LUẬN văn THẠC sĩ nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu hy thiêm (herba siegesbeckia)

TỔNG QUAN

Vị trí phân loại của cây hy thiêm

Siegesbeckia orientalis L có vị trí phân loại nhƣ sau trong giới thực vật [9]:

Đặc điểm thực vật của cây hy thiêm

Cây hy thiêm có tên khoa học là Siegesbeckia orientalis L., thuộc họ Cúc (Asteraceae) (Hình 1.1) [1-3]

Tên khác: Cỏ đĩ, chó đẻ hoa vàng [1-3]

Hình 1.1: Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae)

Cây thảo, sống hằng năm, cao 30 – 90 cm, phân nhiều cành nằm ngang, có lông Lá mọc đối, hình tam giác hay hình quả trám, dài 4 – 10 cm, rộng 3 – 6 cm, cuống ngắn, phiến lá men theo cuống, đầu nhọn, mép có răng cƣa không đều và đôi khi chia 2 thùy ở phía cuống, 3 gân chính mảnh, mặt dưới có lông [8]

Cụm hoa có cuống dài 1 – 2 cm, mảnh, có lông, là một đầu có đường kính 6 – 7 cm; 5 lá bắc ngoài to, hình thìa, có lông dính, lá bắc trong hình trái xoan ngƣợc, đầu cụt, hoa màu vàng; 5 cái ngoài là hoa cái hình lƣỡi, những hoa khác lƣỡng tính, hình ống, không có mào lông; tràng có lƣỡi ngắn, chia 3 thùy, ống có lông, nhị 5, có tàu nhọn rất ngắn [8]

Quả bế, hình trứng, có 4 – 5 cạnh, tròn ở đỉnh, gốc thuôn dần, nhẵn, màu đen

Mùa ra hoa: tháng 4 – 5 đến tháng 8 – 9, mùa quả: tháng 6 – 10 [5]

Chi Siegesbeckia L hiện có 2 loài ở Việt Nam là hy thiêm và hy thiêm núi [8]

Hy thiêm phân bố ở vùng có khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới: Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Indonesia, Philippines, Australia Ở Việt Nam, cây phân bố chủ yếu ở vùng núi và trung du phía Bắc nhƣ Hà Giang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An [8]

Cây ưa sáng và ưa ẩm, thường mọc tập trung trên đất ẩm ở các bãi sông, ruộng hoang, ruộng trồng ngô và ven đường đi Hằng năm cây con mọc từ hạt vào tháng 4 –

5 Cây sinh trưởng nhanh và ra hoa ngay cuối mùa hè hoặc đầu mùa thu, sau lụi tàn vào đầu mùa đông Vỏ quả có lông dính, dễ dàng phát tán nhờ con người và động vật [8]

1.2.2 Thu hái và chế biến

Phần trên mặt đất của cây đƣợc thu hái vào tháng 4 – 6 lúc cây sắp ra hoa hoặc mới có ít hoa Cắt cây có nhiều lá, loại bỏ lá sâu, lấy phần ngọn dài khoảng 30 – 50 cm đem phơi hay sấy khô [3,5] Dƣợc liệu còn nguyên lá khô không mọt, không vụn nát là tốt [8]

Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây hy thiêm cho biết thành phần hóa học chính của Siegesbeckia orientalis L là các diterpen có cấu trúc ent-pimaran và ent-kauran [5]

Hình 1.2: Công thức cấu tạo một số ent- pimaran và ent- kauran phân lập từ S orientalis

Hy thiêm còn có các dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm germancranlid và nhóm melampolid [5]

1.4.1 Dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm germancranlid

Năm 1991, C Zdero cùng các cộng sự đã phân lập đƣợc 4 dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm germancranlid từ S orientalis Đến năm 2015, nhóm các nhà khoa học Trung Quốc đã tách thêm đƣợc 10 dẫn chất cùng nhóm [19,24]

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm germancranlid phân lập từ S orientalis

1.4.2 Dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm melampolid

4 dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm melampolid đƣợc phân lập bởi C Zdero cùng các cộng sự vào năm 1991 [27]

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm melampolid

1.3.3 Các dẫn chất của geranylnerol

Một số dẫn chất của geranylnerol đƣợc tách ra từ cây hy thiêm [27]

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất geranylnerol

Hai hợp chất flavonoid đƣợc phân lập từ S.orientalis đó là 3,7- dimethylquercetin và rutin [5]

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của 2 flavonoid phân lập từ S orientalis

Các steroid đƣợc phân lập từ cây S orientalis là β-sitoterol, stigmasterol, stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranosid [5]

1.3.6 Một số hợp chất khác

Thymohydroquynon dimethyl ether, acid cafeic… cũng đƣợc tìm thấy ở cây hy thiêm [5].

Tác dụng dƣợc lý

Trên chuột cống trắng cho thấy cao lá hy thiêm có tác dụng ức chế khá mạnh viêm cấp tính trên mô hình gân phù bàn chân chuột và ức chế viêm mạn tính, gây teo tuyến ức chuột cống non Ngoại ra còn giảm tỷ lệ γ- globulin trong trong huyết thanh khi phối hợp trong bài thuốc gồm hy ,thiêm, mộc qua, thiên niên kiện và ngưu tất [3,15]

1.4.2 Tác dụng chống oxi hóa

Dịch chiết methanol và ethyl acetat của hy thiêm có tác dụng chống oxi hóa (đặc biệt là dịch chiết methanol) [23] Hy thiêm chống oxi hoá trên gốc tự do OH ● và O 2 -●

Trên anion O 2 -● , dịch chiết nước có tác dụng mạnh, còn trên OH ● phân đoạn butanol có hiệu quả cao Đặc biệt, khi nghiên cứu sâu về cơ chế chống oxi hoá trên O2 -●, có tác giả còn thấy, phân đoạn butanol chống oxi hoá mạnh trên dịch treo mô não đồng thể và màng hồng cầu [15]

Ngoài ra, Boyle SP cùng các cộng sự (2000) và Uma Devi P (2006) đã chứng minh đƣợc trong cây hy thiêm có chứa orientin, rutin… có tác dụng chống oxi hóa của bởi cơ chế các làm sạch các gốc tự do nhƣ superpoxid hoặc tạo ra chelat với kim loại màu… [22,23]

1.4.3 Tác dụng ức chế miễn dịch

Dịch chiết ethanol hy thiêm làm giảm nồng độ IgG, IgG1, IgG2b và làm ức chế miễn dịch khi tiến hành thực nghiệm ở in vivo và in vitro trên chuột nhắt trắng với liều thử nghiệm 0,25; 0,5 mg và 1,0 mg/ngày trong vòng 28 ngày [25]

1.4.4 Tác dụng chống dị ứng

Nhờ ức chế sản xuất IgE từ lympho B mà dịch chiết hy thiêm có tác dụng chống dị ứng Hơn nữa hy thiêm có hoạt tính kháng histamin và kháng acetylcholine thể hiện ở tác dụng làm giảm biên độ co thắt cơ trơn ở ruột cô lập gây bởi histamin và acetycholin [12]

1.4.5 Độc với tế bào u sắc tố

Kirenol và pubetalin đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat thể hiện độc tính rất mạnh đối với dòng tế bào u sắc tố B16 ở chuột [27]

1.4.6 Tác dụng trên chuyển hóa lipid

Nghiên cứu trên chuột thí nghiệm cho thấy hy thiêm làm tăng lipid máu Điều này đƣợc thể hiện bằng việc gây giảm ở cả 3 chỉ số: cholesterol máu, tỷ số β/α lipoprotein máu và mức lipid toàn phần trong máu động vật thí nghiệm [8] Thành phần rutin trong hy thiêm đươc chứng minh là có tác dụng trên chuyển hóa lipid ở chuột béo phì [20]

Rutin trong hy thiêm có hoạt tính kháng khuẩn (trên chủng vi khuẩn gram dương) và kháng nấm (nhưng không có tác dụng trên nấm Candida albicans) [6]

1.4.8 Tác dụng điều trị gout

Cao toàn phần hy thiêm với liều 600 mg/kg/ngày, liên tục trong 5 ngày có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng thực nghiệm trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, tỷ lệ giảm so với lô gây tăng là 30,0% [9]

Trong số các cao phân đoạn chiết xuất từ cao toàn phần hy thiêm, phân đoạn n- butanol thể hiện tác dụng hạ acid uric huyết thanh ƣu thế nhất trên mô hình gây tăng acid uric cấp ở cả chuột nhắt trắng và chuột cống trắng cũng nhƣ khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro [9]

Phân đoạn n- butanol hy thiêm với liều 120 mg/kg/ngày uống liên tục trong 5 tuần có khả năng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng trên mô hình gây tăng acid uric mạn tính, tỷ lệ giảm so với lô chứng bệnh là 27,4% [9]

Ngoài các tác dụng trên, dịch chiết phân đoạn ethyl acetat và n-butanol cây hy thiêm đƣợc chứng mình còn có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ cổ tử cung hela in vitro [18] Rutin có thể làm giãn mạch, hạ áp, hạ đường huyết [20].

Tính vị, công năng, công dụng

Hy thiêm có vị cay đắng, tính mát, quy vào 2 kinh can và thận, có tác dụng khử phong, trừ thấp, hoạt huyết, chỉ thống, lợi gân cốt [8]

Hy thiêm được dùng để điểu trị phong thấp, nhức xương, yếu chân, bán thân bất toại, gân cốt nhực lạnh, lƣng gối tê dại [5], khớp sƣng nóng đỏ và đau nhức, đau lƣng, mỏi gối mụn nhọt lở ngứa, kinh nguyệt không đều Ngày dùng 8 – 16 g, dạng thuốc sắc, cao mềm hoặc hoàn tán Dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác nhƣ gối hạc, cỏ xước, củ cốt khí Còn dùng giã đắp tại chỗ chữa nhọt độc, ong đốt, rắn cắn cây có tác dụng phụ gây nôn nếu dùng tươi, uống nhiều [8]

Trong y học Trung Quốc, hy thiêm dùng phối hợp với cây thuốc khác để điều trị ung thư và chảy máu não kèm theo chứng liệt Dùng toàn cây dưới dạng nước sắc, liều một lần là 10 g Ở Ấn Độ, hy thiêm đƣợc coi là có tác dụng chữa các vết loét hoại tử và

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU các chứng đau nhức Nước ép cây tươi đắp lên vết thương, khi khô tạo thành một lớp phủ ngoài giống nhƣ véc ni Cồn thuốc hy thiêm đƣợc dùng ngoài cùng với glycerin để chữa bệnh herpes loang vòng và một số bệnh nhiễm ký sinh trùng Hy thiêm đƣợc dùng để chữa thấp khớp và cơn đau thận Nó đƣợc coi là có tác dụng trợ tim, làm ra mồ hôi, chống scorbut và tăng tiết nước bọt Còn được dùng làm thuốc trị giun sán Cao nước hy thiêm có tác dụng độc đối với một số loại gián [8] Ở Madagasca, hy thiêm đƣợc dùng với tác dụng gây liền sẹo ở bên ngoài và bên trong cơ thể (đối với loét ống tiêu hóa) [8] Ở Nepal, dịch ép rễ để trị vết thương [8] Ở Nigeria, cao toàn cây có tác dụng kháng khuẩn trị tổn thương da, bệnh phong, giang mai, bệnh hoa liễu và nấm da, làm thuốc tẩy và chống nôn [8].

Tổng quan về darutosid

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của darutosid

- Tên IUPAC: 2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(2R,4aS,4bR,7S,10aS)-7-[(1R)-1,2- dihydroxyethyl]-1,1,4a,7-tetramethyl-3,4,4b,5,6,9,10,10a-octahydro-2H-phenanthren- 2- yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol

- Công thức phân tử của của darutosid: C26H 44 O 8

- Trạng thái vật lý: Bột màu trắng

Hy thiêm chứa hàm lƣợng lớn darutosid Tại các hòn đảo Reunion và Mauritius, nó được biết đến bởi đặc tính chữa bệnh lành vết thương bên ngoài nhanh và làm dịu viêm [22]

Darutosid là một diterpenoid đƣợc phân lập từ Siegesbeckia orientalis, đƣợc chứng minh là có đặc tính chống viêm trong thí nghiệm in vivo (ức chế đường lipoxygenase trong tổng hợp prostaglandin, ức chế collage-nase, chống lại chứng phát ban do tia cực tím) [22]

Ngoài ra, darutosid còn có tác dụng phục hồi vết thương và tái tạo mô bằng cách sinh tổng hợp collagen Đối với da bị rạn (tổn thương bề mặt da do sự giãn nở bất thường của lớp hạ bì trong thời gian mang thai hoặc thay đổi cân nặng, làm cho chất elastin trong các mô liên kết có thể giảm hoặc mất) thì darutosid có khả năng tái cấu trúc các vết rạn, tăng sinh collagen, giúp hồi phục da [22]

Một thử nghiệm in vivo đánh giá hiệu quả chống căng da của một loại kem chứa 1.0 % darutosid trên 14 tình nguyện viên nữ (21- 42 tuổi) có vết rạn trên bụng, đùi, hông, ngực… Kết quả cho thấy nếu sử dụng kem mỗi ngày hai lần trong bốn tuần liên tiếp thì 7 trong số 14 tình nguyện viên nhận thấy vết rạn được làm đầy, kích thước thu nhỏ dần đồng thời độ nhạy cảm giảm, cải thiện độ đàn hồi của da [22]

1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm

Hiện nay, chƣa có dƣợc điển nào quy định chuyên luận định tính darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm

Trên thế giới chƣa có dƣợc điển nào quy định chuyên luận định lƣợng darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm Một số công trình nghiên cứu định lƣợng darutosid từ loài này được thực hiện theo phương pháp [16]:

- Detector UV ở bước súng 210 nm, cột (4,6 x 250 mm), cỡ hạt 5 àm

- Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 10,0000 mg darutosid, hoà tan trong 10 mL methanol để thu đƣợc dung dịch chuẩn có nồng độ 1mg/mL, sau đó tiến hành pha

- Dung dịch thử: Cân 10 mg cao khô chiết từ methanol thô, thêm 10mL methanol sau đó ly tâm trong vòng 20 phút Lấy phần dịch vào bình định mức 10 mL

Lặp lại quy trình này 4 lần, kết hợp dịch lọc Cuối cùng thu đƣợc dung dịch có nồng độ

Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Quá trình tách bằng TLC được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất đƣợc kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp thụ, trao đổi ion Pha động là những hệ dung môi tương tự phương pháp HPLC Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của các chất là hệ số lưu giữ Rf Trị số của nó đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Trong đó: d R : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) d M : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động ( đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

R f : Có giá trị giao động từ 0-1

Pha tĩnh của TLC là cỏc hạt cú kớch thước 10-30 àm được trải đều và kết dớnh thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 àm trờn giỏ đỡ hỡnh vuụng Pha tĩnh thụng dụng nhất hay dùng là silica gel, ngoài ra cũng có thể sử dụng nhôm oxyd, cellulose, polyamid hay các loại silica gel pha đảo

Pha động của TLC phụ thuộc vào cơ chế sắc ký, để tăng cường sức rửa giải thường kết hợp 2 hoặc nhiều dung môi với nhau Nguyên lý chi tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2

 Dung môi cần có độ tinh khiết cao

 Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số R f nằm trong khoảng 0,2 – 0,8 đạt độ phân giải cực trị

 Chất phân tích dạng ion hay phân cực đƣợc rửa giải tốt bằng dung môi phân cực như hỗn hợp n-butanol – nước Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng

 Khi dùng silica gel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực nhƣ ether ethylic vào dung môi không phân cực nhƣ methylebnzen sẽ làm tăng đáng kể trị số R f

 Vết chất cần phân tích trên bản mỏng khi soi đèn UV hoặc phun thuốc thử hiện màu phải đƣợc nhìn thấy rõ, tách rời với các vết tạp

 Trị số R f phải nằm trong khoảng 0,2-0,8

 So sánh trị số R f của chất chuẩn với các chất trên mẫu phân tích

1.7.2 Vài nét về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.7.2.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC

HPLC là một kỹ thuật phân tích trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này đối với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi detector

Có 4 kỹ thuật HPLC cơ bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và rây phân tử (loại cỡ) Trong phạm vi khóa luận này, tôi xin trình bày cụ thể về kỹ thuật sắc ký phân bố

1.7.2.2 Điều kiện sắc ký phân bố hiệu năng cao

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợp gồm nhiều thành phần Đú là chất rắn xốp, cú kớch thước nhỏ, đường kớnh 3 – 10 àm, cú độ phõn cực khác nhau Pha tĩnh đƣợc cấu tạo từ các nhóm chức khác nhau ghép hóa học trên giá mang,

 Sắc kí pha thuận: Pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực nhƣ triethylen glycol; pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực nhƣ: n-hexan, toluen, isopropyl ether

Trong sắc kí pha thuận, chất ít phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần

 Sắc kí pha đảo: pha tĩnh là các silica gel đã đƣợc alkyl hóa, ít phân cực

Trong sắc ký pha đảo, các chất phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động thời gian lưu tăng lên

Pha động là dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc kí Pha động có thể là dung môi hữu cơ, hoặc hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định Trong sắc kí pha thuận, pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực nhƣ: n-hexan, benzen, chloroform…

Trong sắc kí pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực nhƣ: methanol, acetonitril… hay hỗn hợp của chúng

Detector là bộ phận dùng để phát hiện các chất sau khi đƣợc tách riêng và rửa giải ra khỏi cột sắc kí Một chất khi đi qua detector sẽcho tín hiệu đáp ứng khác biệt với nền pha động, qua đó cho phép đánh giá, định tính, định lƣợng các thành phần trong mẫu phân tích Tùy thuộc vào tính chất lý hóa của đối tƣợng chất cần phân tích, detector sẽ đƣợc lựa chọn thích hợp để những chất này có đáp ứng với detector Các loại detector thường được sử dụng trong HPLC bao gồm: detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS), detector hiện đại thuộc loại này là detector mảng diod (DAD); detector huỳnh quang; detector độ dẫn, detector khối phổ

1.7.2.3 Các phương pháp định lượng bằng HPLC

Nguyên tắc của các phương pháp định lượng bằng HPLC là nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao và diện tích píc của chất đó thể hiện trên sắc ký đồ

Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Khóa luận được thực hiện theo phương pháp chuẩn ngoại

Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) píc của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) píc của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ các chất cần phân tích trong mẫu thử

Có 2 phương pháp là chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm

- Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử

Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

Trong đó: C X là nồng độ mẫu thử

C S là nồng độ mẫu chuẩn

S X là diện tích của píc mẫu thử SKĐ là diện tích của píc mẫu chuẩn

- Chuẩn hóa nhiều điểm: cần tiến hành qua những bước sau:

 Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu đƣợc là các diện tích (hoặc chiều cao) của píc ở mỗi điểm chuẩn

 Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích píc (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất chuẩn

 Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất thử

Có thể tính toán dựa theo 2 cách:

- Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) píc của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra đƣợc nồng độ của nó

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) của píc với nồng độ của chất cần xác định

Trong đó: Y là diện tich píc a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung b là độ dốc của đường chuẩn

C X là nồng độ của chất thử

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu

Nguyên liệu để chiết xuất và phân lập diterpenoid là bộ phận trên mặt đất của cây hy thiêm đƣợc trồng và thu hái tại huyện Thạch Thành, Thanh Hóa vào tháng 9/

2016 Mẫu nghiên cứu đƣợc sấy khô ở 65 o C, bảo quản trong túi bóng kín ở nơi khô ráo thoáng mát và lưu tại Viện Dược liệu

Hình 2.1: Dƣợc liệu hy thiêm

Phương tiện nghiên cứu

- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO)

- Cân phân tích (Sartorius, BP-221S): độ chính xác 0,0001 g

- Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M)

- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 365 nm (Vilber lourmat, CN – 15 – LC)

- Máy quang phổ UV-1800, SHIMADZU

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – LC 10A (Shimadzu)

- Máy đo cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR,DEPT) Bruker AM500 FT-NMR

- Máy đo khối phổ Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems (Waters, USA)

- Micropipet loại 100 àL, 200 àL, 1000 àL, 5000 àL và đầu cụn tương ứng

- Ống ly tâm 2 mL, 50 mL

- Dụng cụ thủy tinh cơ bản của phòng thí nghiệm gồm bình định mức, ống nghiệm, ống đong, cốc có mỏ, phễu…

- Chuẩn darutosid hàm lƣợng 97% của hãng Sigma

- n-hexan, n-butanol, dichloromethan, ethyl acetat, methanol, nước cất… đạt tiêu chuẩn phân tích

- Bản sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng silica gel 60 RP18 F254S (Merck)

- Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merck)

- Silica gel pha đảo RP18 (Merck)

- Thuốc hiện màu dùng trong sắc ký lớp mỏng: dung dịch acid H2SO 4 10 % trong ethanol.

Nội dung nghiên cứu

2 3.1 Phân lập chất darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm

- Phân lập darutosid từ dược liệu hy thiêm bằng phương pháp sắc kí cột

- Xác định cấu trúc darutosid phân lập bằng phổ NMR, MS

2 3.2 Định tính darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm bằng TLC

2 3.3 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm bằng HPLC

- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

- Khảo sát quy trình xử lý mẫu

2 3.4 Thẩm định phương pháp phân tích darutosid bằng HPLC

- Độ chọn lọc của phương pháp

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ)

- Độ lặp lại (độ chụm), độ thu hồi (độ đúng) của phương pháp.

Phương pháp nghiên cứu

- Thời gian lấu mẫu: tháng 09/2016

- Địa điểm lấy mẫu: Thạch Thành, Thanh Hoá

- Mẫu sau khi thu thập đƣợc rửa sạch, sấy khô ở 65 o C, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát

2.4.2 Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 2.4.2.1 Phương pháp phân lập darutosid trong dược liệu hy thiêm

- Chiết xuất các cao phân đoạn từ hy thiêm

Dƣợc liệu hy thiêm đƣợc chiết nóng với ethanol 96 % ở nhiệt độ 70 o C (chiết 3 lần, mỗi lần 3 giờ), thu đƣợc cao trong ethanol Cao toàn phần sau đó đƣợc hòa tan trong nước rồi tiếp tục chiết lỏng- lỏng bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau lần lƣợt là: n-hexan, ethyl acetat và n- butanol Thu đƣợc 3 phân đoạn dịch chiết: phân đoạn n-hexan, phân đoạn ethyl acetat, phân đoạn n- butanol

- Phân lập darutosid từ cao phân đoạn

- Phân lập darutosid bằng phương pháp sắc ký cột

Cột sắc ký là một cột thủy tinh có van khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy, kích thước tùy lượng cao phân lập Cột được rửa sạch, sấy khô, gắn trên một giá vững chắc

Hạt silica gel pha thường hoặc hạt silica gel pha đảo

Cột sắc ký được lót một lớp bông mỏng ở dưới đáy để chất hấp phụ chảy xuống khi khóa hoặc mở cột Chất hấp phụ là hạt silica gel pha thường (cột sắc ký pha thường) hoặc hạt silica gel pha đảo (dùng trong cột sắc ký pha đảo) được hòa tan trong dung môi pha động Luyện cột bằng dung môi pha động để đuổi bọt khí, nén cột, giúp ổn định tốc độ dòng Cột đƣợc luyện đến khi không còn bọt khí trong cột, chiều cao lớp chất hấp phụ ổn định

Chuẩn bị mẫu sắc ký:

Phần chất cần phân lập đƣợc hòa tan trong 1 lƣợng tối thiểu dung môi Sau đó trộn với 1 lƣợng pha tĩnh vừa đủ, rồi làm bay dung môi để đƣợc bột mịn tơi xốp nhƣ lớp chất hấp phụ bình thường, nhằm tạo sự đồng nhất lớp bột và lớp chất hấp phụ khi lên cột Đƣa mẫu lên cột:

Cột sắc ký sau khi đã ổn định, cho dung môi chảy xuống cách lớp silica gel đủ để lấp đầy phần chất cho vào Phần mẫu đƣợc rắc đầu trên lớp silica gel, gõ để ổn định phần mẫu Sau đó cho dung môi chảy xuống gần sát bề mặt phần mẫu lên cột để các chất đi xuống hết lớp hấp phụ, tránh hiện tƣợng khuếch tán ngƣợc

Kết quả chạy sắc ký:

Tiến hành sắc ký với hệ dung môi đã lựa chọn Dịch rửa giải đƣợc hứng vào các ống nghiệm

Phát hiện và thu nhận kết quả sắc ký của dịch rửa giải bằng cách theo dõi các kết quả chạy sắc ký trên cả 2 loại bản mỏng: bản mỏng pha thường và bản mỏng pha đảo Phát hiện chất bằng thuốc thử là dung dịch H2SO 4 10 % trong EtOH Gộp các ống sạch lại với nhau

2.4.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc darutosid

Chất phân lập nghi ngờ là darutosid được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ bao gồm: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS)

Các phổ đƣợc tiến hành đo ở Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.4.3 Phương pháp định tính dược liệu hy thiêm bằng TLC

Khảo sát hệ dung môi chấm sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng TLC silica gel 60

F 254 để triển khai sắc ký định tính darutosid trong dịch chiết dƣợc liệu

Hệ dung môi phù hợp là hệ dung môi cho các vết tách biệt nhau trên bản mỏng và cho

R f của chất phân tích trong khoảng 0,2 – 0,8 [16]

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO 4 10 % trong ethanol

2.4.4 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm bằng phương pháp HPLC

Khảo sát điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký: qua tham khảo các nghiên cứu chúng tôi lựa chọn cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 àm) của hóng Agilent

- Khảo sát bước sóng phân tích

- Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động

Khảo sát quy trình xử lý mẫu

- Lựa chọn dung môi chiết: Dựa trên độ tan khác nhau của darutosid trong các dung môi mà chúng tôi tiến hành khảo sát:

 Nồng độ dung môi chiết

- Khảo sát phương pháp chiết

2.4.5 Thẩm định phương pháp phân tích darutosid bằng HPLC 2.4.5.1 Tính chọn lọc của phương pháp

Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khắc nhƣ tạp chất hoặc các chất cản trở khác

- Xác định: Sử dụng phương pháp HPLC

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc ký đồ thu đƣợc từ mẫu chuẩn và các mẫu phân tích, píc của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các píc tạp, có tín hiệu darutosid trong mẫu thử tại tR của schisandrin

2.4.5.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ hoặc khối lƣợng nhỏ nhất có thể đƣợc phát hiện với mức tin cậy xác định

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

- Xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích

Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3

LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N

2.4.5.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích ( ở trong nghiên cứu này thì khoảng tuyến tính là sự phụ thuộc của diện tích píc và nồng độ chất chuẩn) Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo đƣợc và nồng độ các chất phân tích

- Xác định Đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

2.4.5.4 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

- x i : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i

- 𝑥 : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm

- N: Số lần thử nghiệm Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là đúng Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết

- C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (mg/mL)

- C O : Nồng độ chất phân tích ban đầu có trong mẫu thử (mg/mL)

- C x : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (mg/mL)

KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

Chiết xuất và phân lập

3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ hy thiêm

Hy thiêm đã phơi, sấy khô (2 kg) đƣợc chiết nóng với ethanol 96% ở nhiệt độ

70 o C (chiết 3 lần, mỗi lần 3 giờ) Gộp các dịch chiết EtOH thu đƣợc đem cất loại dung môi thu được 150 g cao tổng Hòa tan cao toàn phần trong 0.5 lít nước thành hỗn dịch rồi lắc, chiết phân đoạn lần lƣợt với n- hexan (0,5 lít x 3 lần), ethyl acetat (0,5 lít x 3 lần), n- butanol (0,5 lít x 3 lần) Các dịch chiết n- hexan, ethyl acetat, n- butanol đƣợc tách riêng Cất loại dung môi dưới áp suất thu được ắn tương ứng: cắn phân đoạn n- hexan (28 g), cắn phân đoạn ethyl acetat (42 g) và cắn phân đoạn n- butanol (36 g)

Quy trình chiết đƣợc tóm tắt ở sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao hy thiêm

Chiết với EtOH 96%, 70 o C Thu hồi dung môi

Hòa trong nước Lắc với n-Hex, EtOAc, n-But Thu hồi dung môi

Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập chất trong phân đoạn, trên cơ sở sự hấp phụ của các chất vào silica gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp

Theo khảo sát cho thấy phân đoạn ethyl acetat có chứa chất cần phân lập

Chạy cột phân đoạn ethyl acetat

- Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn 42 g cắn của phân đoạn EtOAc với lƣợng tối thiểu ethyl acetat đồng nhất trong bình cầu, thêm lƣợng silica gel tối thiểu tẩm đều mẫu trong bát sứ Sấy cao ở 80 o C đến khô Nghiền hỗn hợp rắn thu đƣợc bằng cối sứ thu đƣợc hỗn hợp tơi xốp, đồng đều Cảm quan hỗn hợp khô tơi, màu đồng nhất

- Chuẩn bị cột sắc ký: Chọn cột sắc ký có đường kính = 6 cm, chiều cao h = 30 cm Cân khoảng 400 g silica gel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho vào cốc, thêm ngập DCM, khuấy đều cho hết bọt khí Để yên 12 h Lót ở đáy cột một lớp bông mỏng rồi rót từ từ hỗn dịch DCM lên cột Mở khóa cột hứng dung môi, đồng thời bổ sung dung môi, để ổn định cột Khi cột đã ổn định, để mức DCM khoảng 3 - 5 mm, đƣa hỗn hợp chất đã trộn silica gel lên cột Sau đó phủ lên phía trên một lớp silica gel mỏng để tránh xáo trộn bề mặt

- Giải hấp phụ bằng hệ dung môi DCM-MeOH với tỉ lệ MeOH tăng dần từ 0 – 100%, hứng các phân đoạn bằng ống nghiệm thể tích 50 mL, khảo sát các phân đoạn bằng SKLM

Kết quả: Gộp các phân đoạn giống nhau và cất thu hồi dung môi thu đƣợc 6 phân đoạn chính PĐ1-PĐ6 Trong đó, khi khảo sát bằng SKLM, PĐ5 (2,7 g) có chứa darutosid

Tinh chế HT1 từ PĐ5

Chuẩn bị cột pha đảo YMC: YMC đƣợc ngâm trong MeOH rồi đƣa lên cột, đường kính cột = 2 cm, chiều cao cột h = 35 cm

Luyện cột: tiến hành luyện cột với hệ dung môi methanol- nước (7:1 - 1:1 v/v) đã siêu âm để loại bọt khí

Tiến hành chạy cột bằng hệ dung môi methanol - nước (1: 1 v/v) và theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng

Gộp các ống sạch có chứa chất lại với nhau Bay hơi dung môi thu đƣợc 62 mg chất bột màu trắng HT1 HT1 đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và HPLC cho 1 vết (píc) duy nhất Từ đó kết luận HT1 khá tinh khiết

Sơ đồ 3.2: Tóm tắt quy trình phân lập darutosid trong cao ethyl acetat từ dƣợc liệu hy thiêm

3.1.3 Xác định cấu trúc hoá học của HT1

HT1 thu đƣợc ở dạng bột màu trắng, UV: 210 nm

Số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) của chất HT1 và darutosid theo tài liệu tham khảo đƣợc trình bày ở bảng 3.1:

Sắc ký cột pha thường Dung môi DCM - MeOH (tỷ lệ MeOH từ 0 – 100%)

PĐ1 PĐ2 PĐ3 PĐ4 PĐ5

Sắc ký cột pha đảo Dung môi MeOH - H2O (1 : 1 v/v)

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) của chất

HT1 và darutosid theo tài liệu tham khảo

HT1 Darutosid [27] δC* δH* (số H; độ bội; J; Hz) δ C # δH #

Từ tất cả các dữ liệu phổ và tài liệu tham khảo đã công bố [27] xác định đƣợc chất HT1 là darutosid

3.1.4 Xác định độ tinh khiết của darutosid

Darutosid phân lập được đã được định lượng lại bằng phương pháp HPLC Sử dụng chất chuẩn đối chiếu là darutosid hàm lƣợng 97% của hãng Sigma

Chuẩn bị mẫu thử: Pha dung dịch thử cú nồng độ 95 àg/mL

Kết quả sắc ký đƣợc thể hiện ở hình 3.1 mV

Hình 3.1: Sắc ký đồ darutosid phân lập đƣợc

Từ kết quả sắc ký thu được, áp dụng phương trình hồi quy tuyến tính ở mục 3.4.4 đã xác định đƣợc độ tinh khiết của darutosid phân lập đƣợc là 95%

Nhận xét: darutosid phân lập đƣợc đạt độ tinh khiết 95 % có thể sử dụng làm chất chuẩn đối chiếu để phục vụ các nghiên cứu định tính và định lƣợng khác.

Xây dựng phương pháp định tính chất darutosid bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)

- Bản mỏng: silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn đã hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ

- Dung dịch chuẩn: darutosid đƣợc phân lập từ cây hy thiêm có độ tinh khiết 95%

- Dung dịch thử: Xay dƣợc liệu hy thiêm thành bột Cân 1 g bột dƣợc liệu, cho vào bình nón 50 mL, thêm 10 mL methanol Siêu âm hỗn hợp trong 1 giờ, lọc và để bốc hơi dung môi, thu đƣợc cắn Hòa tan cắn trong 1,0 mL methanol

- Thuốc thử hiện màu: Dung dịch H2SO4 10 % trong EtOH

- Triển khai sắc ký: Sử dụng máy chấm sắc ký TLC

- Dung dich chuẩn: 10 àL, dung dịch thử: 10 àL

- Các hệ dung môi khảo sát:

Hệ A: Toluen - ethylaxetat - Acetone - Acid formic (5 : 3 : 1 : 1 v/v/v/v)

Hình 3.2: Sắc ký đồ của 3 hệ dung môi

2: Dung dịch chuẩn HT1 Các hình được quan sát dưới điều kiện ánh sáng thường

Qua khảo sát các hệ dung môi thì hệ B cho kết quả sắc ký đồ tách tốt nhất (hình 3.2) nên dùng hệ C làm hệ dung môi khai triển

Kết luận: Trong khóa luận đã sử dụng hệ dung môi Diclomethan – Methanol (9: 1 v/v) để định tính chất HT1 trong dƣợc liệu hy thiêm.

Xây dựng phương pháp định lượng chất darutosid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 3.3.1.1 Lựa chọn pha tĩnh

Darutosid có khung steroid kém phân cực Qua tham khảo các nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn cột C18 để tiến hành phân tích darutosid

3.3.1.2 Chọn bước sóng phân tích

Qua tham khảo một số tài liệu [22] tiến hành phân tích bằng detector UV- VIS ở bước sóng 210 nm

3.3.1.3 Khảo sát dung môi pha động

Trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, pha động quyết định đến khả năng tách các chất Qua tham khảo các nghiên cứu đã công bố, kết hợp với trang thiết bị hiện có sử dụng hệ dung môi pha động nhƣ sau:

- Pha động B: Acetonitril Điều kiện chạy máy đƣợc cố định nhƣ sau:

- Cột tỏch: Cột C18 (250 mm ì 4,6 mm; 5 àm)

- Tốc độ dòng: v = 0,5 mL/phút

- Thể tớch tiờm mẫu V= 10 àL

- Detector: UV-VIS ở bước sóng 210 nm

- Mẫu chuẩn: pha dung dịch darutosid cú nồng độ 950 àg/mL Sau đú pha loóng mẫu thành dung dịch nồng độ 95 àg/mL

- Mẫu thử: cân chính xác khoảng 2,0 g dƣợc liệu (đã xay nhỏ và xác định độ ẩm), chuyển vào bình cầu dung tích 250 mL, thêm 50 mL methanol, để yên 15 phút Cân xác định khối lượng bình Chiết hồi lưu ở 70 o C trong 3 giờ, để yên về nhiệt độ phòng, cõn và bổ sung lƣợng dung mụi mất đi Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 àm thu đƣợc dịch dùng để triển khai sắc ký

Kết quả khảo sát 3 chương trình dung môi được thể hiện ở bảng 3.2, 3.3 và hình 3.2

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát chương trình gradient

Thời gian (phút) % Kênh A % Kênh B

Hình 3.3: Sắc ký đồ chương trình gradient Bảng 3.3: Các thông số khảo sát chương trình gradient

Nhận xét : Chương trình 1 cho thấy píc darutosid chưa tách hoàn toàn với píc tạp Chương trình 2 cho thấy píc darutosid hoàn toàn tách khỏi píc tạp, píc darutosid cân đối vì vậy lựa chọn chương trình gradient 2 để tiến hành các khảo sát tiếp theo

3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

3.3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết mẫu

Chúng tôi tiến hành khảo sát hai phương pháp chiết mẫu: Đun hồi lưu cách thủy và siêu âm, cố định các thông số khác: Thời gian siêu âm và đun cách thủy là 2 giờ, chiết lặp 1 lần Mỗi phương pháp tiến hành lặp lại 3 lần Kết quả thu được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.4: Khảo sát phương pháp chiết mẫu

Nhận xét: Trong cùng điều kiện và thời gian phân tích, phương pháp chiết hồi lưu cách thủy cho hàm lượng darutosid cao hơn so với phương pháp siêu âm Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu cách thủy để tiến hành các khảo sát tiếp theo

3.3.2.2 Khảo sát thời gian chiết

Sau khi lựa chọn được phương pháp chiết mẫu, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa thời gian chiết mẫu: Chiết hồi lưu cách thủy với thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ và cố định các thông số khác Kết quả đƣợc trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.5: Khảo sát thời gian chiết mẫu

Nhận xét: Kết quả trên cho thấy, chiết hồi lưu cách thủy trong vòng 3 giờ cho hàm lƣợng darutosid lớn nhất (0,129%) so với khi chiết 1 giờ và 2 giờ Vì vậy, chúng tôi lựa chọn quy trình chiết hồi lưu cách thuỷ trong vòng 3 giờ

3.3.2.2 Khảo sát số lần chiết

Tiếp theo chúng tôi tiến hành khảo sát số lần chiết: Chiết lặp 1 lần 50 mL, chiết lặp 2 lần mỗi lần 25 mL và chiết lặp 3 lần mỗi lần 16,5 mL và cố định các thông số khác Kết quả thu đƣợc trong bảng sau:

Bảng 3.6: Khảo sát số lần chiết mẫu

Nhận xét: Kết quả trên cho thấy, chiết lặp 1 lần, 2 lần và 3 lần cho kết quả tương đương nhau Vì vậy để tiết kiệm thời gian xử lý mẫu, chúng tôi lựa chọn quy trình chiết lặp 1 lần.

Thẩm định phương pháp

3.4.1 Tính thích hợp của hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống đƣợc đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích píc và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn darutosid nồng độ chớnh xỏc khoảng 95 àg/mL Kết quả đƣợc trỡnh bày trong bảng sau:

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống

Hình 3.3: Khảo sát tính phù hợp của hệ thống

Nhận xét: Các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2,0 %, chứng tỏ hệ thống và phương pháp phân tích sử dụng phù hợp cho quá trình phân tích darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn darutosid, dung dịch thử, dung dịch thử có thêm chuẩn darutosid, ta thu được kết quả đánh giá bằng các sắc ký đồ tương ứng Trên sắc ký đồ thu được cho thấy, dung dịch thử có píc đáp ứng tại thời gian lưu của darutosid Trên sắc ký đồ của các dung thử có thêm chuẩn chỉ cho tín hiệu darutosid, không bị trùng với các tín hiệu khác chứng tỏ phương pháp và hệ thống sắc ký có tính chọn lọc cao

Hình 3.4: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thêm chuẩn

3.4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)

Bằng phương pháp đánh giá dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N), LOD được xác định là điểm nồng độ mà tại đó tỉ lệ S/N nằm trong khoảng từ 2-3 LOQ= 3,3×

LOD Từ sự phụ thuộc của diện tích píc darutosid vào nồng độ ta tính đƣợc LOD, LOQ của các chất nhƣ trong bảng sau:

Bảng 3.8: Kết quả xác định LOD và LOQ

3.4.4 Xây dựng đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn trên nền mẫu cú nồng độ thay đổi từ 3,8 - 282 (àg/mL), và khảo sỏt sự phụ thuộc của tớn hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ Kết quả khoảng tuyến tính xác đƣợc nhƣ sau:

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Nồng độ (àg/mL) Diện tớch pớc (mAU.s)

Hình 3.5: Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính của darutosid

Phương trình hồi quy tuyến tính khảo sát dung dịch chuẩn từ nồng độ từ 3,8 àg/mL đến 282 àg/mL: y = 20434x – 11330 (R² = 1) Trong đó: y: Diện tích píc darutosid (mAU.s) x: Nồng độ darutosid (àg/mL)

Nhận xét : đường chuẩn thỏa mãn 0,99 ≤ R 2 ≤ 1 và ∆ i nằm trong khoảng ± 15%

Nhận xột: Đường tuyến tớnh trong khoảng nồng độ từ 3,8 àg/mL – 282 àg/mL có hệ số tương quan R ≥ 0,998, do đó trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ tương ứng

3.4.5 Thẩm định độ lặp lại

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 2 g dƣợc liệu Xử lý mẫu giống nhƣ mục 3.3.1.3 để đƣợc dung dịch tiêm sắc ký Tiến hành lặp lại 6 lần Đường chuẩn

C: nồng độ darutosid trong dung dịch mẫu thử theo phương trình hồi quy tuyến tính (mg/mL) m: khối lƣợng mẫu dƣợc liệu đem phân tích (g)

B (%): độ ẩm của mẫu phân tích

P (%): độ tinh khiết của chất đối chiếu tính theo diện tích píc X: độ ẩm của mẫu dƣợc liệu (%)

Kết quả thẩm định độ lặp lại đƣợc trình bày ở bảng 3.10

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

Kết quả cho thấy phương pháp có độ chính xác cao và có độ lặp lại tốt với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD = 2,794%

3.4.7 Thẩm định độ thu hồi

Hiệu suất thu hồi của phương pháp xử lý mẫu là một trong những đại lượng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phương pháp Nó cho biết lượng chất bị mất đi trong quá trình xử lý mẫu Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phương pháp xử lý mẫu đã chọn Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp, chúng tôi sử dụng phương pháp thêm chuẩn Quá trình đánh giá đƣợc tiến hành ở 2 mức thêm chuẩn khác nhau: Thêm 1,8 mg và 3,0 mg vào mẫu thử Mẫu đƣợc xử lý nhƣ mục 3.3.1.3 Mỗi mẫu thử đƣợc làm lặp lại 3 lần Kết quả trung bình đƣợc trình bày ở bảng 3.11

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

Lƣợng darutosid chuẩn thêm vào (mg)

Lƣợng darutosid tìm lại (mg) Độ thu hồi (%)

Nhận xét: Độ thu hồi của quá trình khảo sát đạt giá trị từ 97,59% đến 98,56%

Nhƣ vậy độ đúng của phép đo đƣợc đảm bảo mang lại kết quả đáng tin cậy

Bảng kết quả định lƣợng darutosid trong mẫu dƣợc liệu hy thiêm

Bảng 3.12: Hàm lƣợng darutosid trong 3 mẫu dƣợc liệu hy thiêm

STT Mẫu thử Hàm lƣợng (%) darutosid trung bình

1 Dƣợc liệu hy thiêm (Hà Nội; M1) 0,10 ± 0,03

2 Dƣợc liệu hy thiêm (Thanh Hoá; M2) 0,14 ± 0,01

3 Dƣợc liệu hy thiêm (Nghệ An; M3) 0.08± 0,03

Bàn luận

Darutosid đƣợc biết đến nhƣ là một trong những thành phần chính trong dƣợc liệu hy thiêm có tác dụng chống viêm, chống rạn da, kích thích sản xuất collagen…

Trong một số nghiên cứu gần đây ở Việt Nam về thành phần hóa học phân lập đƣợc từ hy thiêm cho thấy sự có mặt của darutosid trong loài này Tuy nhiên, do hiện nay ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu định tính và định lƣợng darutosid trong hy thiêm Dƣợc điển Trung Quốc dùng kerinol (một hợp chất diterpenoid) làm chất đánh dấu trong tiêu chí định lƣợng Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy, nhiều mẫu dƣợc liệu hy thiêm trồng tại Việt Nam không có thành phần này Do đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập darutosid với mục đích làm chất đối chiếu và tiến hành xây dựng phương pháp định tính, định lƣợng darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm

Kết quả phân lập darutosid đã đƣợc chúng tôi tiến hành tỉ mỉ và đƣợc khẳng định công thức bằng các phương pháp: khối phổ (MS), phổ NMR Darutosid phân lập đã đƣợc định lƣợng để xác định độ tinh khiết dựa trên chất chuẩn đối chiếu darutosid (97%) của hãng Sigma Kết quả cho thấy darutosid phân lập đƣợc có độ tinh khiết 95%, darutosid phân lập đƣợc sẽ đƣợc sử dụng vào các nghiên cứu khác Đối với xây dựng phương pháp định tính darutosid thì áp dụng phương pháp TLC để xác định sự có mặt của darutosid trong hy thiêm Quan khảo sát cho thấy, với hệ dung môi Diclomethan – Methanol (9: 1 v/v) cho kết quả định tính tốt, rõ ràng, thoã mãn yêu cầu của phương pháp định tính TLC Có thể sử dụng kết quả nghiên cứu này cho công tác tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu về sau

Trong quá trình xây dựng phương pháp định lượng darutosid, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát chương trình gradient, dung môi chiết, số lần chiết Kết quả thu đƣợc cho thấy sự khả quan trong việc định lƣợng darutosid bằng HPLC Khi khảo sát chương trình gradient, chúng tôi đã tham khảo các nghiên cứu đã công bố và căn cứ vào thiết bị hiện có thì thấy rằng sử dụng chương trình gradient đẳng dòng Nước - Acetontril cho tín hiệu píc của darutosid tốt tại bước sóng 210 nm Kết quả khảo sát dung môi, số lần chiết cũng cho thấy hiệu suất chiết tốt khi chiết 1 lần hồi lưu cách thuỷ trong vòng 3 giờ với dung môi methanol Kết quả này giúp xây dựng đƣợc quy trình xử lý mẫu tối ƣu với số lần chiết hợp lý Sau quá trình thẩm định, đã xây dựng được một phương pháp hoàn chỉnh để định lượng darutosid trong dược liệu hy thiêm

Kết quả nghiên cứu đã bổ sung để hoàn thiện hơn nghiên cứu về dƣợc liệu hy thiêm, tạo cơ sở khoa học góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu hy thiêm

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Bàn luận

Sau thời gian ngắn nghiên cứu, chúng tôi đã hoàn thành đƣợc các mục tiêu của khóa luận tốt nghiệp với các kết quả thu nhƣ sau:

- Đã phân lập được darutosid trong dược liệu hy thiêm bằng phương pháp sắc ký cột, có độ tinh khiết 95%

- Đã xây dựng được phương pháp định tính darutosid bằng phương pháp TLC

- Đã xây dựng được phương pháp định lượng darutosid trong hy thiêm bằng phương pháp HPLC

- Áp dụng quy trình định lƣợng xây dựng đƣợc để định lƣợng darutosid trong hy thiêm ở vùng Thạch Thành, Thanh Hoá Kết quả thu đƣợc cho thấy mẫu dƣợc liệu hy thiêm thu hái đƣợc năm 2016 có hàm lƣợng darutosid khoảng 0,215%

- Tiến hành thêm các bước tinh chế để làm tăng độ tinh khiết của darutosid phân lập đƣợc trong nghiên cứu để thiết lập chất chuẩn

- Đưa phương pháp định tính bằng TLC, định lượng bằng HPLC đã xây dựng đƣợc vào tiêu chuẩn kiểm nghiệm dƣợc liệu hy thiêm

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam ,Nhà xuất bản Y học, Hà Nội

2 Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, Tập 1, tr 302- 303

3 Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 1, Nhà xuất bản Y Học, Hà

4 Nguyễn Thuỳ Dương (2012), Nghiên cứu tác dụng trên bệnh gút thực nghiệm của cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L Asteraceae), Luận án tiến sĩ dƣợc học, Viện Dƣợc liệu

5 Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học,

6 Lê Kiều Nhi (2001), Nghiên cứu hóa học của một số hoạt chất có tác dụng chống oxi hóa và chống nhiễm khuẩn từ cây Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis) và cây Bòn bọt (Glochidion ericarpum Champ) của Việt Nam, Luận án tiến sỹ hóa học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

7 Trần Thị Thu Phương (2010), Đánh giá tác dụng hạ acid uric máu của một số phân đoạn cây Hy thiêm trên chuột thực nghiệm, Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ,

Trường ĐH Dược Hà Nội

8 Viện dƣợc liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tập 1

9 Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Thực vật chí, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tập 7

10 Boyle SP, Dobson VL, Duthie SJ, Hinselwood DC, Kyle JA, Collins AR (2000),

“Biovailability and efficiency of rutin as an antioxidant a human supplementation study”, European Journal of Clinical Nutrition, 54(10), pp

11 C Zdero, F Bohlmann, R.M King, H Robinson (1991), “Sesquyterpene lactones and other constituents from Siegesbeckia orientalis and Guizotia scabra”, Physochemistry, 30(5), pp 1579- 1584

12 Fei Wang, Xue-Lian Cheng, Ya-Ju Li, Song Shi, Ji-Kai Liu (2009), “ent-

Pimarane Diterpenoids from Siegesbeckia orientalis and Structure Revision of a Related Compound”, Journal of Natural Products, 72 (11), 2005–2008

13 Ganson N J., Kelly S J., Scarlett E., Sundy J.S., Hershfield M S (2006),

“Control of hyperuricemia in subjects with refractory gout, and induction of antibody against poly (ethylene glycol) (PEG), in a phase I trial of subcutancous PEGylated urate oxidase”, Arthritis Reseach & Therapy, 8 (1), pp R12

14 Goud, P R., Nagaiah, K., Babu, K S., Sarma, V U M., Rasheed, N M A., &

Khan, I A (2014), “Isolation and quantification of bioactive compounds from Siegesbeckia orientalis L using HPLC”, Annals of Phytomedicine, 3(2), 66-69

15 Hwang WJ, Park EJ, Jang CH, Han SW, Oh GJ, KIm NS, KIm HM (2001),

“Inhibitory effect of immunoglobulin E production by Jin- Deuk- Chal (Siegesbeckia orientalis)”, Immunopharmacol Immunotoxicol, 23 (4), pp 555 -

16 Kang, D G., keun Yun, C., & Lee, H S (2003) Screening and comparison of antioxidant activity of solvent extracts of herbal medicines used in Korea, Journal of Ethnopharmacology, 87(2), 231-236

17 Lintner, K (1998), “Purified plant extracts”, Cosmetics and toiletries, 113(3),

18 Nguyen Hai Nam (2000), “Cytotoxie principle of Siegesbeckia orientalis growing in Viet Nam”, Journal of Chemistry, 38 (4), pp 84-86

19 Panchal Sunil K, Poudyal Hemant, Arumugam Thiruma V, and Brown Lindsay

(2011), “Rutin attenuates Metabolic Changes, Nonalcoholic Steatohepatitis, and Cardiovascular Remideling in high- Carbohydrate, High- Fat Diet- Fed Rats”,

JN the Journal of Nutrition, 11.137877

20 Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Hideaki Otsuka (2005), “ent-Pimarane-Type

Diterpenoids from Siegesbeckia orientalis L.”, Chem Pharm Bull, 53(2), 232-

21 Shyur Lie- Fen, Tsung Jieh- Hen, Chen Je- Hsin, Chiu Chih- Yang, and Lo

Chiu- Ping (2005), “Antioxident Properties of Extracts from Medicinal Plants

Popularly used in Taiwan”, International Journal of Applied Science and

22 Song, X L., Zhang, Q Y., Wang, Z M., Fu, H Z., & Qian, R Q (2011), “A rapid and simple RP‐HPLC method for quantification of kirenol in rat plasma after oral administration and its application to pharmacokinetic study”, Biomedical Chromatography, 25(5), 542-546

23 Son, P T., Giang, P M., & Taylor, W C (2005) “NMR studies of darutosid, a rare ENT-pimarane glucoside”, Natural product research, 19(5), 503-507

24 Su, J D., Osawa, T., & Namiki, M (1986), “Screening for antioxidative activity of crude drugs”, Agricultural and Biological Chemistry, 50(1), 199-203

25 TENG Tianli, XU Shifang, CHEN Fengyang, LI Xiaoyu, GAO Lijuan, YE

Yiping (2015), “Research ProgreSKĐ in Chemical Constituents and Pharmacological Activities of Siegesbeckiae Herba”, The Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy , 32(2), 250-260

26 Uma Devi P, Ganasoundari A, Vrinda B, Sinivasan K K, Unni Krishnan MK

(2000), “Radiation protection by the ocimum flavonoids orientin and vicenin: mechanisms of action”, Radiation Reseach, 154, pp 445- 460

27 Wang Li-Li, Hu Li-Hong (2006), “Chemical Constituents of Siegesbeckia orientalis L.”, Journal of Intergrative Plant Biology, 48 (8), 991−995

28 Weaver, A L (2008), “Epidemiology of gout”, Cleveland Clinic journal of medicine, 75, S9-12

29 Xiang Y, Zhang H, Fan CQ, Yue JM (2004), “Novel Diterpenoids and

Diterpenoid Glycosides from Siegesbeckia orientalis”, Journal of Natural Products, 67 (9), pp 1517–1521

30 Yin Ming Hao, Kang Dea Gill , Choi Deok Ho, Kwon Tae Oh, Lee Ho Sub

(2005), “Screeing of vasorelaxant activity of some medicinal plant used in Oriental medicines”, Journal of Ethnopharmacology 99, P.113-117

Tiêu đề	Góp Phần Nghiên Cứu Tiêu Chuẩn Hóa Dược Liệu Hy Thiêm (Herba Siegesbeckiae)
Tác giả	Lý Thị Hải Yến
Người hướng dẫn	ThS. Nguyễn Thị Phương, TS. Nguyễn Thị Thanh Bình
Trường học	Đại Học Quốc Gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược Học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	75
Dung lượng	2,21 MB