phân lập và tuyển chọn vi khuẩn probiotic từ sữa người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ SỮA NGƯỜI CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN PHƯỚC HIỀN MSSV: 3102812 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ SỮA NGƯỜI CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN PHƯỚC HIỀN MSSV: 3102812 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT KÝ TÊN HỘI ĐỒNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Phước Hiền DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT CẢM TẠ Trong suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ động viên từ quý Thầy Cô bạn sinh viên Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất: Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo toàn thể quý Thầy Cô Viện NC & PT Công nghệ Sinh học tận tình giảng dạy, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập nghiên cứu. Tôi xin gửi lời tri ân đến Phó giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, người thầy tận tình hướng dẫn giúp đỡ nhiều từ trình học tập đến nghiên cứu hoàn thành đề tài khoa học. Tôi xin chân thành cám ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu - cố vấn học tập bạn lớp Công nghệ sinh học K36, Vi sinh vật K36 Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật giúp đỡ nhiều trình học tập thực luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Trần Trà My, chị Nguyễn Thị Thúy Duy tất anh chị học viên cao học K18, K19, anh chị sinh viên lớp Công nghệ sinh học K34, K35 tiên tiến bạn sinh viên thực đề tài Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, giúp đỡ động viên suốt thời gian thực đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh Đạt - Bác sĩ Bệnh viện Đa khoa TPCT chị Liêng - Y tá Khoa sản, bệnh viện Đa khoa TPCT, tạo điều kiện thuận lợi cho trình thu thập mẫu bệnh viện. Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến cha mẹ người thân gia đình động viên tạo điều kiện cho hoàn thành chương trình Đại học. Cần Thơ, ngày 22 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Phước Hiền Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Hai mươi sáu dòng vi khuẩn phân lập môi trường MRS, có 23 dòng phân lập từ sữa người thu bệnh viện đa khoa Thành phố Cần Thơ, dòng từ chế phẩm Bioacimin dòng từ chế phẩm Probio. Phần lớn dòng vi khuẩn phân lập có hình thái khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, màu sắc trắng đục đến trắng sữa, có dòng Probi H7.1 có dạng bìa chia thùy. Trong tổng số dòng vi khuẩn, có 10 dòng dạng que 16 dòng dạng cầu tồn dạng đơn, kết đôi hay kết dạng chùm. Tất dòng vi khuẩn Gram dương, kết thử nghiệm oxidase âm tính, khả chuyển động, có 14 dòng có kết thử nghiệm catalase âm tính, bao gồm dòng Bio1.2 Bio2.1 có nguồn gốc từ chế phẩm Bioacimin dòng Probi từ chế phẩm Probio. Mười bốn dòng vi khuẩn lactic chọn để tiếp tục khảo sát khả chống chịu pH thấp kháng thuốc kháng sinh. Kết khảo sát cho thấy tất chịu môi trường pH giờ. Ba dòng Bio2.1, H1.4 H3.4 có khả kháng loại kháng sinh Penicillin V, Streptomycin Cephalexin nồng độ 256mg/l. Kết so sánh trình tự dòng H3.4 đồng hình với trình tự DNA loài Enterococcus faecium dòng BAB-1371 (KF535138.1) với tỷ lệ 99%. Từ khóa: Kháng kháng sinh, pH thấp, probiotic, sữa người, vi khuẩn acid lactic. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG CẢM TẠ . TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG viii DANH SÁCH HÌNH .ix TỪ VIẾT TẮT xi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .1 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài .2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .3 2.1. Tổng quan probiotic .3 2.1.1. Lịch sử phát triển probiotic .3 2.1.2 Khái niệm probiotic .3 2.1.3. Các dạng số chế phẩm chứa probiotic a) Các dạng chế phẩm chứa probiotic b) Một số chế phẩm probiotic 2.2. Lợi ích tiềm vi khuẩn probiotic 2.2.1. Trong y tế dinh dưỡng a) Điều hoà hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh .7 b) Cải thiện tăng cường miễn dịch, giảm viêm c) Phòng chống ung thư ruột kết .8 d) Hỗ trợ tiêu hoá điều khiển trình không dung nạp lactose e) Giảm cholesterol .9 2.2.2. Trong nuôi trồng thuỷ sản môi trường 2.2.3. Trong chăn nuôi - thú y .11 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.3. Các nhóm vi khuẩn có tiềm probiotic .11 2.3.1. Nhóm vi khuẩn Lactobacillus .12 a) Đặc điểm chung 12 b) Một số loài điển hình 12 2.3.2. Nhóm vi khuẩn Bifidobacterium .13 a) Đặc điểm chung 13 b) Một số loài điển hình 13 2.3.3. Nhóm vi khuẩn Streptococcus .14 a) Đặc điểm chung 14 b) Một số loài điển hình 14 2.3.4. Nhóm vi khuẩn Enterococcus .15 a) Đặc điểm chung 15 b) Một số loài điển hình 15 2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn probiotic 16 2.4.1. Ảnh hưởng nguồn carbon dinh dưỡng 16 a) Nhu cầu carbon .16 b) Nhu cầu nitrogen 16 c) Nhu cầu vitamin 16 2.4.2. Ảnh hưởng nồng độ oxygen 17 2.4.3. Ảnh hưởng nhiệt độ 17 2.4.4. Ảnh hưởng pH 17 2.4.5. Ảnh hưởng chất kháng sinh 18 2.5. Vai trò sữa mẹ .18 2.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn probiotic nước 20 2.6.1. Nghiên cứu nước .20 2.6.2. Nghiên cứu nước .20 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT 3.1. Phương tiện nghiên cứu 23 3.1.1. Địa điểm thời gian thực 23 a) Địa điểm thực 23 b) Thời gian 23 3.1.2. Nguyên vật liệu .23 3.1.3. Dụng cụ thiết bị 23 3.1.4. Hóa chất môi trường .24 3.2. Phương pháp nghiên cứu 25 3.2.1. Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 25 a) Mẫu sữa người 25 b) Mẫu chế phẩm men tiêu hóa đông khô 25 3.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn probiotic .25 a) Chuẩn bị môi trường .26 b) Phân lập từ mẫu sữa người 26 c) Phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa .26 d) Nhận diện dạng khuẩn lạc nhóm vi khuẩn lactic .27 e) Tách ròng vi khuẩn .27 f) Trữ mẫu để kiểm tra độ ròng .27 g) Kiểm tra độ ròng vi khuẩn 28 3.2.3. Thí nghiệm 1: Khảo sát đặc tính sinh học .28 a) Mô tả hình dạng chuyển động 28 b) Đo kích thước tế bào vi sinh vật 28 c) Nhuộm Gram 29 d) Kiểm tra diện enzyme catalase .30 e) Kiểm tra diện enzyme oxidase 31 3.2.4. Thí nghiệm 2: So sánh đánh giá khả chống chịu môi trường pH thấp 31 a) Mục đích .31 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT b) Phương pháp tiến hành .32 3.2.5. Thí nghiệm 3: So sánh đánh giá khả kháng thuốc kháng sinh .33 a) Mục đích .33 b) Phương pháp tiến hành .33 3.2.6. Thí nghiệm 4: Nhận diện loài kỹ thuật sinh học phân tử .34 3.2.7. Phân tích xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 4.1. Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập 35 4.1.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa .35 4.1.2. Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa người 35 4.1.3. Kết giá trị pH mẫu sữa người .37 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc đặc tính sinh hóa .37 4.2.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa .37 4.2.2. Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa người 40 4.3. Đặc điểm tế bào khả chuyển động 43 4.3.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa .43 4.3.2. Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa người 44 4.4. Kết so sánh đánh giá khả chống chịu môi trường pH thấp 46 4.4.1. Kết mật số (logCFU/ml) dòng vi khuẩn pH 6,4 .47 4.4.2. Kết giá trị OD600nm dòng vi khuẩn pH 6,4 49 4.4.3. Kết mật số (logCFU/ml) dòng vi khuẩn pH 51 4.4.4. Kết giá trị OD600nm dòng vi khuẩn pH .53 4.5. So sánh đánh giá khả kháng thuốc kháng sinh 55 4.5.1. Kháng sinh Penicillin V 55 4.5.2. Kháng sinh Streptomycin 58 4.5.3. Kháng sinh Cephalexin .60 4.6. Nhận diện dòng vi khuẩn phân lập kỹ thuật sinh học phân tử 63 4.6.1. Khuếch đại DNA kỹ thuật PCR 63 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT 4.6.2. Giải trình tự gene 16S -rDNA .63 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .66 5.1. Kết luận 66 5.2. Đề nghị .66 TÀI LIỆU THAM KHẢO .67 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh thí nghiệm 1. Hình thái khuẩn lạc tế bào dòng phân lập 1.1. Các dòng phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 1.2. Các dòng phân lập từ sữa người 2. Hình ảnh thử nghiệm sinh hóa 3. Hình ảnh thí nghiệm so sánh đánh giá khả kháng pH thấp 3.1. Các dòng phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 3.2. Các dòng phân lập từ sữa người 4. Hình ảnh thí nghiệm so sánh đánh giá khả kháng thuốc kháng sinh 4.1. Các dòng phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 4.2. Các dòng phân lập từ sữa người 5. Ảnh thiết bị, dụng cụ hóa chất thí nghiệm Phụ lục 2: Các phương pháp thí nghiệm 1. Phương pháp pha loãng mẫu 1.1. Nguyên tắc 1.2. Quy trình thực 2. Phương pháp giọt ép 2.1. Nguyên tắc 2.2. Phương pháp tiến hành 3. Xác định mật số vi sinh vật phương pháp đếm sống 3.1. Nguyên tắc 3.2. Quy trình thực Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT n) Dòng H10.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.0000256 0.0000085 0.11 0.954 Error 0.0006407 0.0000801 Total 11 0.0006662 S = 0.008949 R-Sq = 3.84% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 0.616667 A 3h 0.615333 A 1h 0.614333 A 2h 0.612667 A 2.2. Kết thống kê giá trị mật số (logCFU/ml) pH 6,4 a) Dòng Bio1.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.000326 0.000109 0.23 0.872 Error 0.003754 0.000469 Total 11 0.004080 S = 0.02166 R-Sq = 7.99% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 8.87309 A 3h 8.87267 A 1h 8.86484 A 2h 8.86085 A b) Dòng Bio2.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.000845 0.000282 0.59 0.637 Error 0.003800 0.000475 Total 11 0.004644 S = 0.02179 R-Sq = 18.18% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 8.90649 A 1h 8.89490 A 3h 8.88824 A 2h 8.88438 A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT c) Dòng Probi One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF Factor Error Total 11 S = 0.2184 SS MS 0.0363 0.0121 0.3815 0.0477 0.4178 R-Sq = 8.68% F 0.25 P 0.857 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 2h 7.8198 A 1h 7.8198 A 3h 7.7347 A 0h 7.6931 A d) Dòng H1.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.00010 0.00003 0.03 0.994 Error 0.01032 0.00129 Total 11 0.01042 S = 0.03592 R-Sq = 0.93% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 1h 8.80428 A 2h 8.80158 A 0h 8.80031 A 3h 8.79638 A e) Dòng H3.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.000154 0.000051 0.07 0.975 Error 0.006047 0.000756 Total 11 0.006201 S = 0.02749 R-Sq = 2.48% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 3h 8.81036 A 0h 8.80948 A 1h 8.80575 A 2h 8.80129 A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT f) Dòng H6.3 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.000034 0.000011 0.01 0.998 Error 0.007352 0.000919 Total 11 0.007386 S = 0.03032 R-Sq = 0.46% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 8.82793 A 1h 8.82741 A 3h 8.82686 A 2h 8.82361 A g) Dòng H7.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF Factor Error Total 11 S = 0.1017 SS MS 0.0103 0.0034 0.0827 0.0103 0.0930 R-Sq = 11.11% F 0.33 P 0.802 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 2h 7.7195 A 0h 7.7195 A 3h 7.6608 A 1h 7.6608 A h) Dòng H9.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.00005 0.00002 0.01 0.998 Error 0.01137 0.00142 Total 11 0.01142 S = 0.03771 R-Sq = 0.43% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 8.76765 A 2h 8.76585 A 3h 8.76292 A 1h 8.76292 A i) Dòng H9.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000054 0.006093 0.006147 MS 0.000018 0.000762 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học F 0.02 P 0.995 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 S = 0.02760 R-Sq = 0.88% Trường ĐHCT R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 8.79638 A 1h 8.79611 A 3h 8.79224 A 2h 8.79179 A j) Dòng H9.3 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.000107 0.000036 0.04 0.990 Error 0.007802 0.000975 Total 11 0.007909 S = 0.03123 R-Sq = 1.35% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 1h 8.80981 A 3h 8.80604 A 0h 8.80428 A 2h 8.80158 A k) Dòng H9.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.000046 0.000015 0.03 0.991 Error 0.003634 0.000454 Total 11 0.003680 S = 0.02131 R-Sq = 1.25% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 3h 8.79224 A 0h 8.79195 A 1h 8.79179 A 2h 8.78749 A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT l) Dòng H9.5 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.00006 0.00002 0.02 0.996 Error 0.00891 0.00111 Total 11 0.00897 S = 0.03337 R-Sq = 0.67% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 8.81496 A 2h 8.81343 A 1h 8.81049 A 3h 8.80936 A m) Dòng H9.6 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.000132 0.000044 0.05 0.983 Error 0.006594 0.000824 Total 11 0.006726 S = 0.02871 R-Sq = 1.96% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 8.81007 A 1h 8.80576 A 2h 8.80561 A 3h 8.80071 A n) Dòng H10.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.000161 0.000054 0.07 0.976 Error 0.006424 0.000803 Total 11 0.006585 S = 0.02834 R-Sq = 2.44% R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 2h 8.81901 A 0h 8.81426 A 3h 8.81049 A 1h 8.80981 A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.3. Kết thống kê giá trị OD600nm pH a) Dòng Bio1.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.003461 0.000844 0.004305 S = 0.01027 MS 0.001154 0.000106 R-Sq = 80.39% F 10.93 P 0.003 R-Sq(adj) = 73.04% Grouping Information Using Tukey Method 0h 2h 3h 1h N 3 3 Mean 0.58500 0.56067 0.54377 0.54333 Grouping A A B B B b) Dòng Bio2.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0002149 0.0001000 0.0003149 S = 0.003536 MS 0.0000716 0.0000125 R-Sq = 68.25% F 5.73 P 0.022 R-Sq(adj) = 56.34% Grouping Information Using Tukey Method 3h 2h 0h 1h N 3 3 Mean 0.605333 0.601667 0.597000 0.594333 Grouping A A B A B B Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT c) Dòng Probi One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0157709 0.0003120 0.0160829 S = 0.006245 MS 0.0052570 0.0000390 R-Sq = 98.06% F 134.79 P 0.000 R-Sq(adj) = 97.33% Grouping Information Using Tukey Method 2h 1h 0h 3h N 3 3 Mean 1.07767 0.99600 0.99367 0.99233 Grouping A B B B d) Dòng H1.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000428 0.001393 0.001821 S = 0.01319 MS 0.000143 0.000174 R-Sq = 23.52% F 0.82 P 0.518 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 2h 3h 1h 0h N 3 3 Mean 0.61267 0.60867 0.60833 0.59667 Grouping A A A A e) Dòng H3.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.0007082 0.0002361 11.52 0.003 Error 0.0001640 0.0000205 Total 11 0.0008722 S = 0.004528 R-Sq = 81.20% R-Sq(adj) = 74.15% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 2h 0.610000 A 3h 0.607333 A B 0h 0.596333 B C 1h 0.591333 C Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT f) Dòng H6.3 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.001402 0.000467 2.45 0.138 Error 0.001524 0.000191 Total 11 0.002926 S = 0.01380 R-Sq = 47.91% R-Sq(adj) = 28.38% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 1h 0.64567 A 0h 0.64333 A 2h 0.62533 A 3h 0.62100 A g) Dòng H7.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS Factor 0.01152 0.00384 Error 0.01741 0.00218 Total 11 0.02893 S = 0.04665 R-Sq = 39.82% F 1.76 P 0.231 R-Sq(adj) = 17.26% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 2h 1.05767 A 0h 1.03133 A 1h 1.01500 A 3h 0.97233 A h) Dòng H9.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.005537 0.001846 10.30 0.004 Error 0.001433 0.000179 Total 11 0.006970 S = 0.01339 R-Sq = 79.44% R-Sq(adj) = 71.73% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 0.61800 A 1h 0.60300 A B 2h 0.57133 B C 3h 0.56667 C Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT i) Dòng H9.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source DF SS MS F P Factor 0.001785 0.000595 5.22 0.027 Error 0.000912 0.000114 Total 11 0.002697 S = 0.01068 R-Sq = 66.18% R-Sq(adj) = 53.50% Grouping Information Using Tukey Method N Mean Grouping 0h 0.41967 A 1h 0.40433 A B 3h 0.39467 A B 2h 0.38700 B j) Dòng H9.3 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.006233 0.001050 0.007283 S = 0.01146 MS 0.002078 0.000131 R-Sq = 85.58% F 15.83 P 0.001 R-Sq(adj) = 80.18% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 0.60800 0.59567 0.56433 0.55167 Grouping A A B B k) Dòng H9.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0061897 0.0001433 0.0063330 S = 0.004233 MS 0.0020632 0.0000179 R-Sq = 97.74% F 115.16 P 0.000 R-Sq(adj) = 96.89% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 0.626000 0.603000 0.576667 0.568333 Grouping A B C C Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT l) Dòng H9.5 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0091470 0.0004027 0.0095497 S = 0.007095 MS 0.0030490 0.0000503 R-Sq = 95.78% F 60.58 P 0.000 R-Sq(adj) = 94.20% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 0.621667 0.608667 0.588333 0.548667 Grouping A A B C m) Dòng H9.6 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.009203 0.001137 0.010340 S = 0.01192 MS 0.003068 0.000142 R-Sq = 89.00% F 21.58 P 0.000 R-Sq(adj) = 84.88% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 0.63400 0.60000 0.58467 0.55733 Grouping A B B C C Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT n) Dòng H10.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0083363 0.0004473 0.0087837 S = 0.007478 MS 0.0027788 0.0000559 R-Sq = 94.91% F 49.69 P 0.000 R-Sq(adj) = 93.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 0.578333 0.542000 0.515333 0.513000 Grouping A B C C 2.4. Kết thống kê giá trị mật số (logCFU/ml) pH a) Dòng Bio1.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.035792 0.005667 0.041459 S = 0.02661 MS 0.011931 0.000708 R-Sq = 86.33% F 16.84 P 0.001 R-Sq(adj) = 81.21% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 3h 2h N 3 3 Mean 8.94766 8.88438 8.81859 8.81426 Grouping A A B B C C b) Dòng Bio2.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 S = 0.03967 SS 0.00459 0.01259 0.01719 MS 0.00153 0.00157 R-Sq = 26.73% F 0.97 P 0.452 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 8.81036 8.80129 8.77611 8.76125 Trường ĐHCT Grouping A A A A c) Dòng Probi One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.01857 0.07836 0.09693 S = 0.09897 MS 0.00619 0.00980 R-Sq = 19.15% F 0.63 P 0.615 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 7.92605 7.89375 7.86144 7.81980 Grouping A A A A d) Dòng H1.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.062721 0.006670 0.069390 S = 0.02887 MS 0.020907 0.000834 R-Sq = 90.39% F 25.08 P 0.000 R-Sq(adj) = 86.78% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 9.02776 8.90956 8.89082 8.82793 Grouping A B B C C e) Dòng H3.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 S = 0.04351 SS 0.05741 0.01514 0.07256 MS 0.01914 0.00189 R-Sq = 79.13% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học F 10.11 P 0.004 R-Sq(adj) = 71.30% Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 9.00523 8.85510 8.84359 8.83943 Grouping A B B B f) Dòng H6.3 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.005742 0.004221 0.009963 S = 0.02297 MS 0.001914 0.000528 R-Sq = 57.63% F 3.63 P 0.064 R-Sq(adj) = 41.75% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 8.98812 8.98452 8.97910 8.93394 Grouping A A A A g) Dòng H7.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 S = 0.1230 SS 0.0323 0.1209 0.1533 MS 0.0108 0.0151 R-Sq = 21.09% F 0.71 P 0.571 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 7.9354 7.8937 7.8614 7.7934 Grouping A A A A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT h) Dòng H9.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.032134 0.003880 0.036014 S = 0.02202 MS 0.010711 0.000485 R-Sq = 89.23% F 22.09 P 0.000 R-Sq(adj) = 85.19% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 9.05425 8.99655 8.97266 8.90989 Grouping A B B C i) Dòng H9.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.019167 0.002485 0.021652 S = 0.01762 MS 0.006389 0.000311 R-Sq = 88.52% F 20.57 P 0.000 R-Sq(adj) = 84.22% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 8.92736 8.86505 8.83671 8.82361 Grouping A B B B j) Dòng H9.3 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.003063 0.007379 0.010441 S = 0.03037 MS 0.001021 0.000922 R-Sq = 29.33% F 1.11 P 0.401 R-Sq(adj) = 2.83% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h N 3 Mean 9.03207 9.02683 Grouping A A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 2h 3h 3 9.01136 8.99098 Trường ĐHCT A A k) Dòng H9.4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.001250 0.003329 0.004580 S = 0.02040 MS 0.000417 0.000416 R-Sq = 27.30% F 1.00 P 0.441 R-Sq(adj) = 0.04% Grouping Information Using Tukey Method 1h 0h 2h 3h N 3 3 Mean 9.03067 9.03011 9.02234 9.00539 Grouping A A A A l) Dòng H9.5 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.007506 0.004490 0.011996 S = 0.02369 MS 0.002502 0.000561 R-Sq = 62.57% F 4.46 P 0.040 R-Sq(adj) = 48.54% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 9.04619 9.03831 9.02525 8.98147 Grouping A A B A B B m) Dòng H9.6 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 S = 0.02605 SS 0.001469 0.005428 0.006897 MS 0.000490 0.000678 R-Sq = 21.30% F 0.72 P 0.567 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 9.04321 9.03776 9.03588 9.01417 Trường ĐHCT Grouping A A A A n) Dòng H10.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.014687 0.004597 0.019284 S = 0.02397 MS 0.004896 0.000575 R-Sq = 76.16% F 8.52 P 0.007 R-Sq(adj) = 67.22% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 8.90273 8.88009 8.82769 8.81941 Grouping A A B B B Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... nhiều và phân lập nguồn vi khuẩn probiotic từ sữa động vật mà trọng tâm là sữa người Vi c ứng dụng các tiềm năng của vi khuẩn probiotic hiện nay chưa thật sự phổ biến và mang lại hiệu quả thiết thực, đặc biệt là trên người Vì vậy, vi c nghiên cứu “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ SỮA NGƯỜI” được tiến hành nhằm khảo sát các đặc tính probiotic của nhóm vi khuẩn này Từ đó, tuyển chọn. .. loài vi sinh vật thường xuất hiện trong các sản phẩm probiotic 16 Bảng 2: Các loài vi khuẩn thường được phân lập từ sữa người 19 Bảng 3: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập từ men tiêu hóa .35 Bảng 4: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa người 36 Bảng 5: Giá trị thống kê pH các mẫu sữa người 37 Bảng 6: Hình dạng, kích thước khuẩn lạc và các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn. .. phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 38 Bảng 7: Hình dạng, kích thước khuẩn lạc và các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa người 40 Bảng 8: Hình dạng tế bào, khả năng chuyển động và đặc điểm Gram của các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 43 Bảng 9: Hình dạng tế bào, khả năng chuyển động và đặc điểm Gram của các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa người. .. Martin đã phân lập vi khuẩn acid lactic từ sữa của 8 bà mẹ khỏe mạnh và phân của họ Họ đã xác định vi khuẩn acid lactic bằng máy phân tích trình tự 16S-rDNA Kết quả họ đã xác định vi khuẩn phân lập từ sữa người như Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Enterococcus faecium Những loài này được coi là một trong các vi khuẩn probiotic và chứa các chủng được sử dụng trong các sản phẩm probiotic. .. (2003), đã tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic là chủng YHN77 và YHN99 Hai chủng này có thể ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic nhằm thay thế kháng sinh cho lợn con giai đoạn sau cai sữa Ngô Thị Phương Dung et al (2011) đã phân lập vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men và sản phẩm men tiêu hóa đông khô Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn lactic và kiểm tra tính kháng khuẩn. .. lập từ men tiêu hóa so với dòng H2.2 (dương tính) .39 Hình 9: Kết quả thử nghiệm oxidase âm tính của các dòng phân lập từ men tiêu hóa: Bio1.2 (A), Bio2.1 (B) và Probi (C) 39 Hình 10: Hình thái khuẩn lạc một số dòng vi khuẩn phân lập từ sữa người: H3.4 (A), H5.1 (B), H7.1 (C) và H9.1 (D) 41 Hình 11: Kết quả thử nghiệm catalase của một số dòng phân lập từ sữa người (A) và. .. dòng vi khuẩn phân lập giữa các mốc thời gian khác nhau ở pH 6,4 .48 Bảng 11: Kết quả so sánh mật số vi khuẩn (logCFU/ml) các dòng vi khuẩn phân lập giữa các mốc thời gian khác nhau ở pH 3 51 Bảng 12: Khả năng kháng kháng sinh Penicillin V của các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa động vật và chế phẩm men tiêu hóa .56 Bảng 13: Khả năng kháng kháng sinh Streptomycin của các dòng vi khuẩn. .. phẩm probiotic trên thị trường Heikkila và Saris đã khảo sát hoạt động kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus của vi khuẩn phân lập từ sữa người vào năm 2003 Họ đã xác định các vi khuẩn bằng các kỹ thuật phân tử khác nhau và đặt tên như là khuẩn tụ cầu, liên cầu và nhóm vi khuẩn lactic như Lactobacillus crispatus, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis và Leuonostoc mesenteroides, Enterococcus... các vi khuẩn kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus và đi đến kết luận rằng vi khuẩn trong sữa mẹ có một vai trò quan trọng trong vi c bảo vệ trẻ sơ sinh và mẹ đối với Staphylococcus aureus Năm 2004, Martin et al đã nghiên cứu trên ba dòng Lactobacillus phân lập từ sữa mẹ, xem chúng là vi khuẩn probiotic tiềm năng Họ đã thực hiện một số thử nghiệm điều tra một số tiêu chí cần phải có ở vi khuẩn probiotic. .. khỏe và có khả năng tăng cường tuổi thọ Năm 1917, Alfred Nissle đã phân lập một chủng không gây bệnh của vi khuẩn Escherichia coli từ phân của một người lính trong Thế chiến I và ông đã dùng chủng vi khuẩn này chữa lành các bệnh do vi khuẩn Salmonella và Shigella Năm 1935, người ta đã phát hiện một số chủng là Lactobacillus acidophilus có hoạt tính mạnh khi đưa vào hệ tiêu hoá của người Thuật ngữ " probiotics . Ảnh hưởng của nồng độ oxygen 17 2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 17 2.4.4. Ảnh hưởng của pH 17 2.4.5. Ảnh hưởng của chất kháng sinh 18 2.5. Vai trò của sữa mẹ 18 2.6. Tình hình nghiên cứu về. Kiểm tra độ ròng của vi khuẩn 28 3.2.3. Thí nghiệm 1: Khảo sát các đặc tính sinh học 28 a) Mô tả hình dạng và sự chuyển động 28 b) Đo kích thước tế bào vi sinh vật 28 c) Nhuộm Gram 29 d) Kiểm. hay 1) 128mg/l của dòng H9.2 (A) so với dòng H10.2 (B) 58 Hình 25: Khả năng kháng với kháng sinh Penicillin V (P hay 1) 256mg/l của dòng H1.4 (A) và H3.4 (B) so với dòng Bio2.1 (C) 58 Hình