Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase của một số loài trong họ thạch tùng tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG HỌ THẠCH TÙNG Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN TS TRẦN MẠNH HÙNG TP HỒ CHÍ MINH, năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Người hướng dẫn khoa học: Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng đánh gía luận án cấp trường họp tại: vào hồi …… giờ……….ngày…….tháng…… năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Khoa học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Bệnh Alzheimer chứng suy giảm trí nhớ phổ biến nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sống người lớn tuổi Huperzin A chiết xuất từ Thạch tùng (Huperzia serrata) có khả ức chế enzym acetylcholinesterase, enzym quan trọng trình gây bệnh trí nhớ Ở Trung Quốc, với Huperzia serrata, thực vật khác thuộc họ Lycopodiaceae chứa hợp chất huperzin A Huperzia crispata (Ching) Ching, Huperzia miyoshiana (Makino) Ching số lồi khác Trong Việt Nam, số thuộc họ Lycopodiaceae nguồn thực vật cung cấp hợp chất tự nhiên theo hướng tác dụng sinh học cải thiện trí nhớ Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis (Râu rồng), Lycopodiella cernua (L.) Pic.Serm (Thạch tùng nghiên) nhiều loài khác Thực tế chưa có đánh giá chi tiết hồn chỉnh về tác động ức chế enzym acetylcholinesterase hàm lượng thành phần Lycopodium alcaloid loài thực vật chứa hợp chất thuộc dạng Với lý trên, đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase của số lồi họ Thạch tùng” thực với mục tiêu sau: Nghiên cứu so sánh đặc điểm thực vật học số loài thuộc họ Thạch tùng Thử nghiệm in vitro sàng lọc tác dụng kháng acetylcholinesterase cao chiết số loài Thạch tùng Phân lập số hợp chất tự nhiên Râu rồng (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis.), Thạch tùng nghiên (Lycopodiella cernua (L.) Pic.Serm.) đánh giá tác dụng kháng acetylcholinesterase các chất phân lập Thiết lập chất chuẩn hợp chất kháng enzym acetylcholinesterase phân lập Xây dựng phương pháp định lượng hợp chất có tác dụng kháng enzym acetylcholinesterase các loài Thạch tùng phương pháp điện di mao quản HPLC Thử nghiệm in vivo tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết alcaloid từ lồi Thạch tùng nghiên có trữ lượng lớn tiềm Tính cấp thiết của đề tài Việc tìm kiếm dược liệu hợp chất tự nhiên cho điều trị bệnh Alhzeimer cần thiết Huperzin A chiết xuất từ Thạch tùng (Huperzia serrata) công nhận loại thuốc điều trị trí nhớ hiệu Trung Quốc cục quản lý thuốc thực phẩm Mỹ (FDA) công nhận loại thực phẩm chức cho các bệnh nhân bị Alzheimer Nước ta có nguồn tài nguyên thực vật phong phú Trong đó, lồi thuộc họ Thạch tùng tiềm để ứng dụng làm thuốc điều trị chứng suy giảm trí nhớ Do đó, đánh giá chi tiết về hàm lượng huperzin A tác dụng sinh học theo hướng cải thiện trí nhớ 10 lồi họ Thạch tùng góp phần chứng minh giá trị ứng dụng dược liệu Việt Nam Đồng thời, phát hợp chất tự nhiên với tác dụng sinh học tương tự đóng góp quan trọng cho khoa học làm phong phú thêm liệu phổ học về cấu trúc hợp chất thiên nhiên Những đóng góp của luận án 3.1 Thực vật học Nghiên cứu thực vật học làm sáng tỏ các đặc điểm phân bố, sinh thái, hình thái, vi phẫu rễ, thân, 10 lồi Thạch tùng Các đặc điểm thực vật học đặc trưng trình bày qua bảng so sánh chi tiết với hình ảnh về cấu tạo vi học liệu quan trọng góp phần cho việc tìm kiếm thu thập mẫu định danh số loài họ Thạch tùng Những loài thuộc chi Huperzia tiềm về hoạt chất huperzin A có đặc điểm thực vật học đặc trưng khác với loài thuộc chi Lycopodium chi Lycopodiella Sự phát thêm lồi chưa mơ tả Việt Nam Huperzia tetrasticha (Kunze) Holub đề xuất tên thơng thường Thạch tùng vng, góp phần làm phong phú thêm loài Thạch tùng Việt Nam 3.2 Thử nghiệm sàng lọc tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase Thử nghiệm sàng lọc tác dụng kháng acetylcholinesterase in vitro phương pháp Ellman 10 lồi họ Thạch tùng cho thấy có tác dụng sinh học ức chế enzym phân hủy acetylcholin với IC50 từ 12,11 – 55,24 µg/ml Kết nghiên cứu lồi dược liệu có tiềm sử dụng cho bệnh nhân suy giảm trí nhớ Các lồi thuộc chi Huperzia có tác dụng sinh học mạnh các loài thuộc chi Lycopodium Lycopodiella 3.3 Phân lập hợp chất tự nhiên Lần đầu tiên, hai hợp chất tự nhiên với tác dụng sinh học kháng acetylcholinesterase in vitro lycosquarosin A, IC50 = 54,3 µg/ml phân lập từ Râu rồng lycocernuasid A, IC50 = 8,51 µg/ml phân lập từ Thạch tùng nghiên Với hoạt tính ức chế AChE tiềm năng, hai hợp chất nguồn chất hóa học chống lại bệnh Alzheimer Các kết nghiên cứu hai hợp chất cơng bố lần tạp chí ISI Molecules 2014 Chemical-Biological Interactions 2015 3.4 Thiết lập chất đối chiếu Quy trình phân lập thiết lập chất đối chiếu huperzin A từ loài Râu rồng (Huperzia squarrosa) thực hiện, đáp ứng nhu cầu cần thiết kiểm tra chất lượng dược liệu thuộc họ Thạch tùng 3.5 Phương pháp định lượng huperzin A dược liệu Lần phương pháp điện di mao quản vùng (CZE-DAD) áp dụng để phân tích huperzin A Thạch tùng Quy trình định lượng huperzin A Thạch tùng xây dựng thẩm định đóng góp lĩnh vực phân tích kiểm nghiệm Phương pháp HPLC/PDA xây dựng, thẩm định ứng dụng để định lượng huperzin A 10 loài thuộc họ Thạch tùng 3.6 Thử nghiệm in vivo Cao chiết alcaloid Thạch tùng nghiên có tác dụng tăng cường nhận thức chuột bị gây suy giảm trí nhớ scopolamin thử nghiệm in vivo qua mơ hình Né tránh thụ động Mê cung bơi Những kết cho thấy loài Thạch tùng nghiên nguồn gốc Việt Nam có hoạt tính chống cholinesterase, hữu ích điều trị suy giảm nhận thức cơng bố tạp chí ISI (Neuroscience Letters 2014) Bố cục luận án Luận án gồm 132 trang: Mở đầu trang, tổng quan tài liệu 24 trang, nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 24 trang, kết nghiên cứu 55 trang, bàn luận 24 trang, kết luận đề nghị trang Luận án có 37 bảng, 57 hình, biểu đồ, sơ đồ, 152 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt 148 tài liệu tiếng Anh, 93 phụ lục thể kết thực nghiệm Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 1.1.1.1 Tổng quan họ Lycopodiaceae Vị trí phân loại Họ Thạch tùng hay gọi họ Thơng đất (Lycopodiaceae) bao gồm 400 lồi cổ thực vật có mạch, tồn từ cuối kỷ Silur cách khoảng 400 triệu năm, phân bố rộng rãi khắp nơi giới Các lồi họ Thơng đất thuộc thân thảo đa niên, sinh sản bào tử, phân bố nhiều nước châu Á vùng Trung Mỹ, phát khu rừng nhiệt đới ẩm ướt Ở Việt Nam, phát chi Lycopodium L., Lycopodiella Holub, Huperzia Bernh có khoảng 16 loài, phân bố vùng núi cao 1000 m thuộc tỉnh Lâm Đồng, Kon Tum, Quảng Nam, Lào Cai, Cao Bằng 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC Các nhóm hoạt chất phát nhiều từ loài thuộc họ Thạch tùng chủ yếu bao gồm nhóm Lycopodium alcaloid, terpenoid, flavonoid các acid phenolic Các Lycopodium alcaloid thường có khung cấu trúc 16 carbon, 32 carbon, số cơng thức hóa học có ít 16 carbon chia thành nhóm lycopodin, lycodin, fawcettimin nhóm có cấu trúc khác tương tự phlegmarin O N B 12 13 NH A 13 B 12 N A B 12 13 C H N OH O A C C 13 12 N A HN C lycopodin Fawcettimin fawcettimin Phlegmarin Lycodinlycodin Lycopodin Phlegmarin Hình 1.1 Cấu trúc của bốn nhóm Lycopodium alcaloid Huperzin A Lycopodium alcaloid loại lycodin với vòng C mở ngun tố carbon Có 200 loại Lycopodium alcaloid báo cáo, nhiên chúng hoặc khơng có hoạt tính kháng acetylcholinesterase hoặc có huperzin A Huperzin A tồn nhiều loài khác người dân tìm kiếm khai thác Thạch tùng (Huperzia serrata) lợi ích mang lại lớn dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên 1.3 CÁC PHƯƠNG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÁP PHÂN TÍCH HUPERZIN A 1.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập huperzin A Để chiết xuất phân lập huperzin A, đa số kỹ thuật chiết xuất từ cổ điển đến đại sử dụng Đầu tiên, các phương pháp chiết xuất thường quy để thu alcaloid toàn phần đều sử dụng Bột dược liệu chiết ngâm lạnh, ngấm kiệt hoặc chiết hồi lưu với MeOH, EtOH hoặc với EtOH - acid để thu alcaloid tồn phần dạng muối, sau tiến hành kiềm hóa chiết phân bố với ether, n-hexan, cloroform, dicloromethan, cô áp suất giảm Một số trường hợp làm ẩm dược liệu với kiềm (NH4OH) chiết trực tiếp dung môi hữu để thu alcaloid toàn phần dạng base Sau thu alcaloid toàn phần, nhiều phương pháp áp dụng cho việc phân lập huperzin A các hợp chất khác phương pháp sắc ký sử dụng phổ biến với loại pha tĩnh khác như: silica gel pha thuận, sephadex LH-20, sử dụng nhựa resin hấp phụ, trao đổi ion, silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải khác từ phân cực trung bình đến phân cực mạnh Ngồi ra, các thiết bị máy móc sử dụng hỡ trợ tích cực cho việc tách chất máy sắc ký lỏng điều chế, máy sắc ký phân bố ly tâm 1.3.2 Phương pháp định lượng huperzin A Những nghiên cứu về định lượng huperzin A dược liệu, tác giả đều sử dụng phương pháp HPLC để định lượng alcaloid Mẫu thử chiết xuất theo các nguyên tắc chung về chiết xuất alcaloid chiết MeOH, chiết nước acid, chiết cồn acid, kiềm hóa bột dược liệu kết hợp với chiết cloroform Quy trình định lượng đảm bảo yêu cầu về độ nhạy, tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng Tuy nhiên, chưa thấy có tài liệu cơng bố ứng dụng phương pháp điện di mao quản xác định hàm lượng huperzin A dược liệu thuộc họ Lycopodiaceae Dựa vào cấu trúc hóa học, huperzin A hợp chất alcaloid có nhóm amin tự (-NH2) nhóm chức amid (O=C-NH) Do phân tử huperzin A ion hóa nơi trường acid phù hợp Vì vậy, hồn tồn áp dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng hợp chất huperzin A 1.4 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU Việc thiết lập chất đối chiếu thứ cấp thường tiến hành nhu cầu thực tế, nguồn chất đối chiếu sơ cấp không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng công tác nghiên cứu đảm bảo chất lượng thuốc Giá trị ấn định chất đối chiếu thứ cấp thông thường xử lý thống kê từ kết đánh giá liên phòng PTN tham gia thiết lập chất đối chiếu Một chất đối chiếu thứ cấp khu vực hay quốc gia coi chất chuẩn gốc để thiết lập chất chuẩn PTN 1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE Phương pháp quang phổ UV - Vis Đây phương pháp phổ biến Ellman cơng bố năm 1961 Phương pháp có nhiều ưu điểm đơn giản, nhanh, chính xác, chi phí tương đối thấp, thích hợp cho phân tích tự động, thực số lượng mẫu thử lớn Áp dụng thử hoạt tính khả ức chế enzym AChE 1.6 CÁC MƠ HÌNH THỬ NGHIỆM HÀNH VI Mơ hình mê cung bơi Đây thử nghiệm đánh giá hoạt động trí nhớ dài hạn Thử nghiệm tiến hành huấn luyện ngày đầu, ngày thứ - thử nghiệm thăm dò khả học nhớ chuột sau thời gian huấn luyện; ngày - thử nghiệm đánh giá trí nhớ hoạt động chuột thay đổi vị trí chân đế Thử nghiệm tránh né thụ động Chuột bẩm sinh ln có xu hướng hướng về bóng tối, để tránh kích thích gây sợ hãi phải ngăn xu hướng Chuột khơng có khả ghi nhớ bước qua ranh giới sớm chuột có khả ghi nhớ Thử nghiệm đánh giá thông số: thời gian chuột băng qua vạch giới hạn phần trăm số chuột mỡi lơ thí nghiệm băng qua vạch giới hạn thời gian quy định Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU Các loài họ Thạch tùng thu hái rừng vùng cao Tây Nguyên thuộc tỉnh Lâm Đồng, Kon Tum, mẫu tươi có đủ phận rễ, thân, Mẫu lưu giữ Bộ môn Tài nguyên - Dược liệu, Trung tâm Sâm dược liệu Tp.HCM Bảng 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu Tên khoa học Nơi thu hái Số lưu mẫu Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis Huperzia phlegmaria (L.) Roth Huperzia carinata (Poir.) Trevis Huperzia fordii (Baker) R D Dixit Huperzia tetrasticha (Kune) Holub Huperzia serrata (Thunb.) Trevis Lâm Đồng Lâm Đồng Lâm Đồng Lâm Đồng Lâm Đồng Lâm Đồng TT01 TT02 TT03 TT04 TT05 TT06 Lycopodium complanatum L Lycopodium clavatum L Lycopodium casuarinoide L Lâm Đồng Lâm Đồng Kon Tum TT07 TT08 TT09 Lycopodiellacernua (L.) Pic.Serm Kon Tum TT10 Tên Việt Nam Chi Huperzia Râu rồng Thạch tùng ngựa Thạch tùng sóng Thạch tùng Ford Thạch tùng vuông Thạch tùng Chi Lycopodium Thạch tùng dẹp Thạch tùng lá dùi Thạch tùng dương Chi Lycopodiella Thạch tùng nghiên 2.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực vật học: Phân tích đặc điểm hình thái quan sinh trưởng sinh sản Giải phẫu các quan rễ, thân, lá để quan sát đặc điểm tế bào kính hiển vi chụp hình ảnh So sánh các đặc điểm hình thái vi phẫu thực vật để xác định các đặc điểm đặc trưng phân biệt số loài họ Thạch tùng Nghiên cứu sàng lọc tác dụng in vitro kháng enzyme AChE: Thử nghiệm phương pháp Ellman mẫu cao chiết methanol thu 10 loài Thạch tùng So sánh tác dụng kháng AChE các loài họ Thạch tùng Từ kết sàng lọc, chọn đối tượng dược liệu để nghiên cứu phân lập hợp chất tự nhiên Nghiên cứu hóa học: Chiết xuất phân lập các hợp chất tự nhiên Cây Râu rồng (Huperzia squarrosa) Thạch tùng nghiên (Lycopodiella cernua) các kỹ thuật sắc ký Xác định cấu trúc các chất phân lập phương pháp phổ học đánh giá tác dụng kháng AChE 11 đều có tác dụng kháng AChE với giá trị IC50 nằm khoảng từ 12,11 - 55,24 µg/ml Bảng 3.1 Kết tác động ức chế AChE của mẫu thử nghiệm Tên khoa học Tên Việt Nam IC50 (µg/ml) Huperzia squarrosa Râu rồng 15,61±0,90 Hupezia phlegmaria Thạch tùng đuôi ngựa 24,62±2,33 Huperzia carinata Thạch tùng sóng 14,39±0,53 Huperzia fordii Thạch tùng ford 26,19±0,70 Huperzia tetrasticha Thạch tùng vuông 16,59±1,43 Huperzia serrata Thạch tùng 12,11±0,74 Lycopodium complanatum Thạch tùng dẹp 55,24±9,55 Lycopodium clavatum Thạch tùng dùi 51,75±1,17 Lycopodium casuarinoides Thạch tùng dương 36,56±4,29 Lycopodiella cernua Thạch tùng nghiên 45,91±4,83 3.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật Râu rồng Thạch tùng nghiên có nhóm hợp chất triterpenoid, alcaloid, flavonoid, chất khử các acid hữu Quy trình chiết xuất phân lập khảo sát kết hợp phương pháp ngấm kiệt methanol sắc ký phân bố Diaion HP 20 Chiết xuất phân lập hợp chất tự nhiên từ Râu rồng thu bốn hợp chất tinh khiết huperzin A, lycosquarosin A, acetylaposerratinin huperzinin Trong đó, lycosquarosin A hợp chất tự nhiên mới, có tác dụng kháng AChE công bố tạp chí ISI (Molecules 2014) Chiết xuất phân lập hợp chất từ Thạch tùng nghiên thu hợp chất lycocernuin cernuasid A Trong đó, cernuasid A hợp chất tự nhiên mới, có tác dụng kháng AChE cơng bố tạp chí ISI (Chemical-Biological Interactions 2015) Biện luận cấu trúc hợp chất (Huperzin A) Hợp chất (26 mg) dạng tinh thể hình kim ngắn, khơng màu, điểm chảy 228 oC Năng suất quay cực [α]/D -151 ± 3°, (0,5 %, methanol), SKLM cho vết phát quang đèn UV 365 nm tắt quang đèn UV 12 254 nm cho màu cam với TT Dragendorff Phổ IR có các đỉnh hấp thu đặc trưng nhóm chức lactam 3178; 1651 cm-1 nhóm carbonyl 1612 1548 cm-1 Phổ UV hợp chất có đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 312 nm 230,5 nm Phổ HRMS cho mũi ion phân tử giả m/z 243,1528 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết: [C15H18N2O + H]+ = 243,1504), tương ứng với công thức phân tử C15H18N2O (M = 242,1426) độ bất bão hòa  = Phổ 1H-NMR Phổ 1H NMR cho các mũi cộng hưởng với diện proton metin H-2 (6,42; 1H; d; 9,5 Hz) H-3 (7,90; 1H; d; 9,5 Hz); diện proton nhóm metylen H-6a (2,89; dd; 17/6,5 Hz) H-6b (2,75; dd; 17/1,5 Hz) ghép spin với proton metin H-7 (3,61; 1H; brs), diện proton vòng mở: proton metin H-7, H-8 (5,41; d; 4,5 Hz) H-11 (5,48; q; 7,0 Hz), proton metylen H-14 (2,12; d) proton metyl H-10 (1,68; d; 7,0 Hz); H-16 (1,55; s) tín hiệu nhóm –NH (13,20; brs) Phổ 13C-NMR Dept-NMR có tín hiệu sau: 02 nhóm -CH3 (c 12,3 22,6 ppm), 02 nhóm -CH2- (c 35,2 49,2 ppm), 05 nhóm >CH(c 117,0; 140,2; 32,9; 124.3; 111,2 ppm), 06 nhóm C bậc (c 165,4; 122,7; 143,2; 142,6; 54,3; 134,1 ppm) Trong có các tín hiệu đặc trưng bốn carbon olefin bậc ba [C 117,0 (C-2), C 140,2 (C-3), C 124,3 (C-8), C 111,2 (C-11)], bốn carbon olefin bậc bốn [C 122,7 (C-4), C 143,2 (C-5), C 142,6 (C-12), C 134,1 (C-15)], carbon carbonyl [C 165,4, C-1], hai carbon bậc [C 12,3 (C-10), C 22,6 (C-16)], hai carbon bậc hai [C 35,2 (C-6), C 49,2 (C-14)], carbon bậc ba [C 32,9 (C-7)] carbon bậc bốn [C 54,3 (C-13)] Từ liệu phổ IR 13C-NMR với diện carbon carbonyl (C=O) vùng trường C 165,4 ppm [C-1] hai carbon olefin bậc ba [C 117,0 (C-2), C 140,2 (C-3)], hai carbon olefin bậc bốn [C 122,7 (C-4), C 143,2 (C-5)] cho thấy phù hợp vòng pyridon cấu trúc hợp chất Do đó, hợp chất thuộc nhóm hợp chất có khung cấu trúc lycodin alcaloid 13 Phổ COSY cho tín hiệu tương tác H-2 (δH 6,42 ppm) tương tác với H-3 (δH 7,89 ppm); H-6a (δH 2,87) tương tác với H-6b (δH 2,71); H6a, H-6b tương tác với H-7 (δH 3,61); H-7 tương tác với H-8 (δH 5,41), với H-11 (δH 5,49), với H-10 (δH 1,68) Phổ HMBC cho thấy các tín hiệu tương tác proton carbon sau: H-2 tương tác với C-4; H-3 tương tác với C-1, C-5 C-13; H-6a tương tác với C-4, C-5, C-7 C-8, H-6b tương tác với C-4, C-5, C-7, C-8 C12; H-7 tương tác với C-5, C-6, C-8, C-11, C-12, C-13 C-14; H-8 tương tác với C-7, C-12, C-13, C-14 C-16; H-10 tương tác với C-11và C-12; H11 tương tác với C-7, C-8, C-10 C-13; H-14 tương tác với C-4, C-8, C-12, C-13 C-15; H-16 tương tác với C-8, C14, C-15 So sánh với tài liệu tham khảo [64] [79], tập hợp các liệu chất trùng khớp với liệu công bố huperzin A Hình 3.7 Cơng thức cấu tạo của huperzin A Biện luận cấu trúc hợp chất Khảo sát cấu trúc hợp chất (Lycosquarosin A): Hợp chất (16,3 mg) thu dạng bột vơ định hình, màu trắng, điểm chảy 258 oC, SKLM cho vết phát quang đèn UV 365 nm, vết tắt quang đèn UV 254 nm cho màu cam với TT Dragendorff Phổ IR chất có các đỉnh hấp thu: 3397, 1685, 1630, 1452 cm-1, chất có dao động nhóm chức O-H, C=O, C-O, C-C Phổ UV hợp chất có đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 255 nm Phổ HRMS hợp chất cho mũi ion phân tử giả m/z 320,1868 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết: [C18H25NO4 + H]+ = 320,1885), tương ứng với công thức phân tử C18H25NO4 (M = 319,1807) Phổ 1H, 13C Dept 14 cho biết hợp chất có nhóm metyl δC 22,9 (C-16), nhóm N-CH2 δC 50,9 (C-1 C-9), nhóm methylen vùng trường cao δC 18,4 (C-2), 22,1 (C-3), 37,4 (C-6), 25,1 (C10), 30,3 (C-11), 32,7 (C-14), nhóm oxymethin δC 79,7 (C-8), nhóm methin δC 45,0 (C-7) 29,6 (C-15), với carbon bậc δC 205,7 (C-5), 173,1 (C-13), 169,8 (C-12), 142,7 (C-4) Hơn nữa, tín hiệu carbon δC 169,7 (C-17) nhóm metyl δC 20,9 (C-18) tín hiệu nhóm acetoxyl Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton metyl nhóm acetoxyl δH 2,19 (3H, s, H-18), nhóm metyl thứ có δH 1,08 (3H, d, J = 6,3 Hz, H-16) proton nhóm oxymethin δH 5,06 (1H, brd, J = 5,0 Hz, H-8) So sánh liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất chứa khung phlegmariurin B với vòng carbon >C12=C4-C5(C=O)-C6-C7 Việc biện luận cấu trúc hợp chất tiếp tục cách khai thác thông tin phổ COSY, HMBC, HSQC Phân tích phổ 1H-1H COSY HSQC cho thấy diện chuỗi carbon H-1/H-2/H-3, H-6/H-7/H-8/H-15/H-14 H-9/H-10/H-11 Trên phổ HMBC xuất tương tác xa proton nhóm oxymethin (H-8) carbon carbonyl δC 169,7 (C-17) cho thấy nhóm acetoxyl gắn vào C-8 Hình 3.9 Cơng thức cấu tạo của hợp chất (lycosquarosin A) Tương tác H-16 H-7 chứng tỏ nhóm metyl C-15 theo hướng α, điều tương tự các phlegmariurin alcaloid họ Thạch tùng Mặt khác, định hướng β nhóm acetoxyl C-8 khẳng định từ tương tác phổ NOESY Hα-7/H-16 H-8 Từ liệu trên, hợp chất 15 khẳng định dẫn xuất 8β-acetoxyl phlegmariurin B lần phân lập từ Râu rồng Cấu trúc hóa học kiểm tra SciFinder ngày 15 - - 2014 cho biết hợp chất tự nhiên đề nghị đặt tên lycosquarosin A Công bố quốc tế hợp chất thực tạp chí ISI (Molecules 2014) Khảo sát cấu trúc của hợp chất (Lycocernuasid A): Hợp chất (12,3 mg) thu dạng bột vơ định hình màu trắng Phổ HR-FAB-MS cho mũi ion phân tử giả m/z z 559,1794 [M + Na]+ (Tính tốn lý thuyết: [C26H32O12 + Na]+ = 559,1791), tương ứng với công thức phân tử C18H27NO4 (M = 536,1894) Phổ IR cho tín hiệu nhóm hydroxyl (3379 cm-1), nhóm carboxylic acid (1638 cm-1) tín hiệu vòng thơm (1600, 1515 cm-1) Phổ 1H-NMR hợp chất cho thấy có vòng thơm vị trí 1, 3, với tín hiệu proton H 7,06 (1H, br s, H-2), H 7,17 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5) H 6,96 (1H, br dd, J = 8,0 Hz, H-6) vòng thơm vị trí 1, 3, 4, với tín hiệu proton H 6,80 (1H, br s, H-2ʹ) H 6,76 (1H, br s, H-6ʹ) Các tín hiệu proton cho thấy hợp chất có nhóm chức propanoic H 2,84 (2H, t, J = 7,6 Hz, H-7ʹ), H 2,53 (2H, t, J = 7,6 Hz, H8ʹ), nhóm oxymethin H 5,55 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-7), nhóm methin H 3,51 (1H, m, H-8), nhóm oxymethylen H 3,88 (1H, m, H-9a) H 3,78 (1H, m, H-9b), nhóm methoxyl H 3,85 H 3,88 (3H, s) Ngồi có tín hiệu nhóm glycosyl H 4,89 (1H, d, J = 7,6, H1ʹʹ) Dữ liệu phổ 13C-NMR phổ DEPT cho thấy hợp chất có 26 carbon bao gồm 12 carbon thuộc vòng thơm, nhóm oxymetyl C 88,4 ppm (C7), nhóm methin C 55,5 ppm (C-8), nhóm methylen C 32,3 (C-7ʹ) 38,1 ppm (C-8ʹ), nhóm oxymethylen C 65,2 ppm (C-9), nhóm methoxy C 56,7 (3-OCH3) 56,8 (6ʹ-OCH3) với carbon đường Các liệu phổ cho thấy hợp chất có khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid Thủy phân hợp chất acid HCl 1N methanol thu D-(+)-glucose, cách đối chiếu với mẫu 16 chuẩn cho thấy chất tương đồng SKLM Dữ liệu phổ COSY xác định vị trí nhóm các tương tác proton oxymethin H 5,55 (H7) proton H 3,51 (H-8), proton nhóm methylen H 2,84 (H-7ʹ) proton H 2,53 (H-8ʹ) Phổ HMBC xuất các tương tác xa H2/H-6 C-7, H-7ʹ/H-8ʹ C-1ʹ C-9ʹ Vị trí nhóm methoxy xác định C-3 C-6ʹ nhờ vào các tương tác HMBC proton H 3,85 H 3,88 tương ứng với C 150,9 C 145,2 Tương tác phổ HMBC H-1” (H 4,89) C-4 (147,5) cho thấy nhóm glucopyranosyl liên kết với oxy C-4 số liên kết J = 7,6 Hz xác định kiểu liên kết β-glucosid JH-7/H-8 = 6,0 Hz cho thấy hai H-7 H-8 vị trí trans, ngồi liệu phổ NOESY xuất tương tác H-7 H-9 bổ sung cho nhận định Hình 3.17 Cơng thức cấu tạo của hợp chất (lycocernuasid A) Từ kiện trên, hợp chất xác định (7R,8S)-7,8dihydro-8-hydroxymethyl-7-(3-methoxyphenyl-4-O-β-D-glucopyranosid)1ʹbenzofuranpropanoic acid Cấu trúc hóa học kiểm tra SciFinder ngày 10 - 12 - 2014 cho biết hợp chất tự nhiên đề nghị tên gọi lycocernuasid A Công bố quốc tế hợp chất thực tạp chí ISI (Chemical-Biological Interactions 2015) Vào năm 2017, nhóm tác giả Trung Quốc trích dẫn sử dụng tên lycocernuasid B - D cho cơng trình nghiên cứu Thạch tùng nghiên, công bố tạp chí Fitoterapia 17 Bảng 3.15 Kết tác động ức chế AChE của hợp chất phân lập Hợp chất Huperzin A Lycosquarosin A Acetylaposerratinin Huperzinin Lycocernuin Lycocernuasid A IC50 (µg/ml) 0,021 ± 0,005 54,3 ± 0,56 15,2 ± 0,64 30,62 ± 0,33 246,12 ± 8,87 8,51 ± 0,39 Quy trình phân lập huperzin A làm chất đối chiếu từ Râu rồng Quy trình phân lập huperzin A tiến hành với 12,5 kg bột dược liệu Râu rồng sử dụng huperzin A phân lập ban đầu làm chất định tính điểm SKLM Kết thu 851 mg hợp chất M23 chứng minh cấu trúc hóa học các phương pháp vật lý, hóa học phổ nghiệm NMR Các liệu hoàn toàn trùng khớp với liệu công bố huperzin A 3.4 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU Huperzin A hợp chất có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase mạnh khối lượng phân lập 851 mg sử dụng làm nguyên liệu để thiết lập chất đối Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá CĐC: phổ UV, IR, HRMS, NMR, xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết, xây dựng bảng tiêu đánh giá nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu thiết lập CĐC Kết đánh giá liên phòng thí nghiệm cho thấy độ tinh khiết huperzin A 99,13 % tính chế phẩm nguyên trạng với độ không đảm bảo đo 0,336 độ lệch 0,063, lọ chuẩn bảo quản nhiệt độ - oC, tránh ánh sáng Hình 3.3 Sắc ký đồ chiều của huperzin A 18 3.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CZE VÀ HPLC 3.5.1 Xây dựng quy trình định lượng huperzin Thạch tùng phương pháp CZE Từ kết khảo sát, điều kiện điện di phù hợp chọn sau: Máy điện di mao quản CE 7100 Agilent Cột silicagel nung chảy đường kính 50 μm, chiều dài 56 cm, chiều dài hiệu 50 cm Dung dịch đệm: amoni acetat 60 mM, pH 6.0 Nhiệt độ cột 25 0C Điện 15 kV Tiêm mẫu 50 mbar × 10 giây Đầu dò DAD, bước sóng phát đặt 310 nm Thời gian điện di 15 phút Huperzin A 232 nm 310 nm Imidazol Hình 3.29 Điện di đồ mẫu thử Huperzia serrata 3.5.2 Xây dựng quy trình định lượng huperzin a râu rồng phương pháp phương pháp HPLC/PDA Từ kết khảo sát, điều kiện sắc ký phù hợp sau: Máy sắc ký lỏng: Merck Hitachi L2000 Cột sắc ký LiChrospher RP 18e (250 mm ì mm, àm) Dung mụi pha động MeOH - acid phosphoric 0,1 %, tỉ lệ (18 : 82) Chương trình rửa giải đẳng dòng Thể tích tiêm mẫu: 10 µl, tốc độ dòng: ml/phút Đầu dò: PDA, bước sóng phát đặt 232 nm Thời gian phân tích 30 phút, nhiệt độ cột: 30 oC 232 nm, Huperzin A Hình 3.41 Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia serrata 19 3.5.3 Ứng dụng quy trình định lượng huperzin A 10 lồi Thạch tùng Sau xây dựng thẩm định quy trình định lượng huperzin A dược liệu, việc lựa chọn quy trình để áp dụng xác định hàm hượng huperxin A 10 loài Thạch tùng nghiên cứu dựa vào kết thẩm định phương pháp thực Đối với phương pháp CZE/DAD, thời điểm nước giới chưa có tác giả xây dựng quy trình định lượng huperzin A dược liệu Thạch tùng các loài khác thuộc họ Thạch tùng Kết luận án về xây dựng phương pháp CZE/DAD đóng góp mới, làm phong phú thêm kỹ thuật áp dụng lĩnh vực nghiên cứu phương pháp định lượng huperzin A Thạch tùng Tuy nhiên, kết thẩm định quy trình cho thấy độ lặp phương pháp CZE nhiều so với phương pháp HPLC, giá trị RSD 12,78 % 4,46 % Vì vậy, quy trình định lượng huperzin A phương pháp HPLC/PDA ưu tiên chọn lựa để ứng dụng vào thực tiễn xác định hàm lượng huperzin A loài Thạch tùng nghiên cứu Bảng 3.24 Kết xác định hàm lượng huperzin A của 10 loài họ Thạch tùng Tên khoa học Tên Việt Nam Độ ẩm (%) Huperzia squarrosa Hupezia phlegmaria Huperzia carinata Huperzia fordii Huperzia tetrasticha Huperzia serrata Lycopodium complanatum Lycopodium clavatum Lycopodium casuarinoides Lycopodiella cernua Râu rồng Thạch tùng ngựa Thạch tùng sóng Thạch tùng ford Thạch tùng vuông Thạch tùng Thạch tùng dẹp Thạch tùng dùi Thạch tùng dương Thạch tùng nghiên 6,75 9,18 9,36 10,25 10,44 8,29 8,94 8,36 6,22 8,16 Hàm lượng (%) huperzin A dược liệu 0,0266 0,0048 0,0208 0,0047 0,0156 0,0181 < LOD < LOD < LOD < LOD 20 3.6 NGHIÊN CỨU IN VIVO TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA THẠCH TÙNG NGHIÊN 3.6.1 Thử nghiệm tránh né thụ động Kết giai đoạn thử nghiệm ghi nhớ, thời gian bước qua ngăn tối thiết bị lô chứng sinh lý 220 ± 10 giây Trong đó, chuột gây bệnh scopolamin lơ bệnh lý thời gian khoang sáng 20 ± giây trước chuyển vào ngăn tối Do đó, thời gian lô bệnh lý ngắn đáng kể so với lô chứng sinh lý Khi chuột sử dụng scopolamin cộng với tacrin, thời gian khoang sáng lớn đáng kể so với chuột dùng scopolamin (160 ± 12 giây so với 22 ± giây) Việc giảm thời gian gây scopolamin đảo ngược đáng kể cao Thạch tùng nghiên liều 20 50 mg/kg (P < 0,05) 148 ± 15 167 ± 21 giây Ở liều 10 mg/kg, cao Thạch tùng nghiên không cho thấy hiệu rõ rệt so với lô bệnh lý (28 ± giây so với 22 ± giây) Tuy nhiên, liều cao 100 mg/kg, thời gian giảm đáng kể so với liều 50 mg/kg (P < 0,05) 115 ± 14 167 ± 21 giây Do đó, liều 50 mg/kg cao Thạch tùng nghiên dùng đường uống có tác dụng cải thiện trí nhớ mạnh liều thử nghiệm chuột 3.6.2 Thử nghiệm Mê cung bơi Nhóm chứng sinh lý nhanh chóng biết vị trí chân đế Nhóm sử dụng scopolamin thể chậm trễ việc tìm tới chân đế suốt trình thực nghiệm so với nhóm chứng (P < 0,001) Cao Thạch tùng nghiên (50 mg/kg) làm giảm đáng kể tác dụng scopolamin về độ trễ tacrine (P < 0,05) Đúng ngày thử nghiệm thăm dò, quan sát ghi nhận thời gian bơi góc phần tư có chân đế Đối với nhóm sử dụng scopolamin, thời gian bơi ngắn đáng kể so với nhóm đối chứng (P