Bước đầu nghiên cứu và xác định thành phần hóa học và tiêu chuẩn hóa dược liệu thường xuân

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO DUY HOÀNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU THƯỜNG XUÂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014...

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO DUY HOÀNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU THƯỜNG

XUÂN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO DUY HOÀNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU THƯỜNG

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian năm năm tôi học tập tại trường

Xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ thầy cô, anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi về điều kiện cũng như kỹ thuật để tôi có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm tại bộ môn

Với tất cả lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi tới:

ThS.Thân Thị Kiều My, ThS.Phạm Tuấn Anh, Bộ môn Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội và TS.Trần Minh Ngọc, Khoa Bào chế và chế biến Viện

Dược liệu là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận Các thầy cô đã dành nhiều thời gian và tâm huyết tận tình chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận Các thầy cô còn là tấm gương về tác phong làm việc và lối sống đạo đức cho tôi noi theo

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Đào Duy Hoàng

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Hedera 2

1.1.1 Vị trí phân loại chi Hedera 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Phân bố 2

1.1.4 Thành phần hóa học lá thường xuân (Hedera helix L., Araliaceae) 3 1.1.5 Công dụng trong y dược học 10

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ 15

2.1.3 Thiết bị và máy móc sử dụng 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Xác định thành phần hóa học trong lá thường xuân 16

2.2.2 Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm của dược liệu thường xuân 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Xác định thành phần hóa học lá thường xuân 16

2.3.2 Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18

3.1 Sơ bộ xác định thành phần hóa học lá thường xuân 18

3.2 Khảo sát xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu Thường xuân 27

3.2.1 Mô tả dược liệu 27

3.2.2 Soi bột 28

3.2.3 Vi phẫu 29

3.2.4 Sắc ký lớp mỏng 31

3.2.5 Độ ẩm 33

3.2.6 Tro toàn phần 33

3.2.7 Xác định các chất chiết được bằng ethanol (phương pháp chiết nóng) 34

3.2.8 Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp cân 35

3.3 Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Thường xuân 37

3.4 Bàn luận 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.13 Định lượng saponin bằng phương pháp cân 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Một số đặc điểm bột dược liệu thường xuân 29

3.3 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết lá thường xuân

so sánh với dịch cao khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại

bước sóng 254nm (a), 366nm (b), sau khi hiện màu bằng

thuốc thử anisaldehyd- acid sulfuric (c)

32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên được thiên nhiên ưu đãi cho hệ thực vật phong phú và đa dạng, trong đó đặc biệt phải kể đến nhóm tài nguyên cây thuốc

Theo kết quả điều tra của Viện Dược liệu năm 2006, Việt Nam có 3948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc Tuy nhiên, phần lớn các cây thuốc được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo Y học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu một cách chuyên sâu và đầy đủ

Trong hệ thực vật đó, thường xuân (Hedera helix L., Araliaceae) đã được

các nhà khoa học trên thế giới chứng minh có nhiều tác dụng dược lý trong điều trị các bệnh về hô hấp, nhiễm khuẩn, bảo vệ gan … và đã được phát triển thành thuốc điều trị các chứng bệnh viêm đường hô hấp cấp và mạn tính (Prospan)

Tuy vậy, ở Việt Nam, loài thường xuân (Hedera nepalensis var sinensis

(Tobler) Rehder, Araliaceae) chủ yếu được dùng làm cây cảnh và chưa có

một nghiên cứu được công bố nào về thành phần hoá học, tác dụng dược lý, cũng như ứng dụng làm thuốc chữa bệnh Vì vậy, để góp phần sáng tỏ thành phần hoá học và sử dụng cây thường xuân ở Việt Nam làm thuốc trong lĩnh vực dược liệu và y học cổ truyền, tôi thực hiện nghiên cứu: “Bước đầu nghiên cứu xác định thành phần hóa học và tiêu chuẩn hóa dược liệu thường xuân” với 2 mục tiêu:

 Xác định được các nhóm thành phần hóa học của dược liệu thường xuân ở Việt Nam

 Tiêu chuẩn hóa dược liệu thường xuân

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Hedera

1.1.1 Vị trí phân loại chi Hedera

Theo các tài liệu [4], [6], [7], vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân

loại thực vật dược như sau:

Cây leo thường xanh có nhiều rễ móc khí sinh, không có gai Lá mọc so le

Lá đơn không có lá kèm, phiến lá phân thùy, dài 5-10cm, rộng 3-8cm, gân chân vịt Cụm hoa chùy, gồm nhiều tán, có lông sao Hoa nhỏ, màu vàng trắng và lục trắng; lá bắc rất nhỏ; dài có 5 răng nhỏ; tràng 5, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa; nhị 5; bầu 5 Quả hạch tròn, khi chín màu đen [8], [9], [10]

1.1.3 Phân bố

Thường xuân phát triển tự nhiên ở miền Tây, trung tâm và Nam châu Âu nhưng giờ nó cũng được đưa vào Bắc Mỹ và châu Á Nó là 1 loại cây cảnh phổ biến tại nhiều nước [23]

Ở châu Á, chúng phân bố ở vùng nhiệt đới ẩm và ôn đới ẩm, từ vùng cận Himalaya thuộc Ấn Độ qua Tây- Nam Trung Quốc xuống Bắc Việt Nam [8]

Tại Việt Nam tìm thấy loài Hedera nepalensis var sinensis (Tobler)

Rehder, Araliaceae ở Lào Cai (Sapa), Lai Châu ở độ cao trên 1300m [6], [9]

1.1.4 Thành phần hóa học lá thường xuân (Hedera helix L.,

Araliaceae)

Các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu xác định trong lá thường

xuân Hedera helix L., Araliaceae có các nhóm hoạt chất như: saponin,

flavonoid, courmarin, polyacetylen, phenolic acid, anthocyanin, sterol,

alkaloid, vitamin… cụ thể được tổng hợp trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học lá thường xuân

α-hederin

1,5-2,5

[18] [36]

Coumarin Scopolin

(scopoletin glycoside)

7-O-[18]

[16] 11,12-dehydro

falcarinol

[16] Phenolic

quinic

3,5-O-dicaffeoyl-

0,5-1

[28] [37]

quinic

Limonene [28]

1.1.5 Công dụng trong y dược học

Theo y học cổ truyền:

 Bộ phận dùng: Thân dây, lá, hạt, có thể thu hái quanh năm [9], [10]

 Tính vị, tác dụng: Vị cay, tính ấm; có tác dụng khu phong, lợi thấp,

Theo y học hiện đại: Tác dụng dược lý của Hedera helix L., Araliaceae

đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu

 Tác dụng trên hô hấp

Lá cây thường xuân thường dùng để điều trị các bệnh đường hô hấp có tiết nhiều chất nhầy, sự nhiễm trùng đường hô hấp và các loại ho bắt nguồn từ không khí lạnh [27]

Thường xuân từ lâu đã được sử dụng rộng rãi để điều trị hen phế quản Một nghiên cứu ở Đức trong hen phế quản ở trẻ em chứng minh rằng dịch

chiết lá thường xuân có tác dụng tốt với bệnh hen phế quản mạn tính ở trẻ [20]

Nhiều nghiên cứu kết luận rằng dịch chiết lá thường xuân có hiệu quả để điều trị nhiễm trùng đường hô hấp trên cấp tính Sau 7 đến 10 ngày điều trị, các triệu chứng như ho, khạc đờm được cải thiện hoặc chữa khỏi ở phần lớn bệnh nhân [21], [26]

Trong một nghiên cứu hồi quy, sau 5-8 ngày, các triệu chứng ho cấp tính ở 50-75% trẻ em được cải thiện hoặc biến mất Sau 1 tuần, khoảng 50% bệnh nhân đã hết triệu chứng ho và khoảng hơn 90% bệnh nhân chứng ho đã được cải thiện [15], [19], [21]

 Tác dụng kháng viêm

Cả saponin thô hay saponin đã được tinh chế trong dịch chiết thường xuân đều có tác dụng kháng viêm cấp tính và mạn tính trên chuột Indomethacin được đem ra đối chiếu (89.2% kháng viêm cấp tính) trong khi saponin thô trong dịch chiết dùng với liều 100-200 mg/kg có tác dụng kháng viêm cấp tính 77% Đối với thử nghiệm kháng viêm mạn tính, indomethacin có hiệu lực 66%, dịch chiết saponin đã được tinh chế 60% còn saponin thô là 49% [34] Dịch chiết thường xuân với ethanol khi tiêm phúc mạc với liều 7,5ml/kg cho thấy hoạt động kháng viêm bằng 88,89% so với diclofenac (thuốc có tác dụng ức chế 94,44% phù nề chân do formalin) Phù nề chân do formalin có nhiều điểm giống với viêm khớp nên dịch chiết ethanol của thường xuân có thể có tiềm năng chống lại viêm khớp [33]

 Tác dụng trên nhu động ruột

Các thí nghiệm trên chuột có kết quả: dùng α-hederin với nồng độ cao 350µM gây ra thay đổi lớn trên hoạt động vận động tự nhiên của cơ trơn dạ dày chuột Phản ứng quan sát được là co cơ trơn, cường độ co phụ thuộc vào nồng độ Thí nghiệm với hederacosid C cho thấy nếu dùng với nồng độ đến

25-100µM dạ dày bị cô lập không bị ảnh hưởng, tuy nhiên nếu dùng nồng độ 350µM nó sẽ tập trung 1 nồng độ đáng kể ở cơ trơn Bên cạnh đó, toàn bộ dịch chiết thường xuân trong 1 liều chứa 60µM hederacosid C tạo ra 1 sự co bóp mạnh tương đương với co bóp do acetylcholine Theo kết quả trên, có khả năng là α-hederin chứ không phải hederacosid C gây ra co bóp dạ dày chuột [31]

 Hoạt động chống co thắt

Các saponin có trong lá thường xuân cùng với các hederagenin thu được bằng cách thủy phân, các hợp chất phenolic: quercetin, kaempferol và acid 3,5-O-dicaffeoyl-quinic cho thấy hoạt động chống co thắt do acetylcholine gây ra trong hồi tràng của chuột lang được cô lập [36]

 Hoạt tính kháng sinh

Hỗn hợp các saponin trong lá thường xuân với 1 lượng lớn hederacosid C cho thấy khả năng chống lại 23 chủng gồm 22 vi khuẩn và 1 chủng nấm men:

vi khuẩn Gram(+) (Bacillus spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp.,

Streptococcus spp.) có giá trị MIC 0,3-1,25 mg/ml ; với vi khuẩn Gram(-)

(Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas spp., Escherichia coli, Proteus

vulgaris) có MIC 1,25-5mg/ml và Candida albicans MIC=2,5mg/ml [11]

Dịch chiết nước của lá thường xuân ức chế sự phát triển của

Staphylococcus aureus cũng như 1 số vi khuẩn và nấm phân lập từ bệnh nhân: Pseudomonas aeruginosa, Trichophyton rubrum, T mentagrophytes, Microsporum canis, Escherichia coli và Candida albicans [22]

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy so với nấm men không được điều trị, α-hederin gây ra sự thay đổi tế bào chất và màng tế bào gây ra sự suy

thoái và cái chết của Candida albicans [32]

Polyacetylens: falcarinone và falcarinol cũng có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn trong dịch chiết lá thường xuân [28]

Hederacoside C cũng đã được báo cáo là có tác dụng kháng virus cúm A2/Japan-305 ở nồng độ 100µg/ml [14]

 Diệt giun sán

Phức hợp saponin (CS60: 60% hederasaponin C với hederasaponin B với các phenolic), phức hợp saponin đã được tinh chế (CSP90: 90% hederasaponin C với hederasaponin B mà không có các phenolic) và α-

hederin được đánh giá trong ống nghiệm sử dụng các loài sán lá gan Fatsiola

và Dicrocoelium spp cũng như trên cơ thể trong cừu bị nhiễm Dicrocoelium Với thí nghiệm trên ống nghiệm, sau 24 giờ cả Fatsiola và Dicrocoelium đều

bị giết lần lượt bởi α-hederin ở nồng độ 5 và 1 µg/ml Khi cừu nhiễm

Dicrocoelium được điều trị với CS60 và CSP90, trứng sán trong phân của cừu

biến mất sau 3 liều (1 liều 500 và 2 liều 800mg/kg), trong khi đó dùng hederin với liều như trên quan sát thấy số lượng trứng sán giảm [25]

α-Hoat động ức chế trứng và giun trưởng thành (loài Haemonchus contortus)

đã được chứng minh có trong dich chiết nước và cồn của quả chín thường xuân ED50 để ức chế nở trứng tương ứng với dịch chiết nước và cồn là 0,12

và 0,17 mg/ml Dịch chiết cồn trong thí nghiệm in vitro cho thấy khả năng chống lại giun trưởng thành tốt hơn so với dịch chiết nước [13]

Ở thí nghiệm in vitro α-hederin và hederagenin cho thấy có khả năng ức

chế hoạt động của Trypanosoma brucei đặc biệt là α-hederin (MIC=25µg/ml)

Hederacosid C và D cho thấy không có tác dụng này ở nồng độ cao hơn 100mg/ml [35]

Các thí nghiệm sau đó khẳng định α và β-hederin ảnh hưởng lên tất cả các

giai đoạn phát triển của L.infantum trong ống nghiệm Chúng ức chế giai đoạn

promastigote bằng cách thay đổi màng của ký sinh trùng, cơ chế thứ 2 có thể được quan sát trong bạch cầu đơn nhân là ức chế sự tổng hợp AND và protein [12]

 Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan

α-hederin và hederacosid C cho thấy khả năng chống oxy hóa tốt trong ống nghiệm Khả năng này được so sánh với 1 số chất chống oxy hóa như α-tocoferol, BHA và BHT [17]

Sử dụng với α-hederin trước khi dùng CCl4 ngăn chặn đáng kể sự tăng alanine aminotransferase huyết thanh, hoạt động của lactat dehydrogenase và oxy hóa lipid, nó cũng ngăn chặn sự suy giảm glutathione gan [24]

 Khả năng chống lại khối u

Các bidesmoside (hederacosid B,C,D) và các monodesmoside hederin) cùng với hederagenin được thử nghiệm trên 4 dòng tế bào động vật

(α-,β-,δ-có vú Kết quả cho thấy các saponin hoạt động kém hơn 5 lần so với hợp chất tham khảo (strychnopentamine) và không chất nào trong số chúng có tác dụng

cụ thể nào về tế bào ung thư Các hợp chất hoạt động mạnh nhất là các monodesmoside (α và β-hederin) trong đó thể hiện khả năng gây độc trên tất

cả các dòng tế bào ở nồng độ 10mg/ml và cao hơn Các bidesmoside không hoạt động ở nồng độ lên đến 200mg/ml [24]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Dược liệu là lá cây thu hái vào tháng 4/2013 tại Sapa, Lào Cai Mẫu cây được xử lý, ép và lưu tại khoa Tài nguyên Dược liệu- Viện Dược liệu Dựa vào khóa phân loại, TS Phạm Thanh Huyền, trưởng khoa tài nguyên dược

liệu đã giám định tên khoa học là Hedera nepalensis var sinensis (Tobler)

Rehder, Araliaceae

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

 Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích, gồm có:

o Các dung môi: methanol, cồn tuyệt đối, cồn 96o, cồn tuyệt đối, toluen, EtOAc, …

o Hóa chất vô cơ: NaOH, FeCl3, HCl, Mg, acid acetic 5%, Javen …

o Thuốc nhuộm vi phẫu: Xanh methylen, đỏ son phèn

o Cao tiêu chuẩn lá thường xuân (lô A231/018/A13, xuất xứ: Công ty Naturex Pháp, Công ty nhập khẩu: Medistar Việt Nam)

 Dụng cụ thí nghiệm:

o Pipet, ống nghiệm, bình cầu, cốc có mỏ, ống đong, phễu, …

o Bộ dụng cụ chiết hồi lưu

2.1.3 Thiết bị và máy móc sử dụng

 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S9 (Thụy Sĩ)

 Máy đo độ ẩm Sartorius

 Tủ sấy Memmert (Đức)

 Kính hiển vi Leica (Đức)

 Máy cắt vi phẫu cầm tay

 Máy ảnh Canon

 Lò nung Naberthern

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xác định thành phần hóa học trong lá thường xuân

2.2.2 Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm của dược liệu thường xuân

 Mô tả dược liệu

 Định lượng bằng phương pháp cân

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định thành phần hóa học lá thường xuân

Định tính các hơp chất có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học theo phương pháp ghi trong tài liệu [1]

2.3.2 Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm

Cảm quan: Quan sát mẫu ở ánh sáng thường Mô tả hình dạng, kích thước, màu sắc, mùi vị và thể chất của dược liệu [2]

Soi bột: Sấy khô dược liệu trong tủ sấy 100oC sau đó dùng thuyền tán và chày cối sứ nghiền nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột [1], [4], [5]

Đặc điểm vi phẫu: mẫu lá thường xuân được cắt vi phẫu bằng máy cắt

cầm tay, tẩy bằng Javen, nhuộm vi phẫu theo phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm vi phẫu [1], [4], [5]

Kiểm nghiệm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng: Định tính dược liệu

thường xuân bằng SKLM theo phụ lục 5.4 trong Dược điển Việt Nam IV [3]

Độ ẩm

 Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là

độ ẩm an toàn, qua độ ẩm đó thì dược liệu dễ bị mốc, hư hỏng Việc xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho dược liệu là xác định giới hạn tối đa cho phép của một dược liệu để nó có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản [2]

 Xác định độ ẩm bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô hay phương pháp sấy theo phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam IV [3]

Tro toàn phần

 Tro toàn phần là lượng cắn vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu Cắn vô cơ có cấu tạo chủ yếu là các carbonat và oxyd kim loại [2]

 Tiến hành tro hóa hoàn toàn mẫu thử tại một điều kiện nung nhất định trong 1g mẫu thử theo phụ lục 9.8 Dược điển Việt Nam IV [3]

Xác định chất chiết được trong dược liệu bằng phương pháp chiết nóng

với ethanol tuyệt đối theo phụ lục 12.10 Dược điển Việt Nam IV [3]

Định lượng saponin trong dược liệu bằng phương pháp cân

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Sơ bộ xác định thành phần hóa học lá thường xuân

 Đinh tính alkaloid

Cân 0,5g bột, cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N Đun đến sôi Để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH

= 9 - 10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng) Chiết alcaloid base bằng ether hoặc cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml) Gộp các dịch chiết ether (hoặc cloroform), loại nước bằng natrisulfat khan

Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

Ống 2: thuốc thử Bouchardat, phản ứng dương tính nếu

cho tủa nâu đến đỏ nâu

(-)

Ống 3: thuốc thử Dragendorff, phản ứng dương tính nếu

cho tủa vàng cam đến đỏ