(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu thành phần hóa học cây lan kim tuyến ( anoectochilus setaceus blume) thu hái tại thanh hóa

KHOA Y DƯỢC ici n ea nd Ph arm ac  y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI M ed NGUYỄN NAM PHƯƠNG ho ol of NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) THU HÁI TẠI THANH HÓA py rig h t@ Sc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Co Hà Nội – 2019 KHOA Y DƯỢC arm ac  y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI nd Ph Người thực hiện: NGUYỄN NAM PHƯƠNG ed ici n ea NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) THU HÁI TẠI THANH HÓA ho ol of M KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa : QH.2014.Y ThS Hà Thị Thanh Hương Co py rig h t@ Sc Người hướng dẫn: PGS.TS Lê Quang Huấn Hà Nội – 2019 y, VN U LỜI CẢM ƠN Qua năm học tập rèn luyện Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, với bảo giảng dạy nhiệt tình Thầy Cơ giúp cho em tiếp thu kiến thức lý thuyết thực hành vơ hữu ích arm ac Khóa luận kết việc tiếp thu, vận dụng kiến thức học cố gắng nỗ lực thân em Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh Ph học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Lê Quang ici n ea nd Huấn – phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Hà Thị Thanh Hương – Nghiên cứu viên Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để em nghiên cứu hồn thành khóa luận M ed Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền anh chị nghiên cứu viên of phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ em thực Khóa luận tốt nghiệp ho ol Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người ln theo sát động viên, quan tâm tạo điều kiện thời gian em thực khóa luận t@ Sc Trong q trình nghiên cứu đề tài khó tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp q báu Thầy Cơ để luận văn em hoàn thiện rig h Em xin chân thành cảm ơn! py Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2019 Sinh viên Co Nguyễn Nam Phương i y, VN U MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v arm ac DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN Ph Vài nét chi Anoectochilus 1.1 Đặc điểm hình thái nd 1.2.Phân bố ea 1.3 Công dụng tác dụng ici n Tổng quan Lan kim tuyến 2.1.Vị trí phân loại ed 2.2.Đặc điểm hình thái M 2.3.Sinh học sinh thái of 2.4.Phân bố tình trạng 2.5.Thành phần hóa học ho ol 2.6.Công dụng 10 Sc 2.7.Tác dụng sinh học số hợp chất Lan kim tuyến 10 2.7.1.Quercetin 10 t@ 2.7.2.Isorhamnetin 11 2.7.3.Acid ferulic 12 rig h 2.7.4.Các thuốc sản phẩm biết đến 13 2.8.Vấn đề cần giải 13 Co py CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1.Nguyên liệu, hóa chất 14 ii y, VN U 2.2.Phương tiện nghiên cứu 14 2.3.Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1.Phương pháp chiết xuất cao Lan kim tuyến 14 2.3.2.Phương pháp định tính 17 arm ac 3.3.Phương pháp định lượng 17 CHƯƠNG III KẾT QUẢ 20 3.1.Kết định tính Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic 20 Ph 3.2.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic 21 nd 3.2.1.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin dịch chiết HPLC 21 3.2.1.1.Điều kiện sắc ký 21 ea 3.2.1.2.Kiểm tra độ thích hợp hệ thống 21 ici n 3.2.1.3.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin 22 3.2.1.4.Kết định lượng Quercetin, Isorhamnetin 25 ed 3.2.2.Định lượng Acid ferulic dịch chiết HPLC 26 M 3.2.2.1.Điều kiện sắc ký 26 of 3.2.2.2.Kiểm tra độ thích hợp hệ thống 27 ho ol 3.2.2.3.Định lượng Acid ferulic 28 3.2.2.4.Kết định lượng Acid ferulic 30 Sc BÀN LUẬN 31 KẾT LUẬN 33 t@ KIẾN NGHỊ 33 rig h TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 Co py PHỤ LỤC iii Sắc ký lớp mỏng hiệu cao HPLC y, VN U DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT (High Performance Liquid Chromatography) Dung dịch ACN Acetonitril MeOH Methanol PBS Muối đệm phosphate IC50 Nồng độ ức chế 50% RLAR Enzyme Lens Aldose Reductase (NH4)2SO4 Amoni sunfat KH2PO4 Kali đihiđrophotphat MgSO4.7H2O Magie sulfat CaCl2.2H2O Calcium Chloride Ph nd ea ici n ho ol Sc UV t@ Vis Giá trị nồng độ Tử ngoại Khả kiến STT Số thứ tự TB Trung bình Area Diện tích píc RT Thời gian lưu Tailling factor Hệ số kéo đuôi rig h py ed Nồng độ C Co M Natri clorua of NaCl CV arm ac dd iv y, VN U DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Lan kim tuyến Bảng 3.1 Kết sắc ký dung dịch chuẩn 21 Bảng 3.2 Số liệu pha đường chuẩn 22 arm ac Bảng 3.3 Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích píc Quercetin 23 Bảng 3.4 Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích píc Isorhamnetin 24 Bảng 3.5 Kết định lượng Quercetin 25 Ph Bảng 3.6 Kết định lượng Isorhamnetin 26 nd Bảng 3.7 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống 27 ea Bảng 3.8 Kết khảo sát mối tương quan nồng độ dung dịch 28 Bảng 3.9 Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích píc Acid ferulic 29 ed ici n Bảng 3.10 Kết xác định nồng độ Acid ferulic mẫu thử 30 M DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) of Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo Quercetin, C15H10O7 11 ho ol Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo Isorhamnetin, C16H12O7 12 Hình 1.4 Công thức cấu tạo Acid ferulic, C10H10O4 12 Sc Hình 2.1 Phổ hấp thụ Quercetin 17 t@ Hình 2.2 Phổ hấp thụ Isorhamnetin 18 Hình 2.3 Phổ hấp thụ Acid ferulic 18 rig h Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-Vis mẫu cao lên men Lan kim tuyến 20 Hình 3.2 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích píc nồng độ Quercetin 23 Co py Hình 3.3 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích píc nồng độ Isorhamnetin 24 Hình 3.4 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích píc nồng độ Acid ferulic 29 v y, VN U ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê Viện Dược liệu, đến Việt Nam ghi nhận 5000 loài thực vật nấm, 408 loài động vật 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc Với hệ sinh thái phong phú, Việt Nam đánh giá quốc gia có tiềm lớn việc arm ac nuôi dưỡng phát triển thuốc quý Do xu hướng nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh ngày phát triển mạnh với ưu điểm bật dược liệu độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển hóa thể Ph Họ Lan (Orchidaceae) họ thực vật đa dạng Việt Nam, với tổng số 865 ea nd loài thuộc 154 chi Thơng thường Lan sử dụng làm cảnh Ngồi ra, có nhiều lồi Lan cịn sử dụng làm thuốc Chi Lan kim tuyến Anoectochilus Việt Nam thống kê 12 lồi, có lồi Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ici n biết đến nhiều giá trị làm cảnh mà giá trị làm thuốc [1] Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ lâu nên loài Lan kim tuyến bị đe doạ nghiêm trọng, bị tuyệt chủng ngồi tự nhiên khơng có M ed biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, Lan kim tuyến xếp nhóm IA Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác mục đích thương mại nhóm ho ol of thực vật nguy cấp EN A1a,c,d sách đỏ Việt Nam năm 2007, phần thực vật [2,3] Nhằm bảo tồn phát triển nguồn tài nguyên quý này, nhiều đơn vị nghiên cứu nước tập trung vào việc nhân giống nuôi trồng Lan kim tuyến t@ Sc Khóa luận thực nhằm mục đích tìm hiểu thành phần hóa học Lan kim tuyến Từ đó, định hướng ứng dụng loại dược liệu góp phần vào cơng bảo tồn nâng cao giá trị sử dụng Khóa luận thực với đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thu hái Thanh Hóa” với mục tiêu: Co py rig h Chiết xuất cao Lan kim tuyến Định tính số hợp chất mẫu Xác định hàm lượng số hợp chất mẫu cao phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao y, VN U CHƯƠNG I TỔNG QUAN Vài nét chi Anoectochilus 1.1 Đặc điểm hình thái Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) chi thực vật có hoa thuộc họ Lan (Orchidaceae) phân họ tên (Orchidoideae) Cái tên "Lan kim tuyến" hay "Lan arm ac kim hoàn” bắt nguồn từ đường gân đẹp phiến loài lan Phần lớn chúng thực vật sinh sống đất có kích thước nhỏ, nhiên vài loài sinh sống bờ đá, với màu xanh lục mang màu Ph sắc khác (tùy theo lồi), có bề mặt mịn nhung mang mạng lưới gân phức ea nd tạp Cụm hoa trung tâm mang vài hoa mọc chúc xuống đất bao phủ lông với cánh môi lớn bật Tràng hoa với đài hoa mặt lưng tạo thành cấu trúc giống mũ trùm đầu Mỗi hoa có hai nhụy hai nhị [25] ici n 1.2 Phân bố ed Chi Anoectochilus (Orchidaceae), bao gồm 40 loài, phổ biến khắp vùng nhiệt đới, từ Ấn Độ, Himalayas, Đông Nam Á đến Hawaii Trong số loài thực vật này, A formosanus A koshunensis phân bố M Đài Loan (Trung Quốc) Okinawa (Nhật Bản) ho ol of Anoectochilus roxburghii, phân bố miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Sri Lanka, Ấn Độ Nepal [17] 1.3 Công dụng tác dụng t@ Sc Một số loài thuộc chi sử dụng loại thuốc dân gian Trung Quốc, chẳng hạn A formosanus Hayata, A koshunensis Hayata, A roxburghii (Wall.) Lindl Co py rig h Theo y học cổ truyền Đài Loan, A formosanus Hayata tươi khô nấu nước uống trị chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lách chứng đau nhói ngực Người Trung Quốc cho uống trà làm từ A formosanus Hayata chữa chứng bệnh gan phổi [23,30] Đại học ông nghệ Y dược ao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan sử dụng A formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược thể kháng virus c m A Nhiều nghiên cứu phát A formosanus Hayata chứa y, VN U hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức tim mạch Dịch chiết A formosanus Hayata có khả kháng virus, kháng sưng viêm bảo vệ gan Chiết xuất A formosanus khơ có chứa 4-hydroxycinnamic acid, β-sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy butanoid glucosides acid [28] Gần đây, hợp chất 3(R)3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên thương mại kinsenoside chiết xuất arm ac từ A formosanus A koshunensis chống tăng huyết áp hiệu [29] Anoectochilus roxburghii, gọi "Vua thảo dược" để điều trị sốt, bệnh Ph phổi, viêm màng phổi, bệnh gan, tăng huyết áp trẻ em suy dinh dưỡng Trung Quốc (Viện Y học cổ truyền Trung Quốc Phúc Kiến 1982) ici n ea nd Tuy nhiên, thông tin khoa học hoạt tính sinh học, chức sinh lý hiệu lâm sàng cụ thể lan thảo dược cịn hạn chế Khơng có báo cáo nghiên cứu thành phần hóa học A roxburghii có hồ sơ dược lý (Li et al 1995) nguồn tự nhiên A roxburghii phần lớn cạn kiệt Tổng quan Lan kim tuyến ed 2.1 Vị trí phân loại  Lan Kim Tuyến có tên khoa học Anoectochilus setaceus Blume M  Tên đồng nghĩa of  Chrysobaphus roxburghii Wall 1826  ho ol  Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall ex Lindl 1840 Anoectochilus regalis Blume 1858  Bộ: Asparagales Sc  Họ: Phong lan Orchidaceae  Phân họ: Orchidoidea t@  Chi: kim tuyến (Anoectochilus)  Loài: A setaceus Co py rig h  Tên gọi khác: kim cương, kim tuyến, kim tuyến tơ, lan gấm, mộc sơn, thạch tùng y, VN U Bảng 3.9: Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích píc Acid ferulic S1 S2 S3 S4 Nồng độ (µg/mL) 1,0 2,0 3,0 4,0 67544 139350 210907 Area 279505 5,0 366017 Y = 72272X – 5278 (R2 = 0.999) nd Ph Phương trình hồi quy S5 arm ac Mẫu 400000 ea y = 72272x - 5278.8 R² = 0.9996 ici n 240000 ed Area 320000 M 160000 of 80000 Sc ho ol Nồng độ (µg/mL) Acid ferulic Co py rig h t@ Hình 3.4 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích píc nồng độ 29 y, VN U 3.2.2.4 Kết định lượng Acid ferulic Lọc mẫu thử qua màng lọc 0.45 µm, tiêm sắc ký Tiến hành mẫu độc lập Cơng thức tính kết arm ac Nồng độ Acid ferulic dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu) C1 (µg/mL) = Ph St: Diện tích píc Acid ferulic dung dịch tiêm sắc ký nd C (g/mL) = ea % Quercetin dịch mẫu thử = Khối lượng Acid ferulic (g) có 100 mL dung dịch mẫu thử ed ici n % Acid ferulic = C x 100 M Bảng 3.10: Kết xác định nồng độ Acid ferulic mẫu thử Nồng độ ban đầu (g/mL) % Acid ferulic 180197 51.3 0.0010265 0.1027 189895 54.0 0.0010802 0.1080 T3 177179 50.5 0.0010098 0.1010 TB 182424 51.9 0.0010389 0.1039 CV(%) 3.6 3.5 3.5 3.5 of Nồng độ mẫu tiêm SK (µg/mL) Sc Mẫu Acid ferulic T1 Co py rig h t@ T2 ho ol Area 30 y, VN U BÀN LUẬN Chiết xuất cao Lan kim tuyến Công nghệ sử dụng nghiên cứu để thu nhận cao có hoạt arm ac chất quý, có tác dụng chữa bệnh từ Lan kim tuyến công nghệ lên men Trong công nghệ lên men ứng dụng đề tài nghiên cứu sử dụng chủng nấm để thu nhận chất thay cho công nghệ tách chiết truyền thống nước Ph cồn nhằm tăng hiệu tách chiết tăng tính đa dạng chất có hoạt tính sinh học sản phẩm chiết xuất nd Theo công nghệ truyền thống việc chiết xuất hoạt chất từ thảo dược ea thực công nghệ chiết sử dụng nước sử dụng cồn Khi sử dụng nước: dịch chiết thu chứa chủ yếu chất ưa nước (các chất hòa tan nước), ici n sử dụng cồn lại chủ yếu thu chất khơng hịa tan nước M hạn chế nêu ed Vì vậy, việc sử dụng cơng nghệ lên men xem cơng nghệ khắc phục Công nghệ lên men nhiều nhà khoa học nước of ứng dụng để tạo sản phẩm có giá trị kinh tế chữa bệnh đồng thời tiết kiệm ho ol nguồn nguyên liệu khả chiết xuất gần tối đa hợp chất quý nguyên liệu ban đầu Sc Để đạt hiệu tách chiết tạo cao chứa hợp chất có tác dụng chữa bệnh từ Lan kim tuyến, cần khảo sát để lựa chọn điều kiện lên men tối ưu (như t@ nhiệt độ, nồng độ chủng giống, cách xử lý nguyên liệu ban đầu trước lên men, thời rig h gian lên men, thu nhận sản phẩm sau lên men,…) để thu nhận cao từ Lan kim tuyến đạt yêu cầu chất lượng Co py Quy trình thu nhận cao ổn định áp dụng vào sản xuất 31 y, VN U Định tính định lượng hợp chất có hoạt tính sinh học dịch lên men Lan kim tuyến  Có thể sử dụng phổ hấp thụ UV-Vis để sơ xác định hợp chất quan trọng mẫu cao Lan kim tuyến arm ac  Phổ hấp thụ mẫu cao Lan kim tuyến cho thấy đỉnh hấp thụ rõ ràng, tập trung bước sóng