NGHIÊN CỨU TÂC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA SAPONIN CHIẾT XUẤT Từ GIẢÕ CỔ LAM iGynostemma pentaphyl- lum Thunb.. Tuy nhiên, những nghiên cứu tác dụng sinh học chủ yếu trên đối tượng là dịch chiế
Trang 1NGHIÊN CỨU TÂC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA SAPONIN
CHIẾT XUẤT Từ GIẢÕ CỔ LAM iGynostemma pentaphyl-
lum (Thunb.) Markino Cucurbinaceae)
Thân Thị Kiều My*, Phạm Thanh Kỳ* Nguyễn Trọng Thông**, Phạm Thị Vân Anh**
* Trường Đại học Dược Hà Nội, ** Trường Đại học Y Hà Nội
SU M M A R Y
H ep ato pro tective effects o f sa ponin o f G ynostem m a pentap hyllu m w ere stu d ied In term o f liver- p ro tective effects on p a ra ce tam ol- po iso n e d m ice The results sh o w e d the sa po n in s a t do ses o f 200 m g/kg a n d 600 m g/kg b o d y w eig h t o f m ice d e creased serum concentrations o f AST, A LT a n d d eclied consid era bly the liver h isto pa th o log yca l injuries In pa racetam ol- p o iso n e d m ice Sap on ln s o f G pentap hyllu m sh o w e d a n tio xid a n t e ffect through decreasing MD A concentration o f the ho m og en ized m ass o f m o u se liver Th at effect
Is sim ila r w ith the e ffect o fsilym a rin a t d o se o f7 0 m g /kg b o d y w eig h t o f m ice.
Đặt vấn để
Giảo cổ lam còn gọi là cây c ổ yếm Theo Võ
Văn Chi [1], dược liệu có tác dụng tiêu viêm, giải
độc, chửa ho và long đờm Trên thế giới Giảo cổ
lam được biết đến với tác dụng tăng lực, hạ đường
huyết, hạ lipid máu Từ năm 1998 đến nay đâ có
nhiều đề tài nghiên cứu vé thành phần hóa học
[2] [3] [4] và tác dụng sinh học của Giảo cổ lam [5]
[6] [7] để có cơ sở khoa học cho việc sử dụng dược
liệu này làm thuốc chữa bệnh Tuy nhiên, những
nghiên cứu tác dụng sinh học chủ yếu trên đối
tượng là dịch chiết toàn phần, chưa có nghiên cứu
về tác dụng của saponin chiết xuất từ Giảo cổ lam
Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu tác dụng
bảo vệ gan của saponin chiết xuất từ Giảo cổ lam
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu:
Saponin được chiết xuất từ Giảo cổ lam thu hái
ỞSapa (Lào Cai) vào tháng 7/2010
Dược liệu sau khi thu hái được phơi khô và
chiết với methanol, loại bỏ tạp chất, cuối cùng két
tủa saponin bằng aceton Saponin thô được tinh
chế, sấy khô và bảo quản trong lọ kín tránh hút
ẩm
Động vật thí nghiệm:
Chuột nhát trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khỏe
mạnh, cân nặng từ 18-22g do Viện vệ sinh dịch tễ
Trung ương cung cấp
Chuột được nuôi trong điéu kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ thức ăn và nước uống tự do tại
bộ môn Dược lý- trường Đại học Y Hà Nội
Hóa chất và thiết bị:
- Silymarin dạng viên nén 70mg, paracetamol (PAR)
và các hóa chất đủ tiêu chuẩn thí nghiêm
- Máy xét nghiệm sinh hóa Screen- Master của hãng Hospitex Diagnostic (Italỵ) Kit định lượng AST, ALT của hãng Hospitex Diagnostic (Italy)
- Máy định lượng ELISA LX800 (Nhật)
- Kính hiển vi quang học để đọc tiêu bản giải phẫu vi thể gan
Phương pháp nghiên cứu:
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của saponin
Giảo cổ lam trên mô hình gây tổn thương gan
bằng paracetamol [8].
- Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành
5 lô, mỗi lô 10 con
Chuột được uống nước hoặc thuốc thử liên tục trong 8 ngày Ngày thứ 8, sau khi uống thuốc 3h, chuột được nhịn đói 16-18 giờ trước đó, gây tổn thương gan chuột ở các lô từ lô 2 đến lô 5 bằng uống paracetamol (PAR) liều 400mg/kg thể trọng với thể tích 0,2ml/10g
48 giờ sau khi uống PAR, lấy máu động mạch cảnh của chuột để định lượng enzym AST và ALT, đóng thời lấy gan để xác định khối lượng và quan sát mô bệnh học (đại thể, vi thể)
Trang 2Lô 1 ( ch ứ n g sinh h ọ c ):
Lô 2 (gây m ô hình viêm
g an):
Lô 3 (chứng dương):
Lô 4 (th uố c th ử liễu th ấp )
Lô 5 (th uố c th ử liéu cao):
Uổng nước cất 0,2m l/10g
th ể trọng.
Uổng nước cẩt+ uổng PAR.
Uống PAR + uống Silym arin 70m g/kg.
Uống PAR + saponin G iảo cổ lam 2 0 0 m g/kg
Uống PAR + sap onin G iảo cổ lam 600m g/kg
Chuột được giết bằng cách lấy máu động
mạch cảnh, mổ bụng để bộc lộ gan, bóc tách toàn
bộ gan và ngâm ngay vào dung dịch nước muối
sinh lý Lọc sạch các tổ chức xung quanh, dùng gạc
thấm khỏ rói đem cân Ghi lại khối lượng gan từng
chuột Khối lượng gan tương đối bằng tỷ lệ khối
lượng cơ quan này so với trọng lượng của từng
chuột tương ứng
gan
Khối lượng gan tương
đối (%o)
Kh ối lượng g a n (g) X
1 0 0 0 (%o)
T h ể trọng ch u ộ t (g)
hiện khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của chất thử và gọi là hoạt tính chống oxy hóa của thuốc
Tách gan chuột và nghiền đổng thể trong dung dịch KCI 1,15% theo tỷ lệ 1:10 ở nhiệt độ O-S^c Lấy 2ml dịch đóng thể + 1 ml đệm Tris 25mM, ủ ở 37“C trong 60 phút Thêm vào 1 ml acid tricloacetic (TCA) 10%, ly tâm lấy dịch trong, cho phản ứng với
Im l acid thiobarbituric (TBA) 0,8% ở 100"C trong
15 phút và đo màu ở x= 532 nm
Tính kết quả:
Hàm lượng MDA (nM/ml dịch nghiền đổng thể gan) được tính theo phương trình hói quy tuyến tính của chất chuẩn MDA
Thiết lập đường chuẩn MDA:
- MDA chuẩn Im l nóng độ từ 0,3045 - 0,609 nM/ml
-TCA 10% 1 ml -TBA 0,8% Im l
- Hiện màu ở 1 0 0 °c trong 15 phút Đo quang
ỞẰ- 532nm Phương pháp xử lý số liệu
só liệu được sử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học (t-test Student và test trước sau) sử dụng công cụ Data Analysis của Microsoft Excel 2003 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p
< 0,05
Qui ước trong phẩn kết quả: số liệu được biểu diễn dưới dạng:
Kí hiệu:
- p so với lò chứng sinh học * ;<0,05; ** ;<0,01
MDA là sản phẩm chuyển hoá trung gian của
quá trình peroxy hoá lipid đã được miêu tả bởi
Tanaka M [9] Đánh giá quá trình peroxy hoá lipid
thòng qua việc xác định hàm lượng MDA
/Vguyén/ỹ;MDAphảnứngvớiaddthiobarbituric
để tạo phức trimethine có màu hổng và có đỉnh
hấp thụ cực đại ở bước sóng 530 - 532nm Hàm
lượng MDA trong dịch đóng thể gan chuột được
xác định dựa theo độ hấp thụ quang học của dung
dịch chứa mẫu thử so với dung dịch MDA chuẩn
có nóng độ đã biết trong cùng một điéu kiện thí
nghiệm
Thực nghiệm: Chiết MDA từ gan MDA được xác
định bằng phản ứng tạo màu hổng bển với acid
thiobarbituric ở bước sóng 532nm cư ờng độ màu
tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Lượng MDA trong
mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh biểu
Kết quả và bàn luận
Ảnh hưởng của saponin Giảo cổ lam lên khối lượng gan chuột
Kết quả ở bảng 1 cho thấy:
Khối lượng tế bào gan chuột ở lô 2 (mô hình) tăng rõ rệt (31,25%) so với lô chứng sinh học (p < 0,05)
ở các lô uống thuốc (cả thuốc thử và thuốc chứng dương) khối lượng gan đều tăng cao so với
lô chứng sinh học.Tuy nhiên saponin liều 200 mg/
kg và 600 mg/kg đâ hạn chế được sự tăng khối lượng gan tương đối so với lô mô hình, nhưng chỉ
ở lô chuột uống saponin liều 200mg/kg sự khác biệt mới có ý nghĩa thống kê (p<0,05), tác dụng của saponin liều 200mg/kg tương đương với silỵmarỉn liếu 70mg/kg
Trang 3Lồ th í nghiệm
Khối lượng gan tương đối (%o)
± SD )
p so vóri 1 p so
VCTÌ2
B à ĩig l.Á n h h ư d n g á ia s a p o n in ữ ả o c iliim lê n trọ n g lư m g g a n d iu ộ tb ịg â y ílộ c b â iig p a n K e ta m o l Ảnh hưởng của saponin Giáo cổ lam lên hoạt
độ AST và ALT.
Kết quả ở bảng 2 cho thấy:
Hoạt độ AST ở lô 2 mô hình gây độc bằng paracetamol tăng cao rõ rệt (>300%) so với lô chứng sinh học (p <0,001)
Hoạt độ AST ở lô chuột uống saponin liều 200 mg/kg, 600 mg/kg và S ily m a rin liều 70mg/kg thể trọng 8 ngày trước khi gây độc đã giảm rõ rệt so với lô 2 (p < 0,001-0,05) nhưng vẫn tăng hơn lô 1 chứng sinh học Mức độ hạn chế tăng hoạt độ AST
ở các lô chuột uống saponin và S ily m a rin tương đương nhau
Bông 3 Ánh hưdng ứasapom ữáo cổ lom lên hoạt Sộ ALĨ trong huyữ thanh chuột bj gây độc bồng paracetamol
LÔ I
(chứng sinh
học)
Lô 2
(Mô hình)
Lô 3
Silymarin liều
70mg/kg
Lô 4
Saponin 200mg
/kg
Lô 5
Saponin 600mg
/kg
4 8 ± 16
63 ± 2 5
59 ± 2 2
56 ± 1 9
60 + 32
p<0,05
p<0,01
p<0,01
p<0,001
p>0,05
p<0,05
p>0,05
Sàng 2 Ằnhhưdngsapom 6iào cổ tom lêti hoạt iệ A5Ĩ tiong huyẽt thanh chuột bị gây độc bâng
pơracetamol
Lô th í
n ghiệm
H oạt độ AST
(U I^
p so vởi 1 p so vd i 2
LỎ I
(chứng
sinh học)
118,74 ±
117,51
Lô 2
(Mò hình)
391,55 ±
LÔ3
Silymarin
liéu 70mg/
kg
179,82
LÔ4
Saponin
200mg /kg
155,23 ±
LÔ5
Saponin
600mg /kg
184,94 ±
Lô thí nghiệm
H oạt độ ALT
(Ul/I) ( ± SD) p so vó i 1 p so
vóri2
LÔ I (chứng sinh học)
101,80 ± 87,94
Lô 2 (Mô hình) 522,51 ±415,97 p<0,001
LÔ3 Silymarin liéu 70mg/
kg
397,56 ± 359,20 p<0,001 p<0,05
LÔ4 Saponin 200mg /kg
112,49 ± 117,26 p>0,05 p<0,001
LÔ5 Saponin 600mg /kg
245,37 ±190,81 p<0,001 p<0,001
Kết quả ở bảng 3 cho thấy:
Hoạt độ ALT ở lô 2 mô hình gây độc bằng paracetamol tăng cao rô rệt (>500%) so với lô chứng sinh học (p < 0,001)
Hoạt độ ALT ở các lô chuột uống saponin liều 200mg/kg, 600mg/kg và Silymarin liều 70mg/kg trong 8 ngày trước khi gây độc đâ giảm rõ rệt so với lô 2 (p < 0,05- 0,01) nhưng vẫn tăng hơn lô chứng sinh học
48 ị Nghiên Cứu dược Thòng tín thuõc! Số 2/20 12
Trang 4Hoạt độ AST ở các lô uống saponin thấp hơn
so với lô uống silymarin Liều saponin 200mg/kg
có tác động hạn chế sự tăng hoạt độ ALT tốt hơn
liều 600mg/kg và tốt hơn silymarin liều 70 mg/kg
(p<0,05)
Ảnh hường của saponin giảo cổ lam lên sự
thay đổi hàm lượng MDA
Kết quả ở bảng 4 cho thấy:
Hàm lượng MDA ở lô 2 mô hình gây độc bằng
paracetamol tăng cao rô rệt so với lô 1 chứng sinh
học
Hàm lượng MDA ở các lô chuột uống saponin
và silymarin 8 ngày trước khi gây độc đã giảm
so với lô 2 Tuy nhiên sự khác biệt chỉ có ý nghĩa
thống kê ở lô uống saponin liều 200mg/kg và
silymarin (p<0,05), tác dụng này tương đương với
silymarin
Ảnh hưởng cửa saponin giảo cổ lam lên sự
thay đổi mô bệnh học g a n
Bảng 5 Ảnh hưởng cùơsaponín Giâo cổ lam lên sựthay đổi mô bệnh học gan
Bâng 4 Ảnh hưởng của saponin giảo cổlơm lẻn hàm lượng MDA gan chuột nhât bị gây độc bâng paracetamol
Lô th í nghiệm
Hàm lượng MDA (nm ol/m l) (
^ ± SD )
p so
Lô 1 (chứng sinh học)
9,63 ± 7,56
Lô 2
(M ô h ìn h ) 12,48 ±7,60 p<0,05
LÔ3
Silymarin liéu
70m g/kg
10,07 ± 6 ,6 4 p>0,05 p<0,05
LÔ4
Saponin
2 0 0 mg /kg
9,32 ± 3 ,1 0 p>0,05 p<0,001
LÔ5 Saponin 600m g /kg
10,47 ± 8 ,0 0 p>0,05 p>0,05
Chứng sin h học
Gan m àu đỏ, m ặt n hẵn , m ật
độ m ễm , không phù né, không sung h uyết
Tất cả các m ẫu bệnh phẩm
có cấu trú c bình thườ ng ,
tế bào gan không hoại tử, không th o ái hóa, không có xâm n hập viêm và không tăng liên k ễ tx ơ
- 'i- '- ' ■ ’
Mô hình
G an m àu đ ỏ th âm , ph ù nễ, sung h uyết, bề m ặt không
nh ẵn , có ch ỗ bỊ hoại tử và bạc m àu , có nhiễu chấm xu ất
h uyết
Các m ẫu bệnh phẩm có
n h iế u ổ v iê m 2 / 3 m ẫ u
b ện h ph ẩm có th o ái hóa,
m ức độ vừa ở n hu m ô g an.
‘ ~i*yìì'~~ r n ì i * » i i _ j|*
Silym arin
70m g/kg
Gan m àu đỏ, sung h u yét nhẹ,
có m ột vài đ iểm tổn thươ ng ,
m ột vài đ iểm bạc m àu.
2/3 m ẫu bệnh phẩm có thoái hóa m ức độ nhẹ
và vừ a , tăn g ch i số nhân
ch ia 1/3 m ẫu bệnh phẩm gan trong giới hạn bình
th ườ ng
S ap o n in 200m g/kg
Gan m àu đỏ, sung h uyết tổn
th ươ ng m ức độ n hẹ Bẻ m ặt nhẵn
Tất cả các m ẫu bệnh phẩm trong giới hạn bình
th ườ ng
Sap o n in 600m g/kg
Gan m àu đỏ, sung h uyết, bé
m ặt không n hẵn , tổn thươ ng
m ức độ nhẹ và vừ a, có m ột số điểm bạc m àu
2/3 các m ẫu bệnh phẩm
có th o ái hoá nhẹ Trong
đó 1/3 m ẫu bệnh phẩm có xâm n hập viêm
Số 2/2012 Nghiên CỨU dược Thông tin thuoc 49
Trang 5Bàn luận: vệ gan, chống oxy hóa của saponin cao hơn nhiều
và 600mg/kg có tác dụng làm hạn chế tổn thương lam có thể rất có giá trị trong điều trị và phòng gan thông qua làm hạn chế tăng khối lượng gan ngừa nhiều bệnh như xơ vữa động mạch, bệnh tương đối và hoạt độ AST, ALT; làm giảm nồng độ gan và các triệu chứng viêm
MDA trong dịch đóng thể gan; hạn chế được tổn
thương trên giải phẫu vi thể gan Tác dụng này Kết luân
So sánh tác dụng của saponin Giảo cổ lam chết tăng khối lượng gan tương đối, hạn chế tăng liéu 200 mg/kg và liều 600mg/kg thấy rằng liéu hoạt độ enzym AST, ALT và ha^n chế tổn thương 200mg/kg thể trọng chuột của saponin giảo cổ đại thể và vi thể gan
lam có tác dụng bảo vệ tế bào gan, chống oxy hóa Saponin của Giảo cổ lam ở cả 2 liều 200mg/
So sánh tác dụng của saponin toàn phẩn với thông qua lam giảm hàm lượng MDA dịch đổng các thử nghiệm trước đây cho thấy tác dụng bảo thể gan Với liều 200mg/kg có tác dụng tương
đương Sily m a rin liéu 70mg/kg
Tàí liệu tham khảo
1 Võ Văn Chi (1997), T ừ O è n că y thuóc Việt Nam, NXB Y học, trang 308- 310.
2 Phạm Thanh Kỳ, Phạm Tuấn Anh, Trần Thị Thu Hương, Chu Đinh Kinh (2008): Ombuin, Quercetin, acid vanillic phăn lập từ c ă y
Giảo cổ lam (C pentaphyllum (Thunb.) Markino) ở Việt Nam, Tạp chi D ược học số 7, trang 31-36.
3 Phạm Thanh Kỳ, Thân Thị Kiều My, Phan Văn Kiệm (2010), Phàn lập và xá c đính cấu trúc Rutin và Om buosid từ Giảo cổ lam (G
pentaphyllum (Thunb.) Marklno), Tạp chí D ư ợ c liệu số 3, trang 168-174.
4 Phạm Thanh Kỳ, Phạm Thanh Hương, Thân Thị Kiều My, Phạm Tuấn Anh, Phan Văn Kiệm et al (2010), Dammarane-type saponins
from Gynostemm a pentaphyllum, Phytochemistry 71, p 994- 1001.
5 Phạm Thanh Kỳ, Vũ Đ ứ c Cảnh, Phạm Thanh Hương, Nguyễn Kim Phượng (2007), Nghiên cứ u tác dụng hạ c h o le s t e ro l máu cùa
dư ợc liệu Giảo cồ lam (G pentaphyllum (Thunb.) Markino), Tạp chi D ư ợ c học số 5, trang 9-10.
6 Phạm Thanh Ký, Phan Thị Thu Anh, Phan Thị Phi Phi (2007), Nghiên cứu tác dụng tăng đáp Cmg miễn dịch cùa d ư ợ c liệu Giảo cổ
lam G pentaphyllum (Thunb.) Matkino, Tạp chí thông tin Y dược số 5, trang 35-39.
7 Phạm Thanh Kỳ, Phạm Thanh Hương, Trần Lưu Vân Hiền (2007), Nghiẻn cứ u tác dụng ứ c ch é khối u cùa saponin chiét xuất từ
Giảo c ổ lam- G, pentaphyllum (Thunb.) Markino, Tạp chí thông tin Y dược số 11, trang 36-39.
8 Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Trọng Thông, Nguyễn Thiện Ngọc và c s (2007), Nghiên cứ u tác dụng chống o xy hóa của cao quả nhàu
trên hai mô hình gă y tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng CCI^ và paracetam ol, Tạp chi D ư ợ c học số 4, trang 22-25 và 36.
9 Guwri(sel senner, H ale z Tklu and al (2006), Protective effects o f resveraừ al against acetaminophen induced toxicity in mice
Hepatology R ese a rch vol 35, p 62-68.
10 Lin J.M , Lin c c and al (2000), “Antioxidant and hepatoprotective effects o f Anoectochilus form osanus and Gynostemma penta-
phyllutri’ Am J Chin Med, 28(1), p 87-96.
50 Nghiên CỨU dược Thông tin thuõc I Số 2/2012