Đinh tính alkaloid
Cân 0,5g bột, cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9 - 10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng). Chiết alcaloid base bằng ether hoặc cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết ether (hoặc cloroform), loại nước bằng natrisulfat khan.
Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Bảng 3.1. Định tính Alcaloid
Thuốc thử và hiện tượng nếu dương tính Kết quả Ống 1: thuốc thử Mayer, phản ứng dương tính nếu cho
tủa màu từ trắng đến vàng
(-)
Ống 2: thuốc thử Bouchardat, phản ứng dương tính nếu cho tủa nâu đến đỏ nâu
(-)
Ống 3: thuốc thử Dragendorff, phản ứng dương tính nếu cho tủa vàng cam đến đỏ.
(-)
Sơ bộ kết luận: dược liệu không chứa alkaloid. Định tính coumarin
Cân khoảng 1g bột dược liệu, cho vào một ống nghiệm lớn hoặc một bình nón dung tích 50ml. Thêm 5ml ethanol 90%, quấy đều. Đun trong nồi cách thủy sôi khoảng 3 - 5 phút. Lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được để làm các phản ứng định tính.
Bảng 3.2. Định tính coumarin
Cách tiến hành Kết quả
a. Phản ứng mở đóng vòng lacton
- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% Ống 2 để nguyên
Phản ứng dương tính nếu:
- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát Ống 1: có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng Ống 2: trong
- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát: Ống 1: trong suốt
Ống 2: có tủa đục
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại tủa đục như ống 2.
(+)
b. Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
Nhỏ vài giọt dịch chiết coumarin lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu,…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại.
Phản ứng dương tính nếu thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau.
Sơ bộ kết luận : dược liệu có coumarin. Định tính anthranoid
Cho vào ống nghiệm lớn 1g dược liệu. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5ml ether dầu hỏa. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp ether để làm phản ứng.
Bảng 3.3. Định tính anthranoid
Cách tiến hành Kết quả
Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform) cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ.
Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu đỏ sim.
(-)
Kết luận : Dược liệu không có anthranoid Định tính glycosid tim
Cân khoảng 10g lá thường xuân đã tán nhỏ cho vào một bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natrisulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
Bảng 3.4. Định tính glycosid tim
Cách tiến hành Kết quả
a. Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann - Burchardt
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Phản ứng dương tính nếu ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
(+)
b. Phản ứng Baljet
Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ da cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
(-)
c. Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
d. Phản ứng của phần đường 2,6 - desoxy: Phản ứng Keller - Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ.Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá.
(-)
Sơ bộ kết luận : Không có glycosid tim. Định tính flavonoid
Cân 0,5g bột dược liệu rồi cho vào ống nghiệm lớn. Thêm 5ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được tiến hành các phản ứng định tính
Bảng 3.5. Định tính flavonoid
Cách tiến hành Kết quả
a. Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Phản ứng dương tính nếu để yên một vài phút, dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
(-)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%
Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện tủa vàng. Thêm 1ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ được tăng thêm.
c. Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa xanh đen.
(-)
Kết luận : Dược liệu không có flavonoid. Định tính tannin
Lấy khoảng 1,00g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính.
Bảng 3.6. Định tính tannin
Cách tiến hành và kết quả nếu dương tính Kết quả a. Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%
(TT). Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt.
(-)
b. Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT). Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông.
(-)
c. Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng.
(-)
Kết luận : Dược liệu không có tannin. Định tính saponin
Cân 0,5g bột dược liệu rồi cho vào ống nghiệm lớn. Thêm 5ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc. Cô dịch thành cắn.
Bảng 3.7. Định tính saponin
Cách tiến hành Kết quả
a. Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm lớn 0,1g bột dược liệu, thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
(+)
b. Phản ứng Liebermann-Burchard
Hòa tan cắn lượng thích hợp trong 1ml anhydride acetic, thêm vào dung dịch 0,5ml chloroform.Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1-2 ml H2SO4 đđ xuống đáy ống nghiệm. Quan sát vòng ngăn cách.
Có màu hồng
c. Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin triterpenoid
Lấy 1g bột lá thường xuân cho thêm 5ml cồn đun sôi cách thủy trong 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0.1N (pH=1) và ống thứ hai 5ml NaOH 0.1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15s. Để yên nếu cột bọt trong 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định dược liệu có Saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là Saponin steroid.
Cột bọt 2 ống cao ngang
nhau
Định tính các chất khử (đường khử)
Cắn của dịch chiết cồn còn lại được hòa với 3ml nước cất trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0.5ml dung dịch Fehling A và 0.5ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: có các hợp chất khử.
Kết quả: (-)
Kết luận: dược liệu không có đường khử Định tính acid hữu cơ.
Cân khoảng 3g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, them 10ml nước cất đem đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch lọc, them một ít tinh thể Na2CO3. Phản ứng dương tính nếu có bọt khí thoát ra.
Kết quả: (+)
Sợ bộ kết luận: Dược liệu có acid hữu cơ
Định tính sơ bộ tinh dầu, chất béo, sterol, caroten Chiết 1g dược liệu trong 5ml ether dầu hỏa
Bảng 3.8. Định tính tinh dầu và chất béo
Cách tiến hành và kết quả nếu dương tính Kết quả
a. Xác định tinh dầu
Lấy khoảng 3ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn. Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm và cắn 1 ít cồn cao độ rồi lại bốc hơi cho đến cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng có tinh dầu
(+)
b. Xác định chất béo
Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên cùng 1 chỗ trên miếng giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi. Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết mờ : có chất béo
c. Xác định sterol
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêm ống nghiệm 45o, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Phản ứng dương tính nếu mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá.
(+)
d. Xác định caroten
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu xanh lá.
(+)
Kết luận: Dược liệu có tinh dầu, sterol, caroten và không có chất béo
Kết quả định tính được tổng kết ở bảng sau:
Bảng 3.9. Kết quả định tính chung
STT Nhóm chất Phản ứng với thuốc thử Kết quả Kết luận
1. Alkaloid Thuốc thử Mayer (-) Không có
Thuốc thử Bouchardat (-) Thuốc thử Dragendorff (-)
2. Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton (+) Có
Quan sát huỳnh quang (+)
3. Anthranoid Phản ứng Bontraeger (-) Không có
4. Glycosid tim Phản ứng Liebermann – Burchardt
(++) Không có
Phản ứng Legal (-) Phản ứng Keller – Kiliani (-)
5. Flavonoid Phản ứng Cyanidin (-) Không có
Phản ứng với kiềm (-)
Phản ứng với FeCl3 (-)
6. Tanin Phản ứng với FeCl3 (-) Không có
Phản ứng với chì acetat (-) Phản ứng với dung dịch gelatin (-)
7. Saponin Hiện tượng tạo bọt (++) Có
Phản ứng Liebermann-Burchard (++) 8. Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling
A,B
(-) Không có
9. Acid hữu cơ Phản ứng với bột Na2CO3 (+) Có
10. Tinh dầu Mùi thơm nhẹ (+) Có
11. Chất béo Để vết mờ trên giấy lọc (-) Không có
12. Sterol P.Ư Liebermann (++) Có
13. Caroten P.Ư với H2SO4 đặc (++) Có
Chú thích: (-) âm tính; (+) dương tính; (++) dương tính rõ.
Từ kết quả định tính xác định các nhóm hợp chất ở trên được tổng hợp