Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu hy thiêm (Herba Siegesbeckia)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC LÝ THỊ HẢI YẾN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC LÝ THỊ HẢI YẾN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Thị Phƣơng TS Nguyễn Thị Thanh Bình Nơi thực hiện: Khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn – Viện dƣợc liệu Hà Nội – 2017 Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Phƣơng TS Nguyễn Thị Thanh Bình ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tận tình, chu đáo, ln động viên khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực khóa luận Em xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu tập thể cán phịng Hố phân tích - tiêu chuẩn tạo điều kiện cho em đƣợc thực tập tham gia nghiên cứu học hỏi Viện Em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè ngƣời thân gia đình ln tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập Trong suốt trình làm khóa luận nghiên cứu Viện, em cố gắng nỗ lực để hồn thành khóa luận Tuy nhiên, kiến thức cịn hạn hẹp thời gian có hạn nên đề tài em khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc góp ý thầy để khóa luận em đƣợc hoàn thiện Cuối em xin kính chúc thầy ln mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc nhƣ sống Hà Nội, tháng 06 năm 2017 Sinh Viên Lý Thị Hải Yến MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại hy thiêm 1.2 Đặc điểm thực vật hy thiêm 1.2.1 Phân bố, sinh thái 1.2.2 Thu hái chế biến 1.3 Thành phần hóa học 1.3.1 Các diterpen 1.3.2 Các dẫn chất sesquyterpen 1.3.3 Các dẫn chất geranylnerol 1.3.4 Các flavonoid 1.3.5 Các steroid 1.3.6 Một số hợp chất khác 1.4 Tác dụng dƣợc lý 1.4.1.1 Tác dụng chống viêm 1.4.1.2 Tác dụng chống oxi hóa 1.4.1.3 Tác dụng ức chế miễn dịch 1.4.1.4 Tác dụng chống dị ứng 1.4.1.5 Độc với tế bào u sắc tố 1.4.1.6 Tác dụng chuyển hóa lipid 1.4.1.7 Tác dụng kháng khuẩn 1.4.1.8 Tác dụng điều trị gout 1.4.1.9 Tác dụng khác 1.5 Tính vị, cơng năng, công dụng 1.5.1 Tính vị, cơng 1.5.2 Công dụng 1.6 Tổng quan darutosid 10 1.6.1 Công thức cấu tạo tính chất lý hố 10 1.6.2 Tác dụng darutosid 11 1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 11 1.7 Tổng quan phƣơng pháp sắc ký lỏng sắc ký lỏng hiệu cao 12 1.7.1 Vài nét phƣơng pháp TLC áp dụng nghiên cứu định tính 12 1.7.2 Vài nét phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 13 1.7.2.1 Nguyên tắc phƣơng pháp HPLC 13 1.7.2.2 Điều kiện sắc ký phân bố hiệu cao 14 1.7.2.3 Các phƣơng pháp định lƣợng HPLC 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu 17 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 17 2.2.1 Thiết bị 17 2.2.2 Dụng cụ 18 2.2.3 Hóa chất 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 3.1 Phân lập chất darutosid từ dƣợc liệu Hy thiêm 18 3.2 Định tính darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm TLC 19 3.3 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm HPLC 19 3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid HPLC 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử 19 2.4.2 Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 19 2.4.2.1 Phƣơng pháp phân lập darutosid dƣợc liệu hy thiêm 19 2.4.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc darutosid 21 2.4.4 Phƣơng pháp định tính dƣợc liệu hy thiêm TLC 21 2.4.5 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm phƣơng pháp HPLC 21 2.4.6 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid HPLC 22 2.4.6.1 Tính chọn lọc phƣơng pháp 22 2.4.6.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 25 3.1 Chiết xuất phân lập 25 3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ Hy thiêm 25 3.1.2 Phân lập 26 3.1.3 Xác định cấu trúc hoá học HT1 27 3.1.4 Xác định độ tinh khiết darutosid 30 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính chất darutosid phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) 30 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng chất darutosid phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 32 3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 32 3.3.1.1 Lựa chọn pha tĩnh 32 3.3.1.2 Chọn bƣớc sóng phân tích 32 3.3.1.3 Khảo sát dung môi pha động 32 3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 34 3.4 Thẩm định phƣơng pháp 37 3.4.1 Tính thích hợp hệ thống 37 3.4.2 Tính chọn lọc 39 3.4.3 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 39 3.4.4 Xây dựng đƣờng chuẩn xác định khoảng tuyến tính 40 3.4.5 Thẩm định độ lặp lại 41 3.4.7 Thẩm định độ thu hồi 43 3.5 Bàn luận 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT But Butanol DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DMC Dichloromethane EtOAC Ethyl acetat EtOH Ethanol MeOH Methanol Hex Hexan HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquyd Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation) M Khối lƣợng phân tử ( MaSKĐ) MS Phổ khối (MaSKĐ Spectroscopy) NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition) Rf Hệ số lƣu SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UV Phổ tử ngoại (Ultra violet) DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất HT1 darutosid theo tài liệu tham khảo Bảng 3.2: Kết khảo sát chƣơng trình gradient 33 Bảng 3.3: Các thơng số khảo sát chƣơng trình gradient 34 Bảng 3.4: Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu 35 Bảng 3.5: Khảo sát thời gian chiết mẫu 36 Bảng 3.6: Khảo sát số lần chiết mẫu 37 Bảng 3.7: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống 38 Bảng 3.8: Kết xác định LOD LOQ 40 Bảng 3.9: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 40 Bảng 3.10: Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp 42 Bảng 3.11: Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp 43 Bảng 3.12: Hàm lƣợng darutosid mẫu dƣợc liệu hy thiêm 44 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) Hình 1.2: Một số ent- pimaran ent- kauran phân lập từ S orientalis Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo số dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm germancranlid phân lập từ S orientalis Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo số dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm melampolid Hình 1.5: Công thức cấu tạo số dẫn chất geranylnerol Hình 1.6: Cơng thức cấu tạo flavonoid phân lập từ S orientalis Hình 1.7: Cơng thức cấu tạo darutosid 10 Hình 2.1: Dƣợc liệu hy thiêm 17 Hình 3.1: Sắc ký đồ darutosid phân lập đƣợc 30 Hình 3.2: Sắc ký đồ hệ dung mơi 31 Hình 3.3 : Sắc ký đồ chƣơng trình gradient 34 Hình 3.3: Khảo sát tính phù hợp hệ thống 38 Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thêm chuẩn 39 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn phƣơng trình hồi quy tuyến tính darutosid 41 Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao hy thiêm 25 Sơ đồ 3.2: Tóm tắt quy trình phân lập darutosid cao ethyl acetat từ 27 dƣợc liệu hy thiêm Phụ lục 1: Phổ NMR phổ MS darutosid Phụ lục 2: SKĐ chƣơng trình gradient Gradient Gradient Phụ lục 3: SKĐ phƣơng pháp chiết mẫu Chiết hồi lƣu 2h mV Detector A Ch1:210nm 125 100 75 50 811767 25 1748 -25 -50 0.0 5.0 15.0 10.0 20.0 25.0 30.0 Siêu âm 2h mV 100 Detector A Ch1:210nm 75 50 485599 25 500 1893 -25 -50 -75 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 Phụ lục 4: SKĐ thời gian chiết Chiết hồi lƣu 1h mV 50 Detector A Ch1:210nm 40 30 20 10 521768 3355 -20 1031 19452 -10 -30 -40 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in Chiết hồi lƣu 2h 125 mV Detector A Ch1:210nm 100 75 50 849816 25 2846 -25 -50 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 m in Chiết hồi lƣu 3h mV Detector A Ch1:210nm 150 125 100 75 50 25 -25 -50 998314 -75 -100 -125 -150 -175 -200 -225 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in Phụ lục 5: SKĐ số lần chiết Chiết lần mV Detector A Ch1:210nm -25 -50 -75 994031 -100 -125 -150 -175 -200 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in 30.0 35.0 40.0 m in 30.0 35.0 40.0 m in Chiết lần mV Detector A Ch1:210nm -25 -50 -75 993882 -100 -125 -150 -175 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Chiết lần mV Detector A Ch1:210nm -25 -50 -75 999542 -100 -125 -150 -175 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Phụ lục 6: SKĐ độ lặp mV mV Detector A Ch1:210nm 150 Detector A Ch1:210nm 300 125 100 200 75 100 50 25 998314 0 -25 -100 -50 849549 -75 -100 -200 4565 619738 -125 -150 -300 -175 -400 -200 -225 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0.0 mi n mV 5.0 10.0 15.0 20.0 10.0 15.0 20.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 25.0 30.0 35.0 40.0 25.0 30.0 35.0 40.0 mV Detector A Ch1:210nm Detector A Ch1:210nm -25 -25 -50 -50 -75 -75 1016325 -125 -125 -150 -150 957880 -100 2209 -100 -175 -175 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0.0 mV 5.0 mV Detector A Ch1:210nm Detector A Ch1:210nm 100 50 -25 -50 1064134 -50 -75 996883 -100 -100 -150 -125 -200 -150 -250 -175 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0.0 5.0 10.0 Phụ lục 7: SKĐ độ thu hồi Mức mV Detector A Ch1:210nm 150 100 50 1633034 -50 9972 -100 -150 -200 0.0 5.0 10.0 15.0 25.0 20.0 30.0 35.0 40.0 Mức mV Detector A Ch1:210nm 250 200 150 2169599 100 50 -50 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 ... tài ? ?Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu hy thiêm (Herba Siegesbeckia)? ?? đƣợc thực với mục tiêu: - Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm - Định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm. .. NỘI KHOA Y DƢỢC LÝ THỊ HẢI YẾN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Nguyễn... 2.4.2 Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 2.4.2.1 Phƣơng pháp phân lập darutosid dƣợc liệu hy thiêm - Chiết xuất cao phân đoạn từ hy thiêm Dƣợc liệu hy thiêm đƣợc chiết nóng với ethanol