nâng cao khả năng sinh tổng hợp CoQ10 ở vi sinh vật như sau:

Hình 1.6 Các phương pháp điều khiển trao đổi chất để tăng sản xuất CoQ10 ở vi sinh vật [30]

Tăng cường biểu hiện gen

ubi

Tăng cường biểu

hiện gen pHBA

1.7.2.1 Điều khiển trao đổi chất để tăng hàm lượng CoQ10 ở E coli

Hầu hết các nghiên cứu để điều khiển con đường sinh CoQ10 được tập trung vào E

coli vì vi khuẩn này rất phù hợp cho cải biến di truyền và lên men quy mô lớn (bảng 1.2)

Các enzym DPS và DXS được xem là các enzym quan trọng để sinh tổng hợp CoQ10 thông qua con đường MEP

Quá trình tăng sự biểu hiện DXS làm tăng cường isopentenyl diphosphate (IPP) – tiền chất IPP synthase và FPP synthase thúc đẩy sinh tổng hợp tất cả E-FPP, là cơ chất allylic của DPS, enzym điều khiển tổng hợp chiều dài chuỗi isoprene và cung cấp đuôi kỵ nước

dài pHBA:polyprenyltransferase kết hợp với các nhóm đầu, đuôi và chuyển sản phẩm

phản ứng tới màng Sự tăng cường biểu hiện hoạt tính của các enzym này và các chiều hướng trao đổi chất sẽ là điều kiện thuận lợi cho các phương pháp sinh học trong hệ thống sinh tổng hợp CoQ10 Ngoài ra một số thao tác di truyền có thể được thực hiện để sản xuất

CoQ10 trong E coli tái tổ hợp: Biểu hiện tăng lên DPS từ các vi sinh vật sản xuất CoQ10,

ngừng biểu hiện octaprenyl diphosphate synthase (IspB) và biểu hiện tăng các gen của con đường MEP hoặc MVA

 Biểu hiện DPS ở E coli Enzyme DPS xúc tác phản ứng tổng hợp tiền chất IPP với allylic diphosphate là một enzym quan trọng trong sinh tổng hợp đuôi decaprenyl ở CoQ10 Gen dps mã hóa cho enzyme decaprenyl diphosphate synthase đã được thu nhận từ vi khuẩn, nấm men: S

pombe, G suboxydans, R radiobacter, Rhodobacter capsulatus B10 [43, 68, 86, 102] và

A tumefaciens, G suboxydans, Leucosporidium scotti, P denitrificans [50, 54, 86, 87]

Hầu hết các enzym DPS có sự tương đồng 30-50% với các polyprenyl diphosphate synthase khác Việc đưa gen mã hóa cho DPS được tách dòng từ một vi sinh vật sản xuất

CoQ10 là chiến lược chính được sử dụng để tạo biến chủng E coli sản xuất CoQ10 Chiều

dài của đuôi isoprenoid của CoQ10 xác định bởi polyprenyl diphosphate synthase có mặt

trong sinh vật chủ này [69] Ở E coli, enzym octaprenyl diphosphate synthase (IspB) xúc

tác sự hình thành của octaprenyl diphosphate và lượng nhỏ hơn các prenyl diphosphate

ngắn hơn Theo đó, dạng CoQ chính có mặt ở E coli là CoQ8, và một số dạng nhỏ hơn từ CoQ1 đến CoQ7 E coli biểu hiện DPS của P denitrificans (PdDPS) sản xuất CoQ10, bên

cạnh sản xuất CoQ8 Hơn nữa, tỷ lệ sản xuất CoQ10:CoQ8 phụ thuộc vào mức độ biểu

hiện của PdDPS [87] Do đó, các chủng E coli biểu hiện DPS ngoại lai sản sinh CoQ10,

bên cạnh việc sản xuất ở nhiều mức độ khác nhau CoQ8 và CoQ9, phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của DPS Tuy nhiên, DPS của những vi khuẩn nhất định cho thấy sự đặc hiệu

hơn hướng tới decaprenyl diphosphate Ví dụ, khi DPS từ R sphaeroides được biểu hiện ở

E coli, nó thể hiện tính đặc hiệu cao hơn hướng tới decaprenyl diphosphate so với DPS từ

A tumefaciens [102] Vì thế, việc tách dòng các enzym DPS với tính đặc hiệu sản phẩm

tuyệt đối, với mục tiêu thu được các chủng E coli tái tổ hợp có khả năng sinh CoQ10 cao,

có thể là phương pháp tốt để tăng sản lượng CoQ10 Gần đây, các nghiên cứu quá trình lên

men trong sản xuất CoQ10 được thực hiện với E coli tái tổ hợp chứa dps từ G

suboxydans [73] Lên men gián đoạn với lượng glucose hạn chế thu được nồng độ cuối

cùng: 103 g/L, 255 mg/l CoQ10, và 0,29 mg CoQ10/g sinh khối Lượng ít thành phần CoQ10 đặc hiệu này có thể được cải thiện bằng việc sử dụng kỹ thuật điều khiển trao đổi chất của các con đường tổng hợp tiền chất Hai phương pháp được nghiên cứu: Tăng chiều

tạo thành các tiền chất isoprenoid và tăng biểu hiện các gen ubi được lựa chọn tham gia vào con đường sinh tổng hợp CoQ [102, 107] Sản xuất CoQ10 cũng được báo cáo ở E

coli tái tổ hợp mang gen dps từ A tumefaciens [102]

Gen dps và dxs cũng được thu nhận đồng thời từ R radiobacter, G suboxydans, P

aeruginosa và đồng biểu hiện trong làm tăng hàm lượng CoQ10 đạt 46,1 mg/l trong điều

kiện lên men fed – bath

 Tăng biểu hiện các gen của con đường MEP ở E coli

Một phương pháp khác để tăng sản xuất CoQ10 trong E coli tái tổ hợp là đồng biểu

hiện enzym DXS, xúc tác cho phản ứng tổng hợp giữa glyxcraldehyde-3-phosphate (GAP)

và pyruvate Phản ứng này là bước đầu tiên của con đường MEP ở E coli DXS thực hiện

một vai trò điều hòa quan trọng trong con đường MEP để tổng hợp tiền chất IPP Có nhiều nghiên cứu chứng minh sự tăng lên đáng kể hàm lượng CoQ10 bằng cách tăng biểu hiện DXS, nên việc tăng lượng IPP thông qua đồng biểu hiện DXS được mong đợi làm tăng quá trình sản xuất CoQ10, mà sử dụng IPP như là một tiền chất để tổng hợp mạch nhánh

CoQ10 Để tăng hàm lượng CoQ10, DXS của Pseudomonas aeruginosa được đồng biểu hiện trong một chủng E coli tái tổ hợp, đồng thời mang gen dps từ G suboxydans Sự biểu hiện gen dps này làm chuyển hóa hoàn toàn IPP ở E coli Sự tăng lên của lượng enzyme DXS thông qua biểu hiện gene dxs của P aeruginosa đã tạo ra lượng IPP gấp xấp xỉ 2 lần

lượng IPP đã chuyển hóa và làm tăng hàm lượng CoQ10 Nồng độ CoQ10 lớn nhất (46,1

mg/l) đạt được từ nhân nuôi gián đoạn với lượng hạn chế glucose của chủng E coli tái tổ hợp biểu hiện đồng thời 2 gen dps và dxs [43]

 Biểu hiện các gene con đường MVA ngoại lai vào E coli

Do E coli chỉ có khả năng tổng hợp CoQ10 theo con đường MEP nên có một chiến

lược mới làm tăng cường khả năng sản xuất CoQ10 đó là đưa các gene ngoại lai của con

đường MVA vào E coli MVA là một chất trung gian quan trọng trong con đường MVA

và nó không được sản xuất hay sử dụng bởi chủng E coli tự nhiên Việc thêm vào con đường MVA có lợi thế làm tăng nguồn cung cấp IPP trong các chủng E coli tái tổ hợp sản

xuất CoQ10 này Toàn bộ con đường MVA được phân chia thành con đường MVA trên

và dưới Con đường MVA dưới chuyển MVA thành IPP và DMAPP thông qua 4 bước xúc tác enzym với MVA kinase, phospho-MVA kinase, MVA diphosphate decarboxylase và IPP isomerase Con đường MVA trên biến đổi 3 phân tử acetyl-CoA thành MVA trong 3 bước xúc tác enzym với acetyl-CoA thiolase, HMG-CoA synthase, và HMG-CoA

reductase Yoon và cộng sự (2006) đã kết luận rằng sản xuất lycopene ở E coli tăng vài lần khi sử dụng con đường MVA dưới của S pneumoniae với nguồn bổ sung bên ngoài MVA

Zahiri và cộng sự (2006) chỉ ra rằng việc thêm vào một con đường MVA ngoại lai làm

tăng nguồn cung IPP ở các chủng E coli sản xuất CoQ10 Nửa dưới con đường MVA của

S aureus, S pyogenes, S pneumoniae, Enterococcus faecalis, và S cerevisiae đã được

kiểm tra Con đường này của S pneumoniae tạo ra sản lượng CoQ10 là 2,70 mg/g sinh

khối khô khi được bổ sung 3 mM MVA ngoại lai Nửa con đường trên của vi khuẩn này được sử dụng để tạo nên con đường MVA hoàn chỉnh Con đường MVA ngoại lai này có thể chuyển acetyl-CoA nội sinh thành IPP, dẫn đến sự sản xuất CoQ10 với sản lượng lên

tới 2,43 mg/g sinh khối khô, không cần bổ sung MVA ở E coli DH5α tái tổ hợp chứa 3 plasmid mã hóa cho các enzym của con đường MVA trên (phbA, mvaS và mvaA) và dưới (mvaK1, mvaK2, và mvaD cùng với idi) và DPS Ngược lại, một con đường MVA đầy đủ

được cấu trúc trong một operon đơn kém hiệu quả hơn với sản lượng CoQ10 lên tới 1,71

mg/g sinh khối khô, cao hơn 1,9 lần so với khi sử dụng một gene dps Chủng E coli tái tổ

hợp này sản xuất CoQ10 và lượng nhỏ CoQ9, bên cạnh lượng CoQ8 xuất hiện tự nhiên CoQ9 được sản xuất có thể là kết quả của sự giải phóng chưa hoàn toàn một đoạn của các

chuỗi polyprenyl đang kéo dài từ DPS của A tumefaciens

Một số gen mã hóa cho các enzyme trong quá trình tổng hợp mạch nhánh CoQ10 theo

con đường MVA (Mevalonate pathway) như mvaK1, mvaD, mvaK2 được thu nhận từ vi khuẩn như S aureus , S pneumoniae, S pyogenes và nấm men như S cerevisiae được kết hợp với gen idd đã được biểu hiện đồng thời trong E coli cho hàm lượng CoQ10 đạt 2700

µg /g sinh khối Trong khi đó gen phbA được thu nhận từ Ralstonia eutropha ATCC 43123

kết hợp với gen mvaA, mvaS được thu nhận từ S pneumonia được biểu hiện trong E coli

cho hàm lượng CoQ10 thấp hơn đạt 2,4 mg / g sinh khối Tuy nhiên, với việc đưa đồng

thời tất cả các gen mvaK1, mvaD, mvaK2, idd, phbA và gen mvaA, mvaS vào vector

pSTV28 biểu hiện trong E coli hàm lượng CoQ10 chỉ đạt 1,7 mg/ g sinh khối [102]

Gần đây, Choi và cs (2009) đã kết luận rằng loại bỏ gen ispB và tăng cường biểu hiện gene dps từ A tumefaciens làm giảm thiểu sự sản xuất các CoQ khác và do đó cải thiện

hàm lượng CoQ10 của E coli tái tổ hợp Hơn nữa, đồng biểu hiện gen dxs làm tăng thành

phần đặc hiệu của CoQ10 từ 0,55-0,89 mg/g sinh khối khô thành 1,40 mg/g sinh khối khô

Lên men gián đoạn E coli BL21(DE3)_ispB/pAP1 + pDXS được thực hiện ở một môi

trường xác định để sản xuất lượng lớn CoQ10 pAP1 là một vector biểu hiện gen dps Cuối

cùng, nồng độ CoQ10 là 99,4 mg/l, hàm lượng CoQ10 là 1,41 mg/g sinh khối khô và sản

lượng là 3,11 mg/l/h thu được sau lên men 33 giờ [17]

 Tăng biểu hiện các gen của con đường chorismate

Zhu và cộng sự (1995) đã làm tăng quá trình sản xuất CoQ ở E coli bằng cách tăng biểu hiện gen ubiA và ispB E coli mang các plasmid chứa ubiAC và ispB hoặc chứa CoQ2

và ispB sản xuất CoQ nhiều hơn so với chủng tự nhiên [107] Barker và Frost (2001) đã

chứng minh một sản lượng cao pHBA ở E coli tái tổ hợp bằng cách tăng cường lượng

carbon thành pHBA thông qua sự tăng biểu hiện của các enzym con đường chorismate,

trong khi loại bỏ sự sản xuất các axit amin thơm, mà cạnh tranh các tiền chất giống hệt

Chiến lược này tạo ra lượng pHBA cao hơn so với mức bình thường của E.coli [8]

Bảng 1.2 Chủng chủ và hệ biểu hiện vi khuẩn được dùng để sinh tổng hợp CoQ10

T7 promoter, lac

E coli DH5α mvaK1, mvaD,

T7 promoter

[83]

E coli DH5α phbA Ralstonia eutropha ATCC

43123

pBBR1MCS2

E coli DH5α mvaK1, mvaD,

mvaK2, mvaA, mvaS ,phbA, idd

1.7.2.2 Điều khiển trao đổi chất để tăng hàm lượng CoQ10 ở A tumefaciens

Bước quan trọng nhất trong quá trình tổng hợp CoQ10 ở con đường MEP (Non – Mevalonate pathway) được coi là bước tổng hợp DPS (decaprenyl diphosphate synthase)-

mạch nhánh của CoQ10 Hơn nữa, DXS (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase) cũng

tham gia quá trình tạo isopentenyl diphosphate- một tiền chất quan trọng để tạo nên mạch

nhánh CoQ10 Vì vậy, để nâng cao năng suất của CoQ10, cần phải đưa hai gene biểu hiện

dps và dxs vào tế bào vật chủ Nếu chỉ tăng biểu hiện của gen dxs sẽ tạo ra đồng thời

CoQ8, CoQ9 do vậy khó cho quá trình tinh sạch Vì vậy một trong những hướng nghiên

cứu triển vọng để tăng cường hàm lượng CoQ10 và thuận lợi cho quá trình tinh sạch

CoQ10 sau này đó là đồng biểu hiện gen dps và dxs trong tế bào chủ A tumefaciens

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tạo chủng E coli tái tổ hợp mang ít nhất một trong hai gen dps và dxs [43, 79] Tuy nhiên, hàm lượng CoQ10 ở các chủng E coli tái tổ hợp

thường rất thấp (0,3 mg/g sinh khối khô) so với hàm lượng được sản xuất bởi các chủng vi

sinh khác như P denitrificans (0,86 mg/g sinh khối khô), R sphaeroides (2,6 mg/g sinh

khối khô) và A radiobacter (2,6 mg/g sinh khối khô) Ngoài ra, các chủng E coli tái tổ

hợp không chỉ tổng hợp CoQ10 mà còn tổng hợp cả CoQ8 và CoQ9 Đây là điều bất lợi

đặc biệt là khi sản xuất ở quy mô công nghiệp vì cần rất nhiều bước tinh sạch và hoàn

thiện sản phẩm [41, 50, 52]

A tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được quan tâm để sản xuất CoQ10

do có nhiều ưu điểm Sự tăng biểu hiện trực tiếp của các enzym quan trọng này trong

chủng công nghiệp này là cần thiết để sản xuất lượng lớn CoQ10 Sự tăng biểu hiện DXS ở

A tumefaciens có thể cải thiện quá trình sản xuất CoQ10 do IPP là một tiền chất quan

trọng trong sản xuất CoQ10 và DXS là enzym bước đầu tiên để tổng hợp IPP ở vi khuẩn

Lee và cộng sự (2004) cho rằng rằng sự tăng biểu hiện của gen dxs ở A tumefaciens

KCCM 10413 mang lại hàm lượng CoQ10 (502,4 mg/l) và năng suất CoQ10 là 8,3 mg/g

sinh khối khô, cao hơn 21,9% và 23,9% tương ứng so với A tumefaciens hoang dại DXS

dường như tạo thành một bước có ảnh hưởng trong sinh tổng hợp CoQ10 của A

tumefaciens, với sự sản xuất CoQ10 hiệu quả đầy tiềm năng bởi kỹ thuật điều khiển trao

đổi chất ở A tumefaciens [50]

Các báo cáo về sản xuất CoQ10 ở các biến chủng E coli biểu hiện DPS từ các vi

khuẩn khác cho thấy rằng lượng CoQ8 hoặc CoQ9 khác nhau cũng được sản xuất cùng với

CoQ10 phụ thuộc vào sự biểu hiện DPS [87, 102], điều này làm cho việc sản xuất CoQ10

và các quá trình tinh sạch từ E coli tái tổ hợp trở nên không kinh tế Do đó, một chiến lược

tốt hơn là tăng biểu hiện đồng thời của các gen dxs và dps ở một chủng sinh CoQ10

Vector biểu hiện pGPRX chứa các gen dps và dxs của A tumefaciens được thiết kế và biến

nạp vào A tumefaciens sản xuất CoQ10 Các điều kiện nhân nuôi của A tumefaciens

pGPRX như nhiệt độ, pH, không khí, và tốc độ khuấy được tối ưu hóa để sản xuất CoQ10

nhiều nhất Với nồng độ tối ưu của cao ngô, ammonium sulfate, và oxy hòa tan, nồng độ

CoQ10 cao nhất 744,2 mg/l đạt được với thành phần CoQ10 đặc hiệu là 11,4 mg/g sinh

khối khô Chính vì vậy, A tumefaciens là vi sinh vật chủ sản xuất CoQ10 trong công

nghiệp đầy triển vọng

CoQ10

Ghi chú (Điều kiện nuôi cấy)

Cerevisiae, mvaA, mvaS,

E coli DH5 α mvaK1, mvaD,

mvaK2,mvaA, mvaS, phbA, idd

1,7mg/ g sinh khối

Bình tam giác [102

]

phbA

G suboxydans,

P aeruginosa

E.coli DH5α ddsA, dxp 46,1 mg/l Fed-bath [43]

G suboxydans E.coli DH5α ddsA 26 mg/l Fed-bath [73]

dps, dxs 0,94 mg/g

gấp 2,1 so với 1 gen ddsA

1.7.2.3 Điều khiển trao đổi chất để tăng hàm lượng CoQ10 ở nấm men

Nấm men S pombe cũng được sử dụng cho quá trình biểu hiện gen hmgR mã hóa

(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMG-CoA reductase) để sản xuất CoQ10

Vectơ sử dụng cho quá trình biểu hiện là pREPG có chứa promoter Pnmt1, terminator

Tnmt1 và marker LEU2 Promoter nmt1 cảm ứng bằng thiamine trong suốt quá trình nuôi

cấy Kết quả hàm lượng CoQ10 tăng lên đến 2,68 và 3,09 lần ở các chủng nấm men tái tổ

hợp khi không có và có bổ sung axit arachidonic Điều này cũng chứng minh axit

arachidonic có thể điều khiển các hoạt động của HMG-CoA reductase và gen hmgR đóng

vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp CoQ10 [15]

1.8 VAI TRÕ VÀ ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10

CoQ10 được tìm thấy ở hầu hết các mô của con người nhưng với hàm lượng khác nhau, bao gồm cả tim, thận và gan [71] Hơn nữa từ những nghiên cứu đã được công bố,

nhiều nhà khoa học cho rằng sự suy giảm CoQ10 trong cơ thể con người có ảnh hưởng tới

tuổi thọ, một số bệnh mãn tính như bệnh tim mạch, ung thư, AIDS và một số bệnh di

truyền như bệnh thần kinh, bệnh bại liệt [23, 71, 72] Do đó sự bổ sung CoQ10 từ các

nguồn thực phẩm hoặc bổ sung trực tiếp là một điều hết sức cần thiết để duy trì sức khỏe

1.8.1 Vai trò của Coenzyme Q10

1.8.1.1 Vận chuyển điện tử và cung cấp năng lượng

Vai trò quan trọng nhất của coenzyme Q10 là vận chuyển điện tử giữa phức hợp I và

II, phức hợp II và III trong chuỗi vận chuyển điện tử, mà sản phẩm cuối cùng là adenosine

triphosphate (ATP) Quá trình này thường được gọi là sự hô hấp

Cả dạng khử (quinol) và dạng ôxi hóa (quinone) của coenzyme Q có thể di chuyển dễ dàng trong lớp màng lipid Mỗi lượt coenzyme Q lấy một điện tử từ phức hợp I hoặc II và phân tán vào trong lớp màng ti thể cho đến khi va chạm với phức hợp III - lúc đó điện tử lại được chuyển cho phức hợp III Chính sự khuếch tán của CoQ cùng với Cytochrome C trong lớp màng ti thể đã đóng vai trò quan trọng trong việc luân chuyển các điện tử đến các phức hợp kế nhau trong chuỗi chuyển điện tử [63]

Hình 1.6 Chuỗi vận chuyển điện tử

1.8.1.2 Chức năng chống oxy hóa

Ngoài vai trò quan trọng trong việc sản sinh năng lượng theo yêu cầu, CoQ10 còn là một trong các chất chống oxy hoá tự nhiên được tìm thấy trong thiên nhiên CoQ10H2 là chất chống oxy hóa chỉ hòa tan trong lipid được tổng hợp trong các mô động vật invivo CoQ10H2 có thể hoạt động như một chất chống oxy hóa trực tiếp bằng cách chống lại tia

UV, ngăn ngừa sự peoroxy hóa lipid ty thể, hoặc gián tiếp, bằng cách tái chế α-tocopherol (vitamin E) Bên cạnh đó, CoQ10 bảo vệ protein và các axit nucleic (DNA, RNA) khỏi sự tiêu hủy của các gốc tự do CoQ10 cũng ức chế collagenase- một loại enzyme phá hủy các

mô liên kết của da [29, 63]

Weber và cộng sự (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc uống 90 mg CoQ10/ngày tới khả năng chống oxy hóa trên các đối tượng khỏe mạnh Họ đã chỉ ra rằng uống CoQ10 có thể làm giảm tốc độ của các phản ứng oxy hóa [94] Theo Papas (1999) chức năng oxy hóa của coenzyme Q10 xảy ra theo hai cơ chế sau:

- Chống oxy hóa dây chuyền và làm giảm các gốc peroxyl (ROO*) và alcoxyl

CoQH + ROO* → Q* + ROOH

- CoQ10 tương tác với gốc tự do vitamin E thông qua một phản ứng oxy hóa khử do đó

có khả năng tái tạo vitamin E và vitamin C cũng tương tự như thế

CoQH + TO* → Q* + TOH Vai trò dọn dẹp gốc tự do trong cơ thể sống của CoQ10 kém hiệu quả hơn so với vitamin, tuy nhiên vai trò của coenzyme Q10 là một chất chống oxy hóa có khả năng tái tạo vitamin E thực tế mới là quan trọng hơn [72] Quinn và Fabisiak (1999) đã đề xuất vai trò tiềm năng của CoQ10 trong việc tái tạo vitamin E diễn ra trong chuỗi vận chuyển điện

tử [74]

1.8.1.3 Truyền dẫn tín hiệu trong các tế bào

Sự tự oxy hóa của dạng trung gian CoQ10 được hình thành trong các màng tế bào trong suốt quá trình vận chuyển điện tử có thể là một cơ sở chính cho sự hình thành hydro peroxide. H2O2 kích hoạt các yếu tố phiên mã như NFKB tạo ra quá trình biểu hiện gen Peroxide cũng có thể tham gia vào truyền tín hiệu canxi trong cơ tim Nó cũng có thể gây

ra các phản ứng oxy hóa dẫn đến ức chế các gen khác [22, 29, 56]

1.8.2 Ứng dụng của Coenzyme Q10

1.8.2.1 Ứng dụng trong y học

 Giảm nguy cơ về bệnh tim mạch

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng lợi ích của việc bổ sung CoQ10 giúp cải thiện chức năng của tim mạch thông qua tăng cường sản xuất năng lượng, cải thiện sự co bóp của cơ tim và đặc biệt ngăn ngừa sự oxy hóa của lipoprotein LDL (Cholesterol xấu) Yalcin và cộng sự (2004) đã chỉ ra mối liên quan giữa nồng độ CoQ10 trong huyết tương thấp và bệnh động mạch vành, vì họ thấy rằng nồng độ CoQ10 ở những bệnh nhân bị bệnh động mạch vành (0.43 μmol/L) thấp hơn so với nhóm kiểm chứng (0.77 μmol/L) [97] Munkholm và cộng sự (1999) đã điều trị bệnh nhân bị suy tim sung huyết với CoQ10 200 mg/ngày và thấy rằng có thể làm giảm nguy cơ về bệnh tim mạch [65] Langsjoen và cộng

sự (1999) cho rằng việc duy trì nồng độ CoQ10 trong huyết tương (> 3.5 μg/mL) cùng với cách bổ sung CoQ10 có thể cải thiện chức năng của tim [49] Ngoài ra, Conklin (2000) cũng chứng minh trong quá trình hóa trị liệu, bệnh nhân cần được cung cấp coenzyme Q10 bổ sung để ngăn chặn doxorubicin gây ra các bệnh về tim [20] Nghiên cứu cũng cho thấy khi sử dụng CoQ10 kết hợp với fenofibrate làm giảm đáng

kể huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương, giảm glycosylated hemoglobin (HbA1C), cải