Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao chiết etanol từ cây an xoa (helicteres hirsuta lour) trên mô hình chuột nhắt trắng dòng balbc bị gây tổn thương gan bằng paracetamol

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  VŨ THỊ THẢO NHI Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa (Helicteres hirsuta Lour) mơ hình chuột nhắt trắng dòng BALB/C bị gây tổn thương gan Paracetamol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sư phạm Sinh học Đà Nẵng - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  VŨ THỊ THẢO NHI Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa (Helicteres hirsuta Lour) mơ hình chuột nhắt trắng dịng BALB/C bị gây tổn thương gan Paracetamol Chuyên ngành: Sư phạm Sinh học Mã số : KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn : TS NGUYỄN CÔNG THÙY TRÂM Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả hướng dẫn TS Nguyễn Công Thùy Trâm chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả VŨ THỊ THẢO NHI LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Công Thùy Trâm – người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo khoa Sinh – Môi trường tận tình giảng dạy tạo nhiều điều kiện để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè, người bên cạnh quan tâm giúp đỡ suốt thời gian vừa qua Đà Nẵng, ngày 29 tháng 04 năm 2021 Sinh viên thực VŨ THỊ THẢO NHI MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học đề tài Nội dung nghiên cứu: CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan gan bệnh lý gan 1.1.1 Cấu trúc gan loại tế bào có gan 1.1.2 Các dạng bệnh lý gan 1.1.3 Stress oxy hóa bệnh gan 1.1.4 Chống oxy hóa bảo vệ gan 1.3 Tổng quan An xoa (Helicteres hirsuta Lour) 1.3.1 Đặc điểm thực vật phân bố An xoa 1.3.2 Các thuốc dân gian An xoa 1.3.3 Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học An xoa……………………………………………………………………………………8 1.4 Tổng quan chuột nhắt trắng 10 1.4.1 Đặc điểm sinh học 11 1.4.2 Vòng đời sức sinh sản 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu: 13 2.1.1 Nguyên liệu thực vật: 13 2.1.2 Nguyên liệu động vật: 13 2.1.3 Nguyên liệu hóa chất, dụng cụ thí nghiệm: 13 2.1.4 Phạm vi nghiên cứu: 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 13 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết: 13 2.2.2 Phương pháp chiết dịch nghiên cứu: 13 2.2.3 Phương pháp khảo sát sơ thành phần cao chiết: 13 2.2.4 Phương pháp thử độc cấp tính: 15 2.2.5 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây độc Paracetamol 15 2.2.6 Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) 16 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Kết khảo sát sơ thành phần hóa học có cao chiết etanol từ An xoa 17 3.2 Kết khảo sát độc tính cấp cao chiết ethanol từ An xoa chuột thí nghiệm 18 3.3 Kết khảo sát hoạt tính bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa 19 3.4 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết etanol từ An xoa 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 Kết luận 26 Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ NAFLD Non – alcoholicfatty liver disease ROS Dẫn xuất dạng khử oxy RNS Dẫn xuất dạng khử nito LDL Lipoprotein mật độ thấp SOD Superoxide dismutase LD50 Lethal dose (Liều gây chết 50% động vật thử nghiệm) MDA Malonyl dialdehyde OD Optical Density TBA Acid thiobarbituric TCA Acid tricloacetic HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IC50 Nồng độ ức chế 50% peroxy hóa lipid GPT Glutamat Pyruvat Transaminase GOT Glutamat Oxaloacetat Transaminase DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tiêu đề bảng 3.1 Kết khảo sát sơ thành phần cao chiết etanol từ An xoa 17 3.2 Kết thử độc tính cấp cao chiết etanol từ An xoa chuột thí nghiệm 18 3.3 Quan sát mô bệnh học đại thể gan chuột 19 3.4 Nồng độ enzyme GOT, GPT huyết chuột gây tổn thương gan Paracetanol 22 3.5 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa não chuột nhắt trắng 24 Trang DANH MỤC HÌNH ẢNH Tiêu đề hình Hình Trang 1.1 Hình ảnh An xoa 1.2 Hình chuột nhắt trắng 11 3.1 Hình ảnh đại thể nhu mơ chuột 3.1 Nồng độ enzyme GOT, GPT huyết chuột gây tổn thương gan Paracetamol 22 3.2 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa não chuột nhắt trắng 24 19,10,21 TĨM TẮT Mơ hình gây tổn thương gan chuột Paracetamol áp dụng để đánh giá hoạt tính bảo vệ gan cao chiết An xoa (Helicteres hirsuta Lour) Cao chiết An xoa liều lượng 125mg/kgP làm giảm hoạt độ GOT, GPT phần tổn thương gan chuột Paracetamol liều 400mg/kgP Cao chiết An xoa có tác dụng bảo vệ gan tương ứng với silymarin liều 50mg/kgP Từ khóa: bảo vệ gan, paracetamol, An xoa, Helicteres hirsuta Cân 2g mẫu cao cho vào 20ml dung dịch acid sulfuric 5% ethanol 50% - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: thêm - giọt thuốc thử Bouchardat, thấy xuất kết tủa nâu đỏ phản ứng dương tính - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: thêm - giọt thuốc thử Dragendoff, thấy xuất kết tủa da cam phản ứng dương tính Định tính anthraquinol[26] - Phản ứng Borntrager: cân 0,5g mẫu cao cho vào ống nghiệm 5ml chloroform lắc phút Sau lắc thêm vào khoảng 5ml dung dịch amoniac 10% lắc nhẹ Nếu thấy màu hồng, đỏ tím chứng tỏ mẫu có xuất anthraquinol - Phản ứng Borntrager (đối với dẫn xuất anthracen): cân 1g mẫu đun sôi với 5ml axit clohydric 10% phút Lọc để nguội dung dịch, sau thêm 5ml benzen Lớp benzen lấy thêm vào khoảng 5ml amoni hydroxit 10% Nếu thấy xuất màu hồng đỏ anh đào chứng tỏ mẫu có xuất anthraquinol Định tính plavanoid[26] Cân g mẫu cao hòa tan 10ml nước cất hút 3ml hỗn hợp vào ống nghiệm Phương pháp gồm thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% thử nghiệm với FeCl3 - Thử nghiệm NaOH 10%: thêm 2ml dung dịch NaOH 10% vào 3ml hỗn hợp lắc Nếu thấy xuất dung dịch màu vàng chuyển sang không màu cho acid hydrochloric vào chứng tỏ có diện islavonoids mẫu cao - Thử nghiệm FeCl3: nhỏ giọt dung dịch FeCl3 5% vào 3ml hỗn hợp lắc Sự chuyển màu dung dịch sang màu xanh đen chứng tỏ có tồn flavonoids mẫu cao Định tính steroid triterpenoid[26] - Phản ứng Salwoski: nhỏ đến giọt axit sulfuric để tạo thành lớp, xuất màu nâu đỏ chứng tỏ diện vòng steroid Định tính coumarin[26] - Phản ứng mở đóng vịng lacton: cho vào ống nghiệm, ống 1ml dịch chiết; ống 1: thêm 0,5ml NaOH 10%; ống 2: để nguyên Đun ống phút, để nguội, thấy tượng: ống 1: có tủa đục màu vàng; ống 2: suốt Thêm từ từ nước cất vào ống đến 4ml, thấy ống 1: suốt ống 2: có tủa đục, thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống trở lại đục ống phản ứng dương tính Định tính saponin[26]: - Quan sát tượng tạo bọt: lấy 1ml dịch chiết thêm vào khoảng 5ml nước cất Đun cách thủy 10 phút, lọc qua lấy dịch chiết vào ống nghiệm to Thêm nước cất đến khoảng 10ml, bịt ống nghiệm ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc phút, để yên quan sát cột bọt thấy cột bọt bền sau 15 phút dương tính Định tính tannin[26] Lấy 2g cao hịa tan 10ml dung dịch cồn 50% chia làm phần nhau: 14 - Thử nghiệm FeCl3: nhỏ giọt dung dịch FeCl3 vào phần thứ nhất, màu sắc mẫu chuyển sang màu xanh lam màu xanh đen đậm chứng tỏ mẫu có tồn tannin - Thử nghiệm chì acetate: nhỏ giọt dung dịch chì acetate vào phần thứ ba, lắc thấy xuất kết tủa màu vàng nhạt chứng tỏ có tồn tannin mẫu cao 2.2.4 Phương pháp thử độc cấp tính: Xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành[8] Cụ thể cao chiết pha nồng độ gốc 20gram/ml (có thể đạt mẫu cao chiết) nhằm khảo sát độc tính cấp 30 chuột chia thành nhóm (6 chuột/nhóm) gồm nhóm đối chứng sinh lí, nhóm thí nghiệm bị bỏ đói hồn tồn 16h trước cho uống mẫu Mẫu cho uống với liều cao giảm dần, cụ thể 1000; 500; 250 125mg/kg thể trọng Sau cho uống cao chiết ethanol từ An xoa với liều từ 1-2 giờ, chuột ni dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự do) theo dõi liên tục 72 để xác định số chuột chết lơ tính giá trị LD50 Xác định LD50 tiến hành theo phương pháp Karber sau: LD50 = LD - Σab/n Trong đó: LD50 liều chết 50% động vật thí nghiệm; LD liều gây chết 100% động vật thí nghiệm; n số động vật nhóm; a khác biệt liều hai liều liên tiếp; b tỷ lệ tử vong trung bình hai nhóm liên tiếp Đồng thời, chuột chết mổ để xét nghiệm đại thể 2.2.5 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây độc Paracetamol Xác định khả giải độc gan thực theo phương pháp Kunar cộng với số thay đổi phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm 30 chuột chia thành lô (5 con/lô) cụ thể sau - Lơ (đối chứng sinh lí): uống nước cất 0,2 ml/con/ngày; - Lô (đối chứng bệnh lí): uống nước cất 0,2ml/con/ngày - Lơ 3: uống cao etanol An xoa, liều 125 mg/kgP/ngày - Lô 4: uống cao etanol An xoa, liều 250 mg/kgP/ngày - Lô 5: uống cao etanol An xoa, liều 500mg/kgP/ngày - Lô (lô đối chứng tham khảo): uống silymarin liều 50 mg/kgP/ngày Chuột tất lô uống mẫu (nước cất, mẫu nghiên cứu silymarin) lần/ngày vào buổi sáng, liên tục ngày trước gây độc cho gan ngày sau gây độc cho gan Ngày thứ 7, chuột để đói trước 14 - 16 giờ, cho uống mẫu, sau giờ, gây độc gan cách cho chuột uống paracetamol pha nước cất (chỉ cho lô 2, 3, 4, 5, 6) với liều 400 mg/kg thể trọng/1 lần sau 1h cho chuột ăn uống trở lại bình 15 thường Sau 48 uống paracetamol, chuột lấy máu thu huyết thanh, định lượng aminotransferase (GOT, GPT) Phương pháp xác định chức gan Xác định chức gan thông qua định lượng aminotransferase (GOT, GPT) huyết chuột sau: lấy máu chuột, ly tâm 10000 vòng 10 phút, thu huyết thanh, đọc kết hệ thống AU680 hãng Beckman Coulter Phương pháp kiểm tra trực quan gan Sau lấy máu xét nghiệm, chuột gây mê cách kéo giãn đốt sống cổ mổ nhanh để đánh giá ảnh hưởng mẫu thử khối lượng gan, quan sát đại thể chụp ảnh gan động vật thí nghiệm 2.2.6 Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) Hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả ức chế peroxy hóa lipid thực theo phương pháp Stroev Makarova viện Dược liệu – Bộ Y tế, có thay đổi cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Xác định khả ức chế peroxy hóa lipid mẫu nghiên cứu thơng qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyl (MDA), sản phẩm q trình peroxy hóa màng tế bào MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng đỉnh hấp thụ cực đại bước sóng 530 – 532nm Tách não chuột nghiền đồng thể dung dịch đệm phosphat (pH=7.4) theo tỉ lệ 1:10 nhiệt độ – 4°C Lấy 1ml dịch đồng thể thêm vào 0,1ml mẫu thử nồng độ 0,8ml đệm phosphat thêm 0,1ml hệ Penton (FeSO4 0,1mM: H2O2 15mM theo tỉ lệ 1:1) Ủ hỗn hợp 37°C 15 phút Dừng phản ứng 1ml acide tricloacetic 10% Li tâm 12000 vòng phút Lấy dịch cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% ( theo tỉ lệ 2:1) Ủ nhiệt độ 100°C 15 phút Làm lạnh tiến hành đo bước sóng =532nm Trolox sử dụng làm chất đối chiếu tham khảo Hàm lượng MDA tính theo cơng thức: MDA = 28,4 x OD Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) thơng qua khả ức chế peroxy hóa lipid (MDA) tính sau: HTCO (%) = [(ODC – ODT)/ODC] x 100 Trong đó: ODC: Mật độ quang đối chứng ODT: Mật độ quang lô thực nghiệm Giá trị IC50 (Inhibition Concentration at 50% - nồng độ ức chế 50% peroxy hóa lipid) xác định nhờ vào phần mềm TableCurve 2Dv4 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thực nghiệm xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng cơng cụ phân tích số liệu (data analysis) Microsoft excel Kết thí nghiệm biểu thị (M ± SD) & (M ± SE) Đánh giá, so sánh giá trị trung bình lơ thí nghiệm phương pháp thống kê sử dụng chuẩn t-Student 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát sơ thành phần hóa học có cao chiết etanol từ An xoa Kết khảo sát sơ thành phần hóa học có cao chiết etanol từ An xoa trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1.Kết khảo sát sơ thành phần hóa học có cao chiết etanol từ An xoa Nhóm hợp chất Alkaloid Anthraquinol Thuốc thử cách thực Kết Dragendorff + Bouchardat + Amoniac 10% - Phản ứng NaOH 10% + FeCl3 5% + Steroid Acid sunfuric + Triterpenoid Anhydric acetic + Coumarin Mở đóng vịng lacton - Saponin Phản ứng tạo bọt + Tamin Chì acetat + Plavonoid Qua bảng 3.1 ta thấy: cao chiết từ An xoa cho phản ứng dương tính với thuốc thử nhóm lớp chất: flavonoids, saponin, ancaloid, steroid, triterpenoid tamin - Trong thử nghiệm phản ứng dung dịch FeCl3 5% vào hỗn hợp dịch chiết ethanol An xoa (cao chiết + nước), kết dung dịch chuyển thành màu xanh đen đặc trưng cho thấy có mặt flavonoids cao chiết Kết lần khẳng định thử nghiệm phản ứng cao chiết với NaOH 10% Khi cho NaOH 10% vào hỗn hợp dung dịch cao chiết, dung dịch cao chiết chuyển sang màu vàng, tiếp tục nhỏ acid hydrochloric dung dịch, màu vàng dung dịch nhanh chóng - Trong thử nghiệm định tính saponin sau tiến hành thử nghiệm xuất cột bọt kéo dài 15 phút điều chứng tỏ thành phần cao chiết có mặt hợp chất thuộc lớp chất saponin - Sau tiến hành thử nghiệm phản ứng với thuốc thử Bouchardat, kết thu kết tủa nâu đỏ, điều chứng tỏ thành phần hóa học cao chiết có hợp chất thuộc lớp chất ancaloid Kết lần khẳng định qua phản ứng cao chiết với thuốc thử Dragendoff - Sau tiến hành thử nghiệm kết thu xuất vòng nâu đỏ vùng tiếp xúc với chất lỏng màu xanh lục lớp phân tách, điều chứng tở 17 thành phần hóa học cao chiết có hợp chất steroid triterpenoid Kết lần khẳng định qua phản ứng cao chiết với Anhydric acetic - Cùng với kết thử nghiệm chuyển thành màu xanh đen nhỏ giọt dung dịch FeCl3 5% vào dịch chiết Kết thử nghiệm dịch chiết với chì acetate dung dịch tạo kết tủa vàng chứng tỏ thành phần cao chiết Sài đất có hợp chất thuộc lớp chất tannin Như cao chiết An xoa có chứa hợp chất thuộc lớp chất: flavonoids, saponin, ancaloid 3.2 Kết khảo sát độc tính cấp cao chiết ethanol từ An xoa chuột thí nghiệm Độc tính cấp xác định theo phương pháp Bộ Y tế ban hành với mục tiêu nhằm xác định LD50 cao chiết ethanol từ An xoa Sau cho chuột uống cao chiết, quan sát, theo dõi biểu hoạt động chuột thời gian 24h 72h Kết thí nghiệm kiểm tra độc tính cấp mẫu cao chiết ethanol từ An xoa trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết khảo sát độc tính cấp cao chiết ethanol từ An xoa chuột thí nghiệm Lơ Cao chiết ethanol từ An xoa (mg/kgP/lần) 125 250 500 Số chuột chết/ số chuột sống (sau 72 giờ) Biểu chức vòng 24 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng âm tốt 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng âm tốt 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng âm tốt 1000 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng âm tốt Đối chứng sinh lý 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng âm tốt 18 Kết cho thấy, sau uống cao chiết ethanol từ An xoa chuột nhóm thuộc lơ 1, 2, có biểu tốt, ăn uống bình thường khơng có khác biệt so với nhóm đối chứng sinh lý lơ Trong q trình khảo sát khơng ghi nhận dấu hiệu chuột bị chết hay ngộ độc Từ kết khảo sát độc tính cấp cho thấy cao chiết ethanol từ An xoa an toàn cho chuột nồng độ thực nghiệm, chưa xác định độc tính cấp chưa xác định giá trị nồng độ gây chết LD50 cao chiết Dựa vào kết trên, chúng tơi tiến hành bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa cao chiết ethanol từ An xoa 3.3 Kết khảo sát hoạt tính bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa Để khảo sát hoạt tính bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa chúng tơi sử dụng mơ hình gây tổn thương gan Paracetamol với liều 400mg/kgP, paracetamol pha dung dịch sinh lý với nồng độ 50mg/ml Kết thu mơ hình nghiên cứu cho phép đánh giá sơ hoạt tính bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa 3.3.1 Kết quan sát trực quan gan chuột nhóm thực nghiệm Kết quan sát trực quan gan chuột nhóm thực nghiệm trình bày bảng 3.3 hình 3.1 Bảng 3.3 Quan sát mơ bệnh học đại thể gan chuột Nhóm Quan sát hình thái trực quan gan Chứng sinh lý Gan bình thường mơ gan đồng nhất, màu hồng Chứng bệnh lý Gan nhạt màu, nhu mô gan to rõ Chứng tham khảo Gan nhạt màu, nhu mô gan to Cao chiết 125mg/kgP Gan nhạt màu, nhu mô gan to Cao chiết 250mg/kgP Gan nhạt màu, nhu mô gan to Cao chiết 500mg/kgP Gan nhạt màu, nhu mô gan to a Nhóm chứng sinh lý 19 b Nhóm chứng bệnh lý c Nhóm chứng tham khảo (uống Silymarin) d Nhóm uống Cao chiết ethanol từ An xoa (125mg/kgP) 20 e Nhóm uống Cao chiết ethanol từ An xoa (250mg/kgP) f Nhóm uống Cao chiết ethanol từ An xoa (500mg/kgP) Hình 3.1 Đại thể nhu mơ chuột Kết quan sát mô bệnh học đại thể gan chuột bảng 3.2 hình 3.1 cho thấy nhóm chứng bệnh lý gan có màu nhạt, nhu mơ gan rõ Thuốc Paracetamol xem an toàn liều điều trị dùng liều dẫn đến tổn thương gan Khi thuốc theo máu đến gan, xảy q trình chuyển hóa thuốc Các enzym có gan tham gia chuyển hóa Paracetamol thành chất chuyển hóa phân cực Một sản phẩm q trình chuyển hóa chất hóa học trung gian N- acetyl -p- benzoquiononimin (NAPQI), chất cơng đại phân tử dẫn đến tổn thương tế bào gan Khi bị tổn thương, tế bào gan ống mật dẫn đến tình trạng tích tụ axit mật gan, nguyên nhân làm cho ti thể mạng lưới nội sinh chất tế bào bị stress dẫn đến gia tăng trình tổn thương gan tăng nguy gan bị tổn thương chế khác[6] Ở nhóm uống cao chiết với nồng độ khác nhóm uống sylimarin gan nhạt màu so với nhóm sinh lý lại sáng màu so với nhóm chứng bệnh lý nhu mô gan to Điều chứng tỏ mức độ tổn thương gan nhóm giảm Như vậy, qua việc quan sát mô bệnh học, nhóm uống cao chiết An xoa có tác dụng bảo vệ gan, giảm tổn thương gan tác động Paracetamol liều cao 3.3.2 Kết ảnh hưởng cao chiết đến số GOT, GPT Để tiếp tục chứng minh hoạt tính bảo vệ cao chiết ethanol từ An xoa, thay nồng độ enzym trao đổi amin (transaminase) GOT (Serum glutamic oxaloacetic 21 transamina) GPT (Serum glutamic pyruvic transamina) huyết nhóm chuột nghiên cứu khảo sát Kết trình bày bảng 3.4 Kết ảnh hưởng cao chiết đến số GOT, GPT trình bày qua bảng 3.4 biểu đồ 3.1 Bảng 3.4 Nồng độ enzyme GOT, GPT huyết chuột gây tổn thương gan Paracetamol Nhóm GOT (U/L) GPT (U/L) Chứng sinh lý 2,08±0,18 2±0,12 Chứng bệnh lý 7,66±0,95 13,92±2,42 Chứng tham khảo 2,17±0,35 3,17±0,35 (98,38) (90,18) 3,08±0,18 5,08±0,64 (82,08) (74,16) 3,67±0,24 5,33±0,83 (71,51) (72,06) 4,67±0,47 7,17±0,71 (53,58) (56,63) Cao chiết 125mg/kgP Cao chiết 250mg/kgP Cao chiết 500mg/kgP * Hiệu bảo vệ tính 100 x (giá trị kiểm sốt parcetamol –giá trị mẫu nghiên cứu)/ giá trị kiểm soát paracetamol – giá trị bình thường) 16 14 12 10 GOT GPT Sinh lý Bệnh lý Tham khảo Cao 125mg/kgP 22 Cao 250mg/kgP Cao 500mg/kgP Biểu đồ 3.1 Nồng độ enzyme GOT, GPT huyết chuột gây tổn thương gan Paracetamol Qua bảng 3.4 biểu đồ 3.1 cho thấy: Nhóm uống cao chiết etanol từ An xoa với ba mức liều 125mg/kgP, 250mg/kgP 500mg/kgP có nồng độ GOT, GPT giảm so với nhóm đối chứng bệnh lý nhóm uống cao chiết liều 125mg/kgP có nồng độ GOT, GPT giảm thấp so với nhóm đối chứng bệnh lý Cụ thể - Nhóm chuột uống cao chiết etanol từ An xoa mức liều 125mg/kgP có nồng độ GOT giảm 2,49 lần GPT giảm 2,74 lần so với nhóm đối chứng bệnh lý - Nhóm chuột uống cao chiết entanol từ An xoa mức liều 250mg/kgP có nồng độ GOT giảm 2,09 lần GPT giảm 2,61 lần so với nhóm đối chứng bệnh lý - Nhóm chuột uống cao chiết etanol từ An xoa mức liều 500mg/kgP có nồng độ GOT giảm 1,64 lần GPT giảm 1,94 lần so với nhóm đối chứng bệnh lý Đánh giá hiệu bảo vệ gan cao chiết entanol từ An xoa mức liều 125mg/kgP, 250mg/kgP 500mg/kgP cho thấy: Cao chiết etanol từ An xoa mức liều 125mg/kgP có hiệu bảo vệ gan cao (GOT giảm 82,08% GPT giảm 74,16% so với nhóm bệnh lý), tiếp sau cao chiết etanol mức liều 250mg/kgP ( GOT giảm 71,51% GPT giảm 72,06% so với nhóm bệnh lý) thấp cao chiết etanol từ An xoa mức liều 500mg/kgP (GOT giảm 53,58% GPT giảm 56,63% so với nhóm bệnh lý) Hiệu bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa ba mức liều 125mg/kgP, 250mg/kgP 500mg/kgP thấp so với hiệu bảo vệ gan silymarin ( GOT giảm 98,38% GPT giảm 90,18% so với nhóm bệnh lý) GOT, GPT enzyme xúc tác phản ứng hóa học thể GOT enzyme bào tương ty thể, thường tìm thấy mơ gan, tim, thận não, GPT có mặt chủ yếu tế bào gan, tăng GPT đặc hiệu cho tổn thương gan GOT Ở nhóm bệnh lý, nồng độ enzyme GOT tăng 3,68 lần GPT tăng 6,96 lần so với chứng sinh lí Điều chứng tỏ chuột uống Paracetamol, số lượng tế bào gan bị phá hủy tăng lên dẫn đến việc giải phóng enzyme GOT vào máu Như vậy, cao chiết An xoa Việt Nam có tác dụng làm giảm hàm lượng enzyme GOT, GPT máu chuột nhắt trắng Điều chứng tỏ cao chiết An xoa có hoạt tính bảo vệ gan, chống lại phá hủy tế bào Paracetamol Theo cơng trình nghiên cứu công bố số tác giả thành phần hoạt tính An xoa, thành phần An xoa có chứa hợp chất thuộc lớp chất flavonoid, lignans, pinoresinol, stigmasterol, có hoạt tính bảo vệ gan với vai trị giảm q trình oxy hóa chống lại hoại tử tế bào Trong đó, hợp chất thuộc lớp chất flavonoid đánh giá cao tác dụng chống độc, làm giảm tổn thương gan, bảo vệ chức gan chất độc đưa vào thể như: apigenin hợp chất có nhiều hoạt tính dược lý khác có hoạt tính bảo vệ gây độc tính cho động vật thực nghiệm [1] Tiliroside có khả ức chế trình sản xuất TNFα, giảm độ nhạy tế gan với tác động TNF-α ngăn cản q trình tăng lên GOT GPT[8] Stigmasterol có tác dụng làm giảm q trình peroxi hóa lipid gan 23 tăng hoạt động catalase, superoxide dismutase glutathione có hoạt tính bảo vệ gan[12] Với vai trị bảo vệ gan hợp chất thuộc lớp chất flavonoid, lignans, pinoresinol, stigmasterol, hoạt chất có khả làm giảm số lượng tế bào gan bị phá hủy dẫn đến hàm lượng GPT máu giảm Dưới tác dụng flavonoid ngưỡng ascobic ổn định, đồng thời lượng glycogen gan tăng, tích lũy glycogen đóng vai trị quan trọng việc nâng cao chức giải độc gan 3.4 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết etanol từ An xoa Hoạt động chống oxy hóa đường bảo vệ gan hợp chất, cao chiết Do khảo sát hoạt tính chống oxy hóa nhằm khẳng định tác dụng bảo vệ gan chất cần thiết Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa não chuột nhắt trắng thể bảng 3.5 biểu đồ 3.2 Bảng 3.5 Kết hoạt tính chống oxy hóa não chuột nhắt trắng Nồng độ Hàm lượng MDA HTCO% HTCO%(Trolox) Cao chiết 0,8µg/ml 2,97± 0,03 13,47 13,86 Cao chiết 4µg/ml 2,49 ± 0,005 27,66 30,33 Cao chiết 20µg/ml 1,35 ± 0,005 60,69 64,30 Cao chiết 100µg/ml 1,09 ± 0,003 68,37 85,43 Cao chiết 200µg/ml 0,94 ± 0,002 72,56 94,17 IC50 = 19,26 IC50 = 10,49 100 90 80 70 60 50 Cao chiết 40 Trolox 30 20 10 0.8 20 100 24 200 Biểu đồ 3.2 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa Qua bảng 3.5 biểu đồ 3.2 cho thấy hiệu suất chống oxy hóa cao chiết An xoa tỉ lệ thuận với nồng độ cao thấp so với đối chứng Trolox (VitaminE) cụ thể: - Ở nồng độ 0,8µl/ml hiệu suất chống oxy hóa chiết etanol từ An xoa thấp 0,39% so với đối chứng Trolox - Ở nồng độ µl/ml hiệu suất chống oxy hóa cao chiết etanol từ An xoa thấp 2,67% so với đối chứng Trolox - Ở nồng độ 20 µl/ml hiệu suất chống oxy hóa cao chiết etanol từ an thấp 3,61% so với đối chứng Trolox - Ở nồng độ 100 µl/ml hiệu suất chống oxy hóa cao chiết etanol từ An xoa thấp 17,06% so với đối chứng Trolox - Ở nồng độ 200 µl/ml hiệu suất chống oxy hóa cao chiết etanol từ An xoa 21,61% so với đối chứng Trolox So sánh hiệu suất chống oxy hóa cao chiết etanol từ An xoa tất mức nồng độ 0,8; 4; 20; 100; 200 µl/ml cho thấy hiệu suất chống oxy hóa nồng độ 200 µl/ml cao thấp so với đối chứng Trolox Hoạt tính chống oxi hóa cao chiết ethanol từ An xoa tác dụng hợp có cao chiết hợp chất apigenin, stigmasterol hợp chất có tác dụng ngăn gia tăng nồng độ MDA paracetamol gây Kết nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hoạt động ức chế q trình peroxy hóa lipid cao chiết enthanol từ An xoa tương đồng với hoạt tính bảo vệ gan cao chiết Như vậy, cao chiết bảo vệ gan thơng qua hoạt động ức chế q trình peroxy hóa lipid tế bào gan, nhiên để khẳng định điều cần có nghiên cứu sâu 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu, rút kết luận sau: 1.1 Độc cấp tính cao chiết etanol từ An xoa Cao chiết etanol từ An xoa mức liều 125, 250, 500, 1000mg/kgP không gây chết chuột Chưa xác định giá trị LD 50 chưa thể độc tính cấp lơ thực nghiệm 1.2 Về tác dựng bảo vệ gan Cao chiết etanol từ An xoa có tác dụng bảo vệ gan chuột nhắt trắng - Cao chiết etanol từ An xoa có tác dụng làm giảm nồng độ GOT GPT huyết chuột nhắt trắng, nhóm chuột uống cao chiết liều 125mg/kgP có nồng độ GOT GPT thấp - Cao chiết etanol từ An xoa có khả chống oxy hóa Hiệu suất chống oxy hóa cao chiết etanol từ An xoa nồng độ 200µg/ml có giá trị lớn Kiến nghị Trong trình nghiên cứu, nhận thấy cao chiết từ An xoa có hoạt tính bảo vệ gan chuột nhắt trắng Nhưng bước đầu đánh giá ảnh hưởng cao chiết từ An xoa đến việc bảo vệ gan chống oxy hóa chuột nhắt trắng Vì vậy, để thu kết toàn diện tốt hơn, tơi có kiến nghị sau: - Tăng thời gian thí nghiệm chia nhỏ liều lượng cao chiết để làm rõ tác dụng cao chiết từ An xoa đến tác dụng bảo vệ gan - Cần nghiên cứu phân đoạn cao chiết để xác định ảnh hưởng hợp chất sinh học đến q trình peroxy hóa tế bào chuột nhắt trắng - Cần thí nghiệm nhiều đối tượng hơn, theo hướng khác để có kết luận có độ tin cậy cao 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Aleksandar R et al, (2017) Antioxxidative and protective actions of Apigenin in a Paracetamol – incuced hepatotoxicity rat model, Eur J Drug Metab Pharmcokinet 42(5), 649-456 [2] Aleksandar R et al, (2017) Antioxxidavite and protective actions of Apigenin in a pararacetamol- incuced hepatotoxicity rat model 2017 [3] Brown R Lawrence MJ (1994), Mammal of Britain Their Tracks, Trails and Sings Blanndford Press., [4] Nguyễn Thành Chiết cộng (2015), Phân lập xác định số chất từ An xoa [5] Đỗ Trung Đàm (2003), Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp thuốc [6] Gores GJ, Higuchi H, (2003) Machnisms of liver injury: an overview Current Molecular Madicine 3(6): 483.490 [7] Bùi Thị Hằng (2008) Sàng lọc số vị thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn siêu vi B., 2008 [8] Hisashi M at al, (2002) Hepatoprotective principles from the flowers of tilia argentea (linden): structure requirements of tiliroside nadmechanism of action [9] Phạm Hoàng Hộ (2016) Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Hà Nội [10] Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam 2, Nxb Trẻ, Hà Nội [11] Indonesia (2016) Cytotoxic lignans from the stems of Helicteres hirsuta collected in indonesia, [12] NavpreetK et al, (2011) Stigmasterol: A comprehensive review, internation journal of pharmaceutical scieneces and research [13] Nhóm tác giả Hồng Ngọc (2015), Effect of Extraction Solvents and Drying Methods on the Physicochemical and Antioxidant Properties of Helicteres hirsuta Lour Leaves, Technologies, 3, pp., [14] Hong Ngoc Thuy Pham cộng (2016), Bioactive Compound Yield and Antioxidant Capacity of Helicteres hirsuta Lour Stem as Affected by Various Solvents and Drying Methods Journal of Food processing and preservation [15] Lê Thanh Phước Nguyễn Hữu Duyên (2016), Khảo sát hoạt tính gây độc với 27 dòng tế bào Hep- G2 (Ung thu gan) loại cao chiết từ An xoa [16] Lê Thanh Phước Nguyễn Hữu Duyên (2016), Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào HepG2 An xoa ( Helicteres hirsuta L.) [17] Nhóm tác giả Dang Ngoc Quang (2018), Cytoxic constituents from Helicteres hirsuta collected in Viet Nam [18] Nguyễn Quang Quyền (2018) Bài giảng giải phẫu học, Nxb Y học, Thành phố Hồ Chí Minh [19] Phạm Hồng Ngọc Thúy cộng (2017), “Nghiên cứu thành phần hóa học khả chống oxy hóa cao chiết khô, dịch nước tăng hàm lượng saponin thân An xoa tăng nồng độ butanol [20] Phạm Hồng Ngọc Thúy cộng (2017), Nghiên cứu khả kháng khuẩn, điều hòa hệ miễn dịch chống ung thư từ cao chiết An xoa [21] Viện dược liệu – y tế (2006), Phương pháp nghiên cứu dược lý thuốc từ Dược thảo [22] Viện dược liệu - Bộ y tế, (2006) Phương pháp nghiên cứu dược lý thuốc từ Dược thảo [23] Xi Yang Kenjuan Li (2016), Nghiên cứu khả kháng khuẩn, điều hòa hệ miễn dịch chống ung thư từ cao chiết An xoa [24] Lê Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Thị Quyên, Phạm Thị Hằng Nga, Lưu Thị Bích Ngọc (2015), Sơ nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng ức chế số dòng tế bào ung thư An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro) [25] Lê Thị Hải Yến cộng (2017), Nghiên cứu tác dụng giảm đau chống viêm chuột nhắt trắng từ cao chiết An xoa [26] Zarik A, Shemau Z, Abdullahi M, Halima SA, Yusuf AZ, (2017) ‘Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata linn’, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, Vol 6, No [27]John E Hall, (2020), Guyton and Hall textbook of Medical Physiology [28]Tạp chí đơng y, (2020), Cây An xoa – Đặc điểm, công dụng thuốc trị bệnh 28 ... SINH - MÔI TRƯỜNG  VŨ THỊ THẢO NHI Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa (Helicteres hirsuta Lour) mơ hình chuột nhắt trắng dòng BALB/C bị gây tổn thương gan Paracetamol. .. vệ gan loài Xuất phát từ lí trên, chúng tơi tiến hành chọn đề tài ? ?Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cao chiết etanol từ An xoa (Helicteres hirsuta Lour) mơ hình chuột nhắt trắng dịng BALB/C bị gây. .. không gây chết chuột Chưa xác định giá trị LD 50 chưa thể độc tính cấp lô thực nghiệm 1.2 Về tác dựng bảo vệ gan Cao chiết etanol từ An xoa có tác dụng bảo vệ gan chuột nhắt trắng - Cao chiết etanol