Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa cao chiết hỗn hợp dược liệu bạch hoa xà thiệt thảo bán chi liên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHU NGỌC PHƯỢNG NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT HỖN HỢP DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO – BÁN CHI LIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHU NGỌC PHƯỢNG NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT HỖN HỢP DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO – BÁN CHI LIÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN THANH NHÃN TS CHUNG KHANG KIỆT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Thanh Nhãn TS Chung Khang Kiệt Các số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khoa học Tác giả luận văn Chu Ngọc Phượng TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa 2019 – 2021 NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT HỖN HỢP DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO – BÁN CHI LIÊN Chu Ngọc Phượng Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Thanh Nhãn TS Chung Khang Kiệt Đặt vấn đề Tại Việt Nam, ước tính có khoảng triệu người bị viêm gan, xơ gan ung thư gan Riêng ung thư gan có tỷ lệ thuộc nhóm cao giới, với 10.000 ca phát năm Từ thực trạng trên, việc nghiên cứu thuốc dân gian có tác dụng bảo vệ gan khỏi yếu tố nguy (rượu bia, thuốc giảm đau) gây viêm gan dẫn đến xơ gan cuối ung thư gan vấn đề cần thiết Bài thuốc có thành phần từ hai dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên (2:1) có sở liệu Từ điển thuốc Việt Nam, thuốc dân gian sử dụng từ lâu có hiệu điều trị bệnh gan Hiện nay, thuốc sử dụng theo cách truyền thống thuốc sắc, gây bất tiện cho việc sử dụng tuân thủ điều trị người bệnh Để đảm bảo an toàn mang lại hiệu điều trị ổn định, việc sản xuất cao phối hợp từ hai dược liệu nhu cầu cấp thiết Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa (Willd), Rubiaceae) Bán chi liên (Scutellaria barbata D Don, Lamiaceae) cung cấp Bệnh viện Y học cổ truyền Thành phố Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu Kiểm nghiệm dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao thơng qua việc sử dụng phần mềm thiết kế Design-Expert v8.02, với mơ hình Optimal Xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết với tiêu chí cảm quan, độ ẩm, giới hạn kim loại nặng, giới hạn vi sinh vật, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, chất chiết methanol, định tính định lượng Từ kết kiểm nghiệm, đề xuất tiêu chuẩn sở cao chiết Kết Xây dựng quy trình định lượng asperulosid dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Ngoài tiêu chuẩn DĐVN V dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo, thêm tiêu định lượng asperulosid Nghiên cứu liên quan nhân biến số lần chiết, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu hiệu suất chiết asperulosid, scutellarin, hiệu suất chiết cao, giá thành sản xuất Từ đó, tối ưu hóa điều kiện chiết xuất dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên Kết thu chiết cao từ Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên với dung môi nước, tỷ lệ dược liệu/dung môi (1:19), chiết lần, thời gian chiết lần Từ kết kiểm nghiệm lô cao chiết đề xuất mức chất lượng phù hợp Kết luận Kiểm nghiệm dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao từ dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên Xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết với tiêu chí cảm quan, độ ẩm, giới hạn kim loại nặng, chất chiết methanol, định tính, định lượng, giới hạn vi sinh vật dư lượng thuốc bảo vệ thực vật Từ khóa Cao chiết, asperulosid, scutellarin, tối ưu hóa, Bạch hoa xà thiệt thảo, Bán chi liên, tiêu chuẩn sở ABSTRACT Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2019-2021 RESEARCH STANDARDIZATION OF AN EXTRACT FROM HEDYOTIS DIFFUSA AND SCUTELLARIA BARBATA Chu Ngoc Phuong Instructor: Assoc.Prof.Ph.D Tran Thanh Nhan Ph.D Chung Khang Kiet Introduction The remedy comprised Hedyotis diffusa and Scutellaria barbata (2:1) has a database in the Dictionary of Vietnamese medicinal plants The remedy has been used for a long time by folk and has effective treatment of liver diseases This study was conducted to establish the quality standards of the extract from the remedy for testing quality and stability assessment Materials and methods Materials: Hedyotis diffusa and Scutellaria barbata were provided by the traditional medicine hospital in Ho Chi Minh city Methods: Test Hedyotis diffusa and Scutellaria barbata Study on the cause-effect relations to optimize the extraction for higher yield Contribute quality standards for the extract’s criteria such as description, loss on drying, heavy metals, pesticide residues, microbiological limit, extraction yield in methanol, quantitation and qualitation From the test results, recommend the quality level of each criteria Results Built and validated the quantitative evaluation method for asperulosid in the Hedyotis diffusa by HPLC Add quantitation in quality standards for Hedyotis diffusa The optimized extraction was optimized as: solvent/material ratio – 19/1; number of cycles – 2; extraction times – 2.06 These findings may be practically useful for quality improvement of extracts from the Hedyotis diffusa and Scutellaria barbata From the test results of batches, recommend the suitable criteria for the extract Conclusion Results of testing for Hedyotis diffusa and Scutellaria barbata The procedure extraction for Hedyotis diffusa and Scutellaria barbata was successfully established Contribute base standards for the extract’s criteria such as description, loss on drying, heavy metals, pesticide residues, microbiological limit, extraction yield in methanol, quantitation and qualitation Key words: The extract, base standards, asperulosid, scutellarin, optimize, Hedyotis diffusa, Scutellaria barbata MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO TỔNG QUAN VỀ BÁN CHI LIÊN 10 TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT 14 MỘT SỐ CHẾ PHẨM CÓ THÀNH PHẦN BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO – BÁN CHI LIÊN 14 PHẦN MỀM THÔNG MINH PHASOLPRO RD 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ 37 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU BÁN CHI LIÊN VÀ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO 37 CHIẾT XUẤT CAO TỪ DƯỢC LIỆU bẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO VÀ BÁN CHI LIÊN 50 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO BB 67 CHƯƠNG BÀN LUẬN 84 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 89 KẾT LUẬN 89 ĐỀ NGHỊ 90 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 PHỤ LỤC 98 i DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ý nghĩa tiếng Việt Chữ tắt Từ nguyên ASP asperulosid AST Aspartate Aminotransferase Aspartate Aminotransferase ALT Alanine Aminotransferase Alanine Aminotransferase Cao chiết từ dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên BB BCL Bán chi liên BHX Bạch hoa xà thiệt thảo DĐVN Dược điển Việt Nam Dược điển Việt Nam DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat EtOH Ethanol Ethanol HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao MAPK Mitogen Activated Protein Kinase Protein kinase hoạt hóa phân bào MDA Malondialdehyde Malondialdehyde MeOH Methanol Methanol PDA Photodiode Array Dãy diod quang SCU scutellarin SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo Tài liệu tham khảo i DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Điều kiện pha động định lượng acid oleanolic acid ursolic Bảng 1.2 Các nghiên cứu định lượng hoạt chất Bạch hoa xà thiệt thảo Bảng 2.3 Tiến hành sắc ký theo điều kiện dung môi 19 Bảng 2.4 Nồng độ chuẩn asperulosid khảo sát tính tuyến tính 21 Bảng 2.5 Độ lặp lại độ hồi phục chấp nhận nồng độ khác 22 Bảng 2.6 Các điều kiện sắc ký khảo sát quy trình định lượng asperulosid scutellarin dịch chiết BB 24 Bảng 2.7 Nồng độ chuẩn asperulosid scutellarin khảo sát tính tuyến tính 25 Bảng 2.8 Ý nghĩa mức biến 27 Bảng 2.9 Đánh giá quy trình chiết xuất cao BB quy mơ kg dược liệu 29 Bảng 2.10 Nồng độ chuẩn asperulosid scutellarin khảo sát tính tuyến tính 33 Bảng 3.11 Kết kiểm nghiệm dược liệu Bán chi liên (toàn - Herba Scutellariae barbatae) 37 Bảng 3.12 Lượng asperulosid chiết với tỷ lệ khối lượng dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo : thể tích methanol khảo sát 40 Bảng 3.13 Chương trình pha động định lượng asperulosid dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo 41 Bảng 3.14 Tính tương thích hệ thống quy trình định lượng asperulosid dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo 42 Bảng 3.15 Tính tuyến tính quy trình định lượng asperulosid dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo 44 Bảng 3.16 Kết xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng asperulosid dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo 45 Bảng 3.17 Độ lặp lại quy trình định lượng asperulosid dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo 46 Bảng 3.18 Độ quy trình định lượng asperulosid dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo 47 Bảng 3.19 Hàm lượng asperulosid dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo 48 Bảng 3.20 Kết kiểm nghiệm dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo (toàn – Herba Hedyotis diffusa) 49 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.9 Giới hạn kim loại nặng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.10 Tiêu chuẩn sở dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO (Herba Hedyotis diffusae) Trang: 1/5 Số: 01-TCCS Soạn thảo Kiểm tra DS CHU NGỌC PHƯỢNG PGS.TS TRẦN THANH NHÃN Chữ ký Tên Chức vụ Ngày Danh sách nơi nhận: Hình thức lưu trữ: Văn số : 01 Tập tin : 01-TCCS file: Tiêu chuẩn sở Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phê duyệt Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO (Herba Hedyotis diffusae) Trang: 2/5 Số: 01-TCCS YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Mô tả Lồi cỏ nhỏ, thân màu nâu nhạt, trịn gốc, thân non có bốn cạnh, mang nhiều cành Lá hình mác thn, dài khoảng 1,5 – 3,5 cm, rộng 1– mm, nhọn đầu, màu xám, dai, gần khơng có cuống, kèm khía cưa đỉnh Hoa mọc đơn độc, đôi nách Hoa nhỏ có đài hình giáo nhọn, ống đài hình cầu Tràng gồm cánh hoa, nhị dính họng ống tràng Quả bế, bầu hạ, cịn đài, hình cầu dẹt đầu, bên có chứa nhiều hạt nhỏ, có góc cạnh 1.2 Vi phẫu Thân: Mặt cẳt ngang gần vuông, góc tù Biểu bì gồm hàng tế bào hình chữ nhật xếp đặn, có tế bào u to thành gai ngắn, mập tẩm silic Mô mềm vỏ gồm đến hàng tế bào thành mỏng xếp lộn xộn; to nhỏ khơng có chứa tinh thể calci oxalat hình kim tụ lại hay rải rác Vịng libe-gỗ cấp uốn lượn theo hình dạng mặt cắt, có mạch gỗ to Mơ mềm ruột cấu tạo tế bào hình trịn thành mỏng gồm khoảng đến hàng tế bào sau khuyết Lá: Biểu bì gồm lớp tế bào hình chữ nhật to, biểu bì gồm lớp tế bào nhỏ hơn, hai có u lồi tẩm silic Mô mêm giậu gồm nhiều lớp tế bào xếp sát biểu bì Tế bào mơ mềm thành mỏng, có tế bào chứa tinh thể calci oxalat hình kim Bó libe-gỗ gân xếp thành hình vịng cung 1.3 Bột Bột có màu nâu Tế bào biểu bì khơng màu thành mỏng, tinh thể calci oxalat hình kim nằm riêng lẻ hay tụ thành bó Mảnh biểu bì có u lồi tẩm silic Sợi có thành dày Mảnh mạch xoắn, mạch điểm 1.4 Định tính Quan sát mỏng ánh sáng thường, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có vị trí màu sắc với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 1.5 Độ ẩm Không 13,0 % 1.6 Tạp chất Khơng q 2,0 % 1.7 Tro tồn phần Không 13,0 % Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO (Herba Hedyotis diffusae) Trang: 3/5 Số: 01-TCCS 1.8 Chất chiết dược liệu Khơng 8,0 % tính theo dược liệu khơ kiệt 1.9 Định lượng Dược liệu phải chứa 0,4 % asperulosid tính theo dược liệu khô kiệt PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Mô tả Quan sát cảm quan, dược liệu phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Vi phẫu Dùng kính hiển vị 2.3 Soi bột Dùng kính hiển vi 2.4 Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN V, phụ lục 5.4) Bản mỏng : Silica gel F254 Dung môi khai triển: CHCl3 – MeOH – H2O (65:35:10, lớp dưới) Dung dịch thử: Cân khoảng 500 mg bột dược liệu methanol 100 % bình định mức 10 ml, siêu âm 10 phút Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan asperulosid methanol (TT) để thu dung dịch có nồng độ 0,01 mg/ml Dung dịch dược liệu đối chiếu: Cân 500 mg bột dược liệu (mẫu chuẩn) chiết mô tả phần dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bảng mỏng 10 μl dung dịch Sau khai triển, lấy mỏng khỏi bình sắc ký, để bay hết dung mơi nhiệt độ phịng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol 96 % (TT) Sấy mỏng 105 oC xuất vết Quan sát mỏng ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải cho vết có vị trí màu sắc với vết sắc ký đồ dung dịch chất đối chiếu dược liệu đối chiếu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Trang: 4/5 DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO Số: 01-TCCS (Herba Hedyotis diffusae) 2.5 Độ ẩm Theo DĐVN V, phụ lục 9.6 (1 g, 105 oC, giờ) 2.6 Tạp chất Theo DĐVN V, phụ lục 12.11 2.7 Tro toàn phần Theo DĐVN V, Phụ lục 9.8 2.8 Chất chiết dược liệu Theo DĐVN V, Phụ lục 12.10 (dùng ethanol 96,0 % (TT) làm dung môi) 2.9 Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V, Phụ lục 5.3) Pha động: Acetonitril (TT) dung dịch H3PO4 0,1 % theo chương trình dung mơi Dung dịch thử: Cân xác khoảng 100 mg dược liệu Bạch hoa xà cho vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Dung dịch đối chiếu: Cân xác khoảng mg asperulosid vào bình định mức 10 ml, thêm ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Điều kiện sắc ký: Cột Phenomenex kích thước (250 x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C18 (5 µm) Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng phát 238 nm Thể tích tiêm mẫu: 10 μl Tốc độ dòng: ml/phút Nhiệt độ cột: 30 oC Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình gradient rửa giải dung môi sau: Thời gian (phút) Acetonitril (% tt/tt) H3PO4 0,1 % (tt/tt) 91 25 91 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO (Herba Hedyotis diffusae) Trang: 5/5 Số: 01-TCCS Tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu dung dịch thử Dựa vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch đối chiếu nồng độ chất đối chiếu, tính hàm lượng asperulosid dược liệu Hàm lượng asperulosid (%) dược liệu tính theo cơng thức: (%) = 𝑆𝑡 × 𝐶 × 25 × a × 100 𝑆𝑐 × 𝑚𝑡 St, Sc : Diện tích pic asperulosid dung dịch thử dung dịch đối chiếu C : Nồng độ dung dịch asperulosid (mg/ml) mt : Khối lượng cân mẫu thử (đã trừ độ ẩm) (mg) a : Hàm lượng asperulosid ĐÓNG GÓI - BẢO QUẢN - HẠN DÙNG - Dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo đóng gói túi kg - Nhãn quy chế - Bảo quản nơi khô mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ không 30 oC, độ ẩm không 75 % Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tiêu chuẩn sở cao chiết từ dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL.15 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT TỪ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO VÀ BÁN CHI LIÊN Trang: 1/6 Số: 02-TCCS Soạn thảo Kiểm tra DS CHU NGỌC PHƯỢNG PGS.TS TRẦN THANH NHÃN Chữ ký Tên Chức vụ Ngày Danh sách nơi nhận: Hình thức lưu trữ: Văn số : 02 Tập tin : 02-TCCS file: Tiêu chuẩn sở Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phê duyệt Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT TỪ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO VÀ BÁN CHI LIÊN Trang: 2/6 Số: 02-TCCS YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.10 Cảm quan Cao lỏng dạng sệt, màu nâu, vị mặn, mùi đặc trưng 1.11 Độ ẩm Từ 30 - 40 % 1.12 Giới hạn kim loại nặng Hàm lượng kim loại chì, cadimi thủy ngân không ppm, ppm 0,1 ppm 1.13 Giới hạn nhiễm khuẩn Tổng số vi sinh vật hiếu khí: Khơng q 104 cfu/g Tổng số nấm men – mốc: Không 102 cfu/g Escherichia coli, Staphylococcus aureus: Khơng có g Salmonella: Khơng có 10 g Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật: Không 102 cfu/g 1.14 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật Khơng phát thuốc bảo vệ thực vật họ clor, phospho, cúc, carbamat (LOQ = 0,01 mg/kg) 1.15 Chất chiết methanol Hàm lượng chất chiết cao không 45 % (kl/kl) 1.16 Định tính Trên sắc ký đồ mẫu thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết chuẩn asperulosid, scutellarin dược liệu đối chiếu Bạch hoa xà thiệt thảo Bán chi liên 1.17 Định lượng Hàm lượng asperulosid scutellarin khơng 0,25 0,5 % tính theo cao chiết (độ ẩm = 0) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT TỪ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO VÀ BÁN CHI LIÊN Trang: 3/6 Số: 02-TCCS PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Cảm quan Đánh giá cảm quan 2.2 Độ ẩm Tiến hành theo DĐVN V, PL 9.4.11, tr PL-200 2.3 Giới hạn kim loại nặng Tiến hành theo phương pháp AOAC 2015.01 2.4 Giới hạn nhiễm khuẩn Tiến hành theo DĐVN V, PL 13.6, tr PL-300 2.5 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật Tiến hành theo phương pháp BS EN 15662:2017 mod.(GC-MS) 2.6 Chất chiết methanol Sấy chén sứ dung tích 100 ml tủ sấy tĩnh 105 oC giờ, lấy cho vào bình hút ẩm 30 phút cân Cân xác 1,0 g cao vào bình định mức 25 ml Thêm 25 ml methanol, đậy kín, cân xác định khối lượng, sau siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, cân xác định lại khối lượng, dùng methanol để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua giấy lọc khơ vào bình hứng khơ thích hợp Lấy xác 10 ml dịch lọc vào chén sứ cân bì trước, cách thủy đến cắn khơ, cắn thu sấy 105 oC giờ, lấy để nguội bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh xác định khối lượng cắn - Hàm lượng chất chiết methanol: X(%) = Trong đó: 𝑏 ×100×2,5 𝑎 ×(100−𝐻) a: khối lượng cao (g) b: khối lượng cắn lại sau sấy (g) H: độ ẩm cao (%) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT TỪ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO VÀ BÁN CHI LIÊN Trang: 4/6 Số: 02-TCCS 2.7 Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN V, phụ lục 5.4) Dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: Cloroform – methanol – nước (65:35:10, lớp dưới) Dung dịch thử: Cân 150 mg cao chiết vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, đến cắn Hịa tan cắn ml methanol (TT) Dung dịch chuẩn: Hòa tan asperulosid methanol (TT) để thu dung dịch có nồng độ 0,01 mg/ml Dung dịch dược liệu đối chiếu Bạch hoa xà thiệt thảo: Cân 500 mg bột dược liệu (mẫu chuẩn) chiết mô tả phần dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bảng mỏng 10 μl dung dịch Sau khai triển, lấy mỏng khỏi bình sắc ký, để bay hết dung mơi nhiệt độ phịng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol 96 % (TT) Sấy mỏng 105 oC xuất vết Quan sát mỏng ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải cho vết có vị trí màu sắc với vết sắc ký đồ dung dịch chất đối chiếu dược liệu đối chiếu Dược liệu Bán chi liên Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: Ethyl acetat – nước – acid acetic (7:1:2) Dung dịch thử: Cân g cao chiết vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 45 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, đến cắn Hịa tan cắn ml methanol (TT) Dung dịch chuẩn: Hòa tan scutellarin methanol (TT) để thu dung dịch có nồng độ 0,01 mg/ml Dung dịch dược liệu đối chiếu Bán chi liên: Cân 500 mg bột dược liệu (mẫu chuẩn) chiết mô tả phần dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bảng mỏng 10 μl dung dịch Sau khai triển, lấy mỏng khỏi bình sắc ký, để bay hết dung mơi nhiệt độ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT TỪ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO VÀ BÁN CHI LIÊN Trang: 5/6 Số: 02-TCCS phòng Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm Sau phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol 96 % (TT), sấy mỏng 30 oC xuất vết Quan sát mỏng ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải cho vết có vị trí màu sắc với vết sắc ký đồ dung dịch chất đối chiếu dược liệu đối chiếu 2.8 Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V, Phụ lục 5.3) Pha động: Acetonitril (TT) dung dịch H3PO4 0,1 % theo chương trình dung mơi Dung dịch thử: Cân xác khoảng 150 mg cao chiết cho vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol (TT), siêu âm 45 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol (TT) đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Dung dịch đối chiếu: Cân xác mg asperulosid scutellarin chuẩn vào bình định mức 25 ml, thêm 23 ml methanol (TT), siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung methanol (TT) đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Điều kiện sắc ký: Cột Shim-pack GIST kích thước (250 x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C18 (5 µm) Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng phát 236 nm Thể tích tiêm mẫu: 10 μl Tốc độ dòng: ml/phút Nhiệt độ cột: 30 oC Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình gradient rửa giải dung môi sau: Thời gian (phút) Acetonitril (% tt/tt) H3PO4 0,1 % (tt/tt) 0-5 20 80 5,01-30 12 88 30,01-45 45 55 45,01-60 95 60,01-70 20 80 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT TỪ BỆNH VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO VÀ BÁN CHI LIÊN Trang: 6/6 Số: 02-TCCS Tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu dung dịch thử Dựa vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch đối chiếu nồng độ chất đối chiếu, tính hàm lượng asperulosid scutellarin cao Hàm lượng asperulosid scutellarin (%) cao tính theo cơng thức: (%) = Trong đó: 𝑆𝑡 × 𝐶 × 25 × a × 100 𝑆𝑐 × 𝑚𝑡 St, Sc : Diện tích pic asperulosid/scutellarin dung dịch thử dung dịch đối chiếu C : Nồng độ dung dịch asperulosid/scutellarin (mg/ml) mt : Khối lượng cân mẫu thử (đã trừ độ ẩm) (mg) a : Hàm lượng asperulosid/scutellarin ĐÓNG GÓI - BẢO QUẢN - HẠN DÙNG - Cao đóng gói túi nhơm kg hàn kín - Nhãn quy chế - Bảo quản nơi khô mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ không 30 oC, độ ẩm không 75 % Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn