ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ac y, V NU KHOA Y DƢỢC Ph ar m LÝ THỊ HẢI YẾN M ed ici ne an d GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) Co py rig ht © Sc ho ol of KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ac y, V NU KHOA Y DƢỢC m LÝ THỊ HẢI YẾN ici ne an d Ph ar GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HĨA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) M Khóa: QH.2012.Y ed KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC of Ngƣời hƣớng dẫn: ho ol ThS Nguyễn Thị Phƣơng TS Nguyễn Thị Thanh Bình Sc Nơi thực hiện: Co py rig ht © Khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn – Viện dƣợc liệu Hà Nội – 2017 Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN NU Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Phƣơng TS Nguyễn Thị Thanh Bình ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tận tình, chu đáo, ln động viên khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời ac y, V gian thực khóa luận m Em xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu tập thể cán phòng Hố phân tích - tiêu chuẩn tạo điều kiện cho em đƣợc thực tập tham gia nghiên cứu học hỏi Viện Ph ar Em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè ngƣời thân gia đình tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập an d Trong suốt q trình làm khóa luận nghiên cứu Viện, em cố gắng nỗ lực để hồn thành khóa luận Tuy nhiên, kiến thức cịn hạn ne hẹp thời gian có hạn nên đề tài em không tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc góp ý thầy để khóa luận em đƣợc hồn thiện Co py rig ht © Sc ho ol of M ed ici Cuối em xin kính chúc thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc nhƣ sống Hà Nội, tháng 06 năm 2017 Sinh Viên Lý Thị Hải Yến MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ NU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ac y, V 1.1 Vị trí phân loại hy thiêm 1.2 Đặc điểm thực vật hy thiêm 1.2.1 Phân bố, sinh thái ar m 1.2.2 Thu hái chế biến Ph 1.3 Thành phần hóa học 1.3.1 Các diterpen an d 1.3.2 Các dẫn chất sesquyterpen ne 1.3.3 Các dẫn chất geranylnerol ici 1.3.4 Các flavonoid ed 1.3.5 Các steroid M 1.3.6 Một số hợp chất khác of 1.4 Tác dụng dƣợc lý ol 1.4.1.1 Tác dụng chống viêm ho 1.4.1.2 Tác dụng chống oxi hóa Sc 1.4.1.3 Tác dụng ức chế miễn dịch 1.4.1.4 Tác dụng chống dị ứng rig ht © 1.4.1.5 Độc với tế bào u sắc tố 1.4.1.6 Tác dụng chuyển hóa lipid py 1.4.1.7 Tác dụng kháng khuẩn Co 1.4.1.8 Tác dụng điều trị gout 1.4.1.9 Tác dụng khác 1.5 Tính vị, cơng năng, cơng dụng 1.5.1 Tính vị, cơng 1.5.2 Công dụng NU 1.6 Tổng quan darutosid 10 ac y, V 1.6.1 Cơng thức cấu tạo tính chất lý hố 10 1.6.2 Tác dụng darutosid 11 1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 11 ar m 1.7 Tổng quan phƣơng pháp sắc ký lỏng sắc ký lỏng hiệu cao 12 Ph 1.7.1 Vài nét phƣơng pháp TLC áp dụng nghiên cứu định tính 12 1.7.2 Vài nét phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 13 an d 1.7.2.1 Nguyên tắc phƣơng pháp HPLC 13 ne 1.7.2.2 Điều kiện sắc ký phân bố hiệu cao 14 1.7.2.3 Các phƣơng pháp định lƣợng HPLC 15 ed ici CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 M 2.1 Nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu 17 of 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 17 2.2.1 Thiết bị 17 ho ol 2.2.2 Dụng cụ 18 Sc 2.2.3 Hóa chất 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 © 3.1 Phân lập chất darutosid từ dƣợc liệu Hy thiêm 18 rig ht 3.2 Định tính darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm TLC 19 py 3.3 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm HPLC 19 Co 3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid HPLC 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử 19 2.4.2 Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 19 2.4.2.1 Phƣơng pháp phân lập darutosid dƣợc liệu hy thiêm 19 NU 2.4.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc darutosid 21 ac y, V 2.4.4 Phƣơng pháp định tính dƣợc liệu hy thiêm TLC 21 2.4.5 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm phƣơng pháp HPLC 21 m 2.4.6 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid HPLC 22 Ph ar 2.4.6.1 Tính chọn lọc phƣơng pháp 22 2.4.6.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 22 an d CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 25 3.1 Chiết xuất phân lập 25 ne 3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ Hy thiêm 25 ici 3.1.2 Phân lập 26 ed 3.1.3 Xác định cấu trúc hoá học HT1 27 M 3.1.4 Xác định độ tinh khiết darutosid 30 ol of 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính chất darutosid phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) 30 Sc ho 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng chất darutosid phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 32 © 3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 32 rig ht 3.3.1.1 Lựa chọn pha tĩnh 32 3.3.1.2 Chọn bƣớc sóng phân tích 32 py 3.3.1.3 Khảo sát dung môi pha động 32 Co 3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 34 3.4 Thẩm định phƣơng pháp 37 3.4.1 Tính thích hợp hệ thống 37 3.4.2 Tính chọn lọc 39 3.4.3 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 39 NU 3.4.4 Xây dựng đƣờng chuẩn xác định khoảng tuyến tính 40 ac y, V 3.4.5 Thẩm định độ lặp lại 41 3.4.7 Thẩm định độ thu hồi 43 3.5 Bàn luận 44 ar m KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 Ph TÀI LIỆU THAM KHẢO Co py rig ht © Sc ho ol of M ed ici ne an d PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Butanol DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DMC Dichloromethane EtOAC Ethyl acetat EtOH Ethanol MeOH Methanol Hex Hexan HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquyd Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation) M Khối lƣợng phân tử ( MaSKĐ) MS Phổ khối (MaSKĐ Spectroscopy) NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition) ac y, V m ar Ph d an ne ici ed M of ol ho Sc © rig ht Hệ số lƣu Sắc ký lớp mỏng TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UV Phổ tử ngoại (Ultra violet) Co SKLM py Rf NU But DANH MỤC BẢNG NU Trang Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất HT1 darutosid ac y, V theo tài liệu tham khảo Bảng 3.2: Kết khảo sát chƣơng trình gradient ar m Bảng 3.3: Các thơng số khảo sát chƣơng trình gradient Ph Bảng 3.4: Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu d Bảng 3.5: Khảo sát thời gian chiết mẫu an Bảng 3.6: Khảo sát số lần chiết mẫu 33 34 35 36 37 38 Bảng 3.8: Kết xác định LOD LOQ 40 ed ici ne Bảng 3.7: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống M Bảng 3.9: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 40 42 Bảng 3.11: Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp 43 ho ol of Bảng 3.10: Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp Co py rig ht © Sc Bảng 3.12: Hàm lƣợng darutosid mẫu dƣợc liệu hy thiêm 44 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ ac y, V Hình 1.1: Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) NU Trang Hình 1.2: Một số ent- pimaran ent- kauran phân lập từ S orientalis Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo số dẫn chất sesquyterpen lacton ar m nhóm germancranlid phân lập từ S orientalis Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo số dẫn chất geranylnerol an d Ph Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo số dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm melampolid ne Hình 1.6: Công thức cấu tạo flavonoid phân lập từ S orientalis ici Hình 1.7: Cơng thức cấu tạo darutosid ed Hình 2.1: Dƣợc liệu hy thiêm M Hình 3.1: Sắc ký đồ darutosid phân lập đƣợc of Hình 3.2: Sắc ký đồ hệ dung môi ol Hình 3.3 : Sắc ký đồ chƣơng trình gradient 10 17 30 31 34 38 Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thêm chuẩn 39 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn phƣơng trình hồi quy tuyến tính darutosid 41 rig ht © Sc ho Hình 3.3: Khảo sát tính phù hợp hệ thống 25 Sơ đồ 3.2: Tóm tắt quy trình phân lập darutosid cao ethyl acetat từ 27 py Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao hy thiêm Co dƣợc liệu hy thiêm Co py rig ht © Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph ar m ac y, V NU Phụ lục 1: Phổ NMR phổ MS darutosid rig ht py Co © ol ho Sc of ne ici ed M d an ar Ph ac y, V m NU rig ht py Co © ol ho Sc of ne ici ed M d an ar Ph ac y, V m NU rig ht py Co © ol ho Sc of ne ici ed M d an ar Ph ac y, V m NU rig ht py Co © ol ho Sc of ne ici ed M d an ar Ph ac y, V m NU rig ht py Co © ol ho Sc of ne ici ed M d an ar Ph ac y, V m NU rig ht py Co © ol ho Sc of ne ici ed M d an ar Ph ac y, V m NU rig ht py Co © ol ho Sc of ne ici ed M d an ar Ph ac y, V m NU Phụ lục 2: SKĐ chƣơng trình gradient ici ne an d Ph ar m ac y, V NU Gradient Co py rig ht © Sc ho ol of M ed Gradient Phụ lục 3: SKĐ phƣơng pháp chiết mẫu Chiết hồi lƣu 2h mV NU Detector A Ch1:210nm ac y, V 125 100 m 75 ar 50 Ph 811767 25 -25 an 1748 d 5.0 15.0 10.0 20.0 25.0 30.0 ed ici 0.0 ne -50 Siêu âm 2h M mV Detector A Ch1:210nm of 100 ol 75 25 rig ht 500 1893 © 485599 Sc ho 50 -25 py -50 Co -75 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 Phụ lục 4: SKĐ thời gian chiết Chiết hồi lƣu 1h mV NU 50 Detector A Ch1:210nm 40 ac y, V 30 20 10 ar 3355 -20 1031 19452 -10 m 521768 Ph -30 -40 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in an d Chiết hồi lƣu 2h 125 mV Detector A Ch1:210nm ne 100 ici 75 of -25 2846 M 25 849816 ed 50 5.0 10.0 15.0 ho 0.0 ol -50 20.0 25.0 30.0 35.0 m in Sc Chiết hồi lƣu 3h mV Detector A Ch1:210nm 150 125 © 100 75 rig ht 50 25 -25 py -50 998314 -75 Co -100 -125 -150 -175 -200 -225 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in Phụ lục 5: SKĐ số lần chiết Chiết lần NU mV Detector A Ch1:210nm -25 ac y, V -50 -75 994031 -100 m -125 ar -150 -200 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Ph -175 30.0 35.0 40.0 m in 30.0 35.0 40.0 m in 30.0 35.0 40.0 m in d Chiết lần an mV Detector A Ch1:210nm ne -25 ed -75 M -100 -125 of -150 993882 ici -50 5.0 10.0 15.0 ho 0.0 ol -175 25.0 Chiết lần Sc mV 20.0 Detector A Ch1:210nm © -25 rig ht -50 -75 py 999542 -100 Co -125 -150 -175 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Phụ lục 6: SKĐ độ lặp mV mV Detector A Ch1:210nm 150 Detector A Ch1:210nm 300 125 100 200 NU 75 100 50 25 998314 0 -100 -50 849549 -75 -100 -200 4565 619738 -125 -150 -300 -175 -400 -200 -225 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0.0 mi n 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 25.0 30.0 35.0 40.0 25.0 30.0 35.0 40.0 mV Ph ar m 0.0 ac y, V -25 mV Detector A Ch1:210nm -25 -25 -50 -50 an d Detector A Ch1:210nm -75 1016325 -75 957880 -100 ne -100 2209 -125 ici -125 -150 -150 -175 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 15.0 20.0 of M 0.0 ed -175 mV Detector A Ch1:210nm 100 mV Detector A Ch1:210nm ol -25 ho -50 1064134 -50 -75 Sc -100 -100 -125 © -150 -200 rig ht -250 5.0 Co py 0.0 10.0 15.0 996883 50 -150 -175 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0.0 5.0 10.0 Phụ lục 7: SKĐ độ thu hồi NU Mức mV Detector A Ch1:210nm ac y, V 150 100 50 9972 -100 Ph 1633034 -50 ar m an d -150 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 ed ici 0.0 ne -200 M Mức mV of Detector A Ch1:210nm ol 250 ho 200 © 100 2169599 Sc 150 rig ht 50 Co py -50 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 rig ht py Co © ol ho Sc of ne ici ed M d an ar Ph ac y, V m NU ... cấp tiêu chuẩn dƣợc liệu hy thiêm, đề tài ? ?Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu hy thiêm (Herba Siegesbeckia)? ?? đƣợc thực với mục tiêu: Co py - Định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm. .. Y DƢỢC m LÝ THỊ HẢI YẾN ici ne an d Ph ar GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HĨA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) M Khóa: QH.2012.Y ed KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC of Ngƣời... Sc 2.2.3 Hóa chất 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 © 3.1 Phân lập chất darutosid từ dƣợc liệu Hy thiêm 18 rig ht 3.2 Định tính darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm TLC