Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao giảo cổ lam 7 lá ( gynostemma longipes)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, xu hƣớng trở về với thiên nhiên ngày càng trở nên phổ biến trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Nhiều dƣợc liệu cổ truyền đã đƣợc nghiên cứu sản xuất thành các dạng bào chế hiện đại, tiện lợi để phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho nhân dân. Giảo cổ lam từ lâu đã là một vị thuốc quý đƣợc ngƣời dân ở nhiều nƣớc châu Á trên thế giới sử dụng để nâng cao sức khỏe và tuổi thọ. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu khoa học chỉ ra những tác dụng sinh học của giảo cổ lam nhƣ tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, tác dụng hạ đƣờng huyết, tác dụng hạ cholesterol, tác dụng bảo vệ tim mạch, chống stress… 23, 28, 29, 38, 39. Ở Việt Nam, các chế phẩm giảo cổ lam ngày càng đƣợc ngƣời dân sử dụng rộng rãi để chăm sóc sức khỏe. Những tác dụng sinh học của giảo cổ lam đƣợc cho là tác dụng của các Gypenosid (các saponin trong giảo cổ lam) 23, 27. Nhằm mục tiêu ổn định chất lƣợng trong nghiên cứu cũng nhƣ sử dụng làm thuốc chúng tôi nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn cao gypenosid GCL 7 lá; từ đó đánh giá tác dụng chống oxy bảo vệ gan của saponin trong giảo cổ lam 7 lá theo đề tài: “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao Giảo cổ lam 7 lá Gynostemma longipes” với 3 mục tiêu chính: Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7 lá. iểm nghiệm và đƣa ra dự thảo tiêu chuẩn cao gypenosid GCL 7 lá Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa ảo vệ gan của cao gypenosid GCL 7 lá.

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - LÊ MAI PHƢƠNG XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO GIẢO CỔ LAM LÁ (GYNOSTEMMA LONGIPES) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ MAI PHƢƠNG XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO GIẢO CỔ LAM LÁ (GYNOSTEMMA LONGIPES) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: Ths Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc liệu HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Phạm Tuấn Anh – Bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Thầy ngƣời ln tận tình bảo, hƣớng dẫn phƣơng pháp nghiên cứu khoa học, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Lê Thanh Bình, ngƣời ln sẵn sàng giúp đỡ tơi q trình tơi hồn thành khóa luận môn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, thầy cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dƣợc liệu tạo điều kiện giúp tơi hồn thành khóa luận Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khích lệ, giúp đỡ tơi lúc khó khăn để tơi đạt đƣợc kết ngày hôm Hà Nội, tháng năm 2014 Sinh viên Lê Mai Phƣơng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI GYNOSTEMMA 1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma .2 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Gynostemma 1.1.3 Đặc điểm số loài chi Gynostemma 1.2 THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG CHI GYNOSTEMMA .5 1.2.1 Saponin nhân Dammaran 1.2.2 Saponin chi Gynostemma 1.2.3 Tác dụng sinh học .8 1.3 T NG QU N VỀ C O THU C .12 1.3.1 Khái niệm 12 1.3.2 Yêu cầu tiêu chuẩn chất lƣợng cao thuốc .13 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 13 2.1.1 Nguyên liệu .13 2.1.2 Thiết bị hóa chất 14 2.1.3 Động vật thí nghiệm 15 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất tinh chế cao gypenosid GCL 15 2.3.2 Kiểm tra tiêu cao Gypenosid GCL 17 2.3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan 18 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu [4] 20 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT GYPENOSID .21 3.1.1 Khảo sát phƣơng pháp chiết xuất 21 3.1.2 Tinh chế 23 3.2 KIỂM TRA MỘT S CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM GYPENOSID 26 3.2.1 Mô tả .26 3.2.2 Độ ẩm 26 3.2.3 Độ đồng 27 3.2.4 Định tính 27 3.2.5 Định tính sắc ký lớp mỏng .28 3.2.6 Định lƣợng saponin toàn phần 29 3.3 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN VÀ CH NG OXY HÓA 31 3.3.1 Ảnh hƣởng Gypenosid lên trọng lƣợng gan chuột nhắt trắng bị gây độc paracetamol 31 3.3.2 Ảnh hƣởng Gypenosid lên hoạt độ AST, ALT huyết chuột bị gây độc paracetamol 32 3.3.3 Ảnh hƣởng Gypenosid lên thay đổi hàm lƣợng MDA dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng bị gây độc paracetamol 33 3.3.4 Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên thay đổi mô bệnh học gan 34 3.4 BÀN LUẬN 34 KẾT LUẬN .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ALAT Alanin amino transferase ASAT Aspartat amino transferase AST Ánh sáng thƣờng BuOH Butanol EtOH Ethanol G Gynostemma GCL Giảo cổ lam HDL High density lipoprotein LDL Low density lipoprotein MDA Malonyl diadehyd PAR Paracetamol RSD Độ lệch tƣơng đối SD Độ lệch chuẩn SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TBA Thiobarbituric TCA Tricloacetic TCCS Tiêu chuẩn sở TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG ảng 1.1 3.1 3.2 3.3 TÊN BẢNG Trang Các nhóm hoạt chất tƣơng ứng saponin G pentaphyllum Hàm lƣợng saponin toàn phần thu đƣợc sử dụng phƣơng pháp chiết khác ết khảo sát dung môi rửa giải 22 23 Hiệu suất tinh chế theo quy trình 24 3.4 ết xác định độ ẩm cao gypenosid GCL 27 3.5 ết định t nh nhóm hợp chất cao giảo cổ lam 28 3.6 Định lƣợng saponin toàn phần cao gypenosid GCL 30 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Ảnh hƣởng cao gypenosid GCL lên trọng lƣợng gan chuột ị gây độc ằng paracetamol Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên hoạt độ ST huyết chuột gây độc ằng paracetamol Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên hoạt độ LT huyết chuột gây độc ằng paracetamol Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên hàm lƣợng MDA gan chuột nhắt bị gây độc paracetamol Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên thay đổi mô ệnh học gan 31 32 33 33 34 DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH 1.1 TÊN HÌNH Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic TRANG 1.2 Cấu trúc saponin G.pentaphyllum 1.3 Các cấu trúc nhóm R7 2.1 2.2 3.1 Quy trình nghiên cứu tác dụng chống oxy hố mơ hình gây tổn thƣơng gan ằng paracetamol Phản ứng tạo phức MDA Sơ đồ quy trình chiết xuất tinh chế cao gypenosid GCL 19 20 25 3.2 Cao gypenosid GCL 26 3.3 Định t nh cao gypenosid GCL ằng S LM 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, xu hƣớng trở với thiên nhiên ngày trở nên phổ biến giới nhƣ Việt Nam Nhiều dƣợc liệu cổ truyền đƣợc nghiên cứu sản xuất thành dạng bào chế đại, tiện lợi để phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho nhân dân Giảo cổ lam từ lâu vị thuốc quý đƣợc ngƣời dân nhiều nƣớc châu Á giới sử dụng để nâng cao sức khỏe tuổi thọ Trên giới có nhiều nghiên cứu khoa học tác dụng sinh học giảo cổ lam nhƣ tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, tác dụng hạ đƣờng huyết, tác dụng hạ cholesterol, tác dụng bảo vệ tim mạch, chống stress… [23], [28], [29], [38], [39] Ở Việt Nam, chế phẩm giảo cổ lam ngày đƣợc ngƣời dân sử dụng rộng rãi để chăm sóc sức khỏe Những tác dụng sinh học giảo cổ lam đƣợc cho tác dụng Gypenosid (các saponin giảo cổ lam) [23], [27] Nhằm mục tiêu ổn định chất lƣợng nghiên cứu nhƣ sử dụng làm thuốc chúng tơi nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất tiêu chuẩn cao gypenosid GCL lá; từ đánh giá tác dụng chống oxy bảo vệ gan saponin giảo cổ lam theo đề tài: “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cao Giảo cổ lam Gynostemma longipes” với mục tiêu chính: - Xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế cao gypenosid GCL - iểm nghiệm đƣa dự thảo tiêu chuẩn cao gypenosid GCL - Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa ảo vệ gan cao gypenosid GCL CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI GYNOSTEMMA 1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Theo tài liệu Thực vật dƣợc phân loại thực vật [4], Cây cỏ Việt Nam [13], chi Gynostemma đƣợc xếp vào họ Cucurbitaceae (họ bầu bí) Vị trí chi Gynostemma hệ thống phân loại thực vật dƣợc Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Sổ Dilleniidae Liên Hoa tím Violanae Bộ Bí Cucurbitales Họ Bầu bí Cucurbitaceae Chi Gynostemma 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Gynostemma Chi Gynostemma đƣợc mô tả Blume vào năm 1825 dựa đặc điểm hình thái lồi G simplicifolium [45] Một số đặc điểm chung loài thuộc chi Gynostemma [13],[45]: Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm Lá kép, t đơn, kh a cƣa Tua chẻ đơi, đơi có tua đơn Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, hoa đực Hoa nhỏ, màu trắng lục nhạt, có bắc con; cuống hoa có đốt Đài hoa hình ánh xe, chia thùy, ngắn Tràng hình ánh xe, hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn Nhị 5, phần gốc nhị hàn liền thành cột Bao phấn ơ, nhƣng nhìn nhƣ Nhụy: bầu hình cầu nhỏ, – ngăn, – vòi nhụy với đầu nhụy chia – đầu nhọn Quả hình cầu lớn hạt đậu, khơng mở, – hạt hình trứng dẹt bên có góc Hạt sần sùi Các loài chi Gynostemma phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới châu Á Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia Tân Guinea Loài G 28 Tanin (+++) (-) Phản ứng với dd gelatin 1% (-) Phản ứng với dd chì acetat 10% Saponin Quan sát tƣợng tạo bọt Phản ứng với dd FeCl3 5% (-) Có Khơng có Acid hữu Phản ứng với Na2CO3 (-) Không có Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin (-) Khơng có Đƣờng khử Phản ứng với TT Fehling (+) Có Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol (+) Có Chất béo Tạo vết mờ giấy lọc (-) Khơng có 10 Sterol Phản ứng Liebermann (-) Khơng có 11 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc (-) Khơng có 12 Anthranoid Phản ứng Borntraeger (-) Khơng có Phản ứng với TT Mayer (-) Khơng có Phản ứng với TT Dragendorff (-) Khơng có Phản ứng với TT Bouchardat (-) Khơng có 13 Alcaloid Ghi chú: +++ : dƣơng t nh rõ (+): dƣơng t nh (-): âm tính Nhận xét: Từ kết bảng 3.5 thấy cao gypenosid GCL chứa đƣờng khử, polysaccharide chủ yếu saponin Đề nghị: sử dụng thí nghiệm tạo bọt làm tiêu định tính saponin dự thảo tiêu chuẩn gypenosid GCL 3.2.5 Định tính sắc ký lớp mỏng Dung mơi khai triển Chloroform – Ethylacetat – Methanol – Nƣớc (25 : 40 : 22 : 10) Dung dịch thử 29 Cân xác khoảng 0,1g cao giảo cổ lam hòa tan 1ml MeOH, lắc cho tan hết, lọc qua giấy lọc dùng chấm sắc ký Cách tiến hành Chấm dung dịch thử mỏng hoạt hóa Triển khai với hệ dung mơi nói Quan sát mỏng sắc ký dƣới ánh sáng thƣờng với thuốc thử màu Vanilin/H2SO4 đặc, sấy 110oC 10 phút Kết thúc Rf = 0,80 Rf = 0,22 M1 M2 M3 Bắt đầu Hình 3.3 Định tính cao gypenosid GCL SKLM Nhận xét: Khi định tính sắc ký lớp mỏng mẫu cao với hệ dung môi chọn, sắc ký đồ có phân tách rõ ràng thống mẫu cao Các vết sắc ký phân bố khoảng Rf = 0,22 – 0,80 Đề nghị: Chọn hệ Chloroform – Ethylacetat – Methanol – Nƣớc 25:40:22:10 để đƣa vào tiêu kiểm nghiệm cao gypenosid GCL SKLM 3.2.6 Định lƣợng saponin toàn phần Sử dụng phƣơng pháp đo quang theo mục 2.3.1 để định lƣợng saponin toàn phần cao gypenosid GCL 30 Bảng 3.6 Định lƣợng saponin toàn phần cao gypenosid GCL STT Khối lƣợng cao (g) Hàm lƣợng saponin toàn phần (%) 1,012 93.3 1.035 89.2 0.981 91.8 Trung bình 91.4 ± 2.1 Nhận xét: Hàm lƣợng saponin tồn phần tính theo Rb1 cao gypenosid GCL đạt 91.4 ± 2.1% Đề nghị: Hàm lƣợng saponin tồn phần tính theo Rb1 cao gypenosid GCL phải đạt từ 85-95 định lƣợng phƣơng pháp đo quang Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao giảo cổ lam Dựa theo kết khảo sát mục 3.2, dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao giảo cổ lam đƣợc xây dựng nhƣ sau: CAO GYPENOSID GCL LÁ Cao gypenosid GCL đƣợc bào chế từ dƣợc liệu giảo cổ lam (Gynostemma longipes), họ Bầu Cucur itaceae theo phƣơng pháp th ch hợp Mô tả Cao gypenosid GCL dạng bột, đồng nhất, màu vàng, mùi thơm đặc trƣng, vị đắng Định tính A Cho vào ống nghiệm lớn 0.1g cao, thêm ml nƣớc Lắc mạnh phút Để yên quan sát tƣợng tạo bọt Sau 15 phút bọt bền vững B Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng Dung môi sắc ký: Chloroform – Ethylacetat – Methanol – Nƣớc (25:40:22:10) 31 Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,1g cao giảo cổ lam hịa tan 1ml MeOH, lắc cho tan hết, lọc qua giấy lọc Phần dịch lọc dùng để chấm sắc ký Tiến hành: Chấm dung dịch thử mỏng hoạt hóa Khai triển với hệ dung mơi Quan sát mỏng sau phun thuốc thử màu Vanilin/H2SO4 đặc ánh sáng thƣờng Sắc ký đồ phân tách đƣợc vết rõ ràng có giá trị Rf khoảng 0,22-0,80 Hàm lƣợng saponin toàn phần Saponin toàn phần cao gypenosid GCL phải đạt từ 85-95% tính theo R định lƣợng phƣơng pháp đo quang Mất khối lƣợng làm khô Dùng 0,5g chế phẩm sấy 105oC đến khối lƣợng không đổi Không 5% Độ đồng Đồng nhất, khơng có váng mốc, ã dƣợc liệu vật lạ Bảo quản Đóng ao ì, chống ẩm Để nơi khô, mát 3.3 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ẢO VỆ GAN VÀ CHỐNG OXY HÓA 3.3.1 Ảnh hƣởng Gypenosid lên trọng lƣợng gan chuột nhắt trắng bị gây độc paracetamol Bảng 3.7 Ảnh hƣởng cao gypenosid GCL lên trọng lƣợng gan chuột bị gây độc paracetamol Lô nghiên cứu Trọng lƣợng gan (g/10g thể trọng) Lô 0,49 ± 0,03 Lô 0,67 ± 0,09 p 0,05 Nhận xét: Hoạt độ AST lơ mơ hình tăng rõ rệt so với lô chứng sinh học (p 0,05) 33 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên hoạt độ ALT huyết bị gây độc paracetamol Lô nghiên cứu Lô Lô Lô Lô Lô p so lô chứng 51,10 ± 17,21 395,36 ± 93,41 332,89 ± 41,69 406,89 ± 95,51 296,11 ± 85,15 p so lô mô hình p so lơ uống silymarin > 0,05 > 0,05 0,05 > 0,05 < 0,001 < 0,001 < 0,001 < 0,001 Nhận xét: Hoạt độ ALT lơ mơ hình tăng rõ rệt so với lơ chứng sinh học (p0,05) Cao gypenosid GCL liều 200 mg/kg không làm giảm hoạt độ ALT so với lơ mơ hình Cao gypenosid GCL liều 600 mg/kg làm giảm rõ rệt hoạt độ ALT so với lô mô hình (p < 0,05) 3.3.3 Ảnh hƣởng Gypenosid lên thay đổi hàm lƣợng MDA dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng bị gây độc paracetamol Bảng 3.10 Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên hàm lƣợng MDA gan chuột nhắt bị gây độc paracetamol Lô nghiên cứu MDA (nmol/10 gam gan) Lô 2,35 ± 0,53 Lô 4,18 ± 1,58 0,05) 34 3.3.4 Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên thay đổi mô bệnh học gan Bảng 3.11 Ảnh hƣởng saponin giảo cổ lam lên thay đổi mô bệnh học gan Đại thể Lô nghiên cứu Chứng sinh học Gan màu đỏ, mặt nhẵn, mật độ mềm, khơng phù nề, khơng xung huyết Mơ hình Gan số màu đỏ thẫm, phù nề, xung huyết, bề mặt sần sùi, có nhiều chấm xuất huyết Một số có màu bạc, phù nề, bề mặt sần sùi, nhiều chấm chấm xuất huyết Silymarin 70mg/kg Gan màu đỏ, xung huyết nhẹ, khơng nhìn rõ điểm tổn thƣơng Cao gypenosid GCL Gan màu đỏ, số màu bạc, xung huyết, có chấm xuất - 200 mg/kg huyết Cao gypenosid GCL Gan màu đỏ, số màu bạc, xung huyết, có chấm xuất - 600 mg/kg huyết Nhận xét: Nhìn vào đại thể thấy lơ chứng dƣơng Silymarin có tác dụng rõ rệt so với mơ hình; cao gypenosid GCL liều có tác dụng nhƣng chƣa rõ ràng 3.4 BÀN LUẬN 3.4.1 Về xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế cao gypenosid GCL Q trình thử nghiệm chiết xuất quy mơ 50g dƣợc liệu mẻ với dung môi EtOH 70%, tiến hành với phƣơng pháp chiết xuất khác nhau: chiết siêu âm, chiết hồi lƣu cách thủy ngâm lạnh Kết khảo sát cho thấy chiết hồi lƣu cách thủy cho hiệu suất chiết hiệu cao Hơn chiết hồi lƣu cách thủy phƣơng pháp đơn giản, dễ thực Vì vậy, sau khảo sát sơ ộ, quy trình chiết hồi lƣu cách thủy với EtOH 70 đƣợc lựa chọn để thực q trình thực khóa luận Q trình tinh chế sử dụng phƣơng pháp chiết lỏng – rắn sử dụng nhựa hấp phụ D101 đƣợc lựa chọn sau tham khảo tài liệu sơ ộ tiến hành thực nghiệm Để lựa chọn dung môi rửa giải, tiến hành khảo sát với dung môi H2O, EtOH từ 10% đến EtOH 90%, MeOH Qua khảo sát cho thấy Saponin đƣợc rửa giải với dung môi 35 EtOH 30 đến 80% Sử dụng dung môi EtOH 20 EtOH 80 để thu saponin Sản phẩm tinh chế cao gypenosid GCL chứa chủ yếu saponin định lƣợng đạt 90 để loại tạp; EtOH 50% theo phƣơng pháp đo quang Tồn quy trình chiết xuất sử dụng phƣơng pháp đơn giản, dễ thực không dùng dung môi độc hại Đây xu hƣớng chiết xuất tinh chế sản phẩm tự nhiên dùng y học thực phẩm 3.4.2 Kiểm nghiệm đƣa dự thảo tiêu chuẩn cao gypenosid GCL Để xây dựng tiêu chuẩn cao đòi hỏi phải đánh g a nhiều mẫu trƣớc đƣa tiêu ch mặt tiêu chuẩn cao Trong khn khổ khóa luận, tiến hành mẫu cao sau đƣa đề xuất để xây dựng dự thảo tiêu chuẩn Theo tài liệu tham khảo [24], nghiên cứu giảo cổ lam G longipes chứng minh lồi có chứa chủ yếu saponin, flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, đƣờng khử, sterol, polysaccharid, saponin thành phần ch nh Do đó, chúng tơi tiến hành định tính lại nhóm chất hữu có mẫu cao khơ Kết cho thấy mẫu cao có chứa chủ yếu saponin; polysaccharid đƣờng khử xuất Từ kết thu đƣợc này, đề xuất số tiêu chuẩn định tính cao khơ giảo cổ lam phản ứng hóa học nhƣ sau: - Định tính có mặt saponin thí nghiệm tạo bọt - Định tính sắc ký lớp mỏng, sử dụng hệ dung môi thuốc thử thích hợp cho saponin Sắc ký đồ không phát chất tử ngoại, quan sát ánh sáng thƣờng sau phun thuốc thử Gần nhƣ không phát thấy khác biệt mẫu cao Định lƣợng saponin cao gypenosid GCL yêu cầu cao phải đạt 8595 saponin theo phƣơng pháp đo quang nhằm mục đ ch tiêu chuẩn hóa cao rõ ràng mặt hoạt chất, làm tảng cho thử nghiệm dƣợc lý 36 3.4.3 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan cao gypenosid GCL tế bào gan chuột nhắt trắng đƣợc gây độc paracetamol Gan quan có nhiều enzym đóng vai trị quan trọng việc chống oxy hóa, đặc biệt chất chống peroxyd chiếm thành phần chủ yếu gan Glutathion (GSH), enzym glutathione peroxydase (GSH- Px) xúc tác phân hủy peroxyd MDA sản phẩm cuối đƣợc sinh q trình peroxy hóa lipid màng tế bào Vì việc xác định hàm lƣợng MDA tổ chức tế đƣợc thực để từ đánh giá khả chống oxy hóa chất nghiên cứu thể qua việc làm giảm hàm lƣợng MDA Tác dụng chống oxy hóa đƣợc đánh giá tế bào gan chuột đƣợc gây độc cấp Paracetamol liều 400mg/kg ttc Trong q trình chuyển hóa Paracetamol có sản sinh chất trung gian hóa học, chất thể đƣợc liên hợp với glutathion nội sinh thành phức hợp khơng độc đào thải ngồi Khi nồng độ paracetamol cao, glutathion nội sinh không đủ để liên hợp, lƣợng chất chuyển hóa trung gian tăng mạnh, chất chứa gốc tự peroxide màng gây phá hủy tế bào Các chất có tác dụng chống oxy hóa, dọn gốc tự do, làm tăng nồng độ glutathione giúp giảm bớt trình Từ việc đánh giá tổn thƣơng thực thể tế bào gan, mức độ peroxide hóa màng tế bào lơ thử lơ chứng xác định mức độ chống oxy hóa hóa chất thử Trên mơ hình gây tổn thƣơng gan ằng paracetamol, cao gypenosid GCL liều 200mg/kg ttc tác dụng bảo vệ gan; liều 600mg/kg ttc có tác dụng bảo vệ gan thông qua làm giảm trọng lƣợng gan tƣơng đối, giảm hoạt độ AST, ALT tổn thƣơng đại thể gan Thông qua xác định hàm lƣợng MDA cho thấy cao gypenosid GCL liều không làm giảm lƣợng MDA so với lơ mơ hình Tuy nhiên nghiên cứu lơ chứng dƣơng sử dụng silymarin 70mg/kg ttc không thấy có tác dụng Nhƣ chƣa thể kết luận đƣợc mơ hình này, cần tiếp tục nghiên cứu sâu để làm rõ 37 KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài thu đƣợc kết sau: Đã xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế saponin từ giảo cổ lam - Chiết hồi lƣu cách thủy với dung môi EtOH 70%, chiết lần, thời gian 30 phút lần (tính từ lúc sơi), - Tinh chế phƣơng pháp chiết lỏng- rắn, sử dụng nhựa hấp phụ D101, rửa giải EtOH 20 để loại tạp, EtOH 50% EtOH 80 để thu gypenosid toàn phần Đã kiểm nghiệm đƣa dự thảo số tiêu cao giảo cổ lam Đã xác định đƣợc cao gypenosid GCL có chứa chủ yếu saponin, ngồi cịn có polysaccharide đƣờng khử Đã đề xuất số tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao gypenosid GCL ằng phản ứng hóa học: - Định t nh có mặt saponin ằng th nghiệm tạo ọt - Định tính sắc ký lớp mỏng, sử dụng hệ dung môi: Chloroform – Ethylacetat – Methanol – Nƣớc (25:40:22:10) thuốc thử vanillin/ acid sulfuric Sắc ký đồ quan sát ánh sáng thƣờng sau phun thuốc thử, vết chất phân tách tốt, phân bố khoảng Rf = 0,22-0,80 Đã định lƣợng saponin cao gypenosid GCL yêu cầu cao phải đạt 85-95% saponin theo phƣơng pháp đo quang Đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan cao gypenosid GCL Cao gypenosid GCL liều 200mg/kg khơng có tác dụng bảo vệ gan Cao gypenosid GCL mức liều 600mg/kg có tác dụng bảo vệ gan thơng qua làm giảm trọng lƣợng gan tƣơng đối, giảm hoạt độ AST, ALT tổn thƣơng đại thể gan 38 ĐỀ XUẤT Do thời gian có hạn, đề tài chƣa thể giải hồn tồn tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan Cần có nghiên cứu khảo sát quy mơ lơ chuột có ý nghĩa thống kê) mức liều sử dụng để xác định xác tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế gan mẫu thử TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Phạm Tuấn Anh 2014 , Định lƣợng saponin toàn phần Giảo cổ lam ằng phƣơng pháp đo quang , ạp ch c h c ố 243 Phạm Thị Vân Anh , Nguyễn Trọng Thông, Phạm Thiện Ngọc (2007), "Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa cao nhàu hai mơ hình gây tổn thƣơng gan chuột nhắt trắng cacbon tetrachlorid (CCl4) paracetamol", Tạp ch c h c (số 4), tr 22-25 Phạm Tuấn Anh (2008), "Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Giảo cổ lam thu hái Sapa", Luận văn hạc sỹ c h crường Đại h c c Hà Nội Bộ môn Thực vật (2004), Thực vật dư c phân loại thực vật Bộ mơn Tốn Tin (2010), Xác suất thống kê tr 70-71 Bộ Y tế (2009), c điển Việt Nam IV NXB Y học Vũ Đức Cảnh (1999), "Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Cucurbitaceae", khóa luận tốt nghiệp c sỹ Đại h c - rường Đại h c c Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam Vol 2, tr 308-309 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thực vật thông dụng Vol 2, tr 1322, 1323 10 Nguyễn Tiến Dẫn "Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Thất diệp đởm", Luận văn hạc sỹ c h c- rường Đại h c c Hà Nội 11 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa h c thuốc tr 243-289, 327-347, NXB Y học 12 Nguyễn Thị Thanh Duyên (2000), "Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Thất diệp đởm", Khóa luận tốt nghiệp c sỹ Đại h c - rường Đại h c c Hà Nội 13 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam Vol Quyển I, tr 563 -575, NXB Trẻ 14 Phạm Thanh Hƣơng (2003), "Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Giảo cổ lam", Khóa luận tốt nghiệp c sỹ Đại h c rường Đại h c c Hà Nội 15 Phạm Thanh Kỳ, Phan Thị Phi, Phan Thị Thu Anh (2007), "Nghiên cứu tác dụng tăng đáp ứng miễn dịch Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino)", Tạp ch thông tin Y c (5) 16 Thân Thị Kiều My (2010), "Tiếp tục nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng sinh học dƣợc liệu Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino- Cucurbitaceae", Luận văn hạc sỹ c h c- rường Đại h c c Hà Nội 17 Trịnh Thị Diệp Thanh (2013), "Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng saponin Giảo cổ lam phƣơng pháp đo quang , Luận văn c sỹ - rường Đại h c c Hà Nội 18 Phan Thị Thảo (2010), "Nghiên cứu đặc điểm vi học thành phần hóa học Giảo cổ lam thu hái Hịa Bình", Khóa luận tốt nghiệp c sỹ Đại h c - rường Đại h c c Hà Nội 19 Phạm Thái Hà Văn (2013), "Nghiên cứu số tác dụng xây dựng tiêu chuẩn cao đặc thuốc Kỳ phụ vƣơng theo hƣớng cải thiện tuần hoàn não", Luận văn hạc sỹ c h c- rường Đại h c c Hà Nội TIẾNG ANH 20 Han M.Q Liu J.X, Gao.H (1995), "Effect of 24 Chinese medicinal herbs on nucleic acid, protein and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell", Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 15(3), pp 147-149 21 Pham Thanh Ky, Pham Thanh Huong, Than Thi Kieu My, Pham Tuan Anh (2010), "Dammarane-type saponins from Gynostemma pentaphyllum", Phytochemistry, 71(8–9), pp 994-1001 22 Naumovski Razmovski (2005), "Chemistry and pharmacology Gynostemma pentaphyllum", Phytochemistry review, 4(pp 197-219 23 Wang C Wang X, Li Y, Deng S, Jiang Y, Yue L (1995), " A preliminary observation of preventive and esophageal cancer in rats", Hua Xi Yi Da Xue Xue Bao, 26(4), pp 430-432 24 Z Zhou (1996), "The effect of Gynostemma pentaphyllum mak (GP) on carcinogenesis of the golden hamster cheek pouch induced by DMBA", Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, 31(5), pp 267-270 25 Guwrksel senner Hale Z Tklu (2006), "Protective effects of resveratral against acetaminophen induced toxicity in mice", Hepatology Research 35(pp 62-68 26 J Imlay (2003), "Pathways of oxidative damage", Annu Rev Microbiol 57, 395-418 27 JC Chen (1999), "Therapeutic effect of gypenoside on chronic liver injury and fibrosis induced by CCl4 in rats", Am J Chin Med, 28(2), pp 175-185 of 28 Kuwahara M Kawanishi F, Komiya T & Oshio H (1989), "Dammarane saponins of Gynostemma pentaphyllum Makino anh isolation of malonylginsenosides-Rb1, -Rd, and malonyl gypenoside", Chem Pharmaceut Bull, 37(1), pp 135-139 29 Lam Hoang Van , On Tran Van (2009), "Biodiversity of the genus Gynostemma in the north of Viet Nam", Pharma Indochina VI, pp 83-88 30 Li-Sheng Wang Zou Jie-ming, GUO Ya-jian (2004), "D101 macroporous resin purification of total saponins of bitter figwort", Chinese herbal medicine, 35(pp 515 31 Li L Jiao L, Lau B.H (1993), "Protective effect of gypenosides against oxidative stress in phagocytes, vascular endothelial cells and liver microsomes", Cancer Biother, 8(3), pp 263-272 32 Lin J.M Lin C.C (1993), "Evaluation of the anti inflammatory and liver protective effects of anoectochilus formosanus, ganoderma lucidum and gynostemma pentaphyllum in rats", Am J Chin Med, 21(1), pp 59-69 33 Lin J.M Lin C.C et al (2000), "Antioxidant and hepatoprotective effects of Anoectochilus formosanus and Gynostemma pentaphyllum", Am J Chin Med, 28(1), pp 87-96 34 Liu Xin, Ye Wencai, Mo Ziyao, Yu Biao et al (2004), "Five New Ocotillone-Type Saponins from Gynostemma p entaphyllum", Journal of natural products, 67(7), pp 1147-1151 35 Liu Z., Wang J., Gao W., Man S et al (2013), "Preparative separation and purification of steroidal saponins in Paris polyphylla var yunnanensis by macroporous adsorption resins", Pharm Biol, 51(7), pp 899-905 36 Ma Yuan-Chun, Zhu Jin, Benkrima Laila, Luo Mai et al (1996), "A comparative evaluation of ginsenosides in commercial ginseng products and tissue culture samples using HPLC", Journal of herbs, spices & medicinal plants, 3(4), pp 41-50 37 Mackay M Wei JX & Chen YG (1991), "Structure of a new dammarannetype triterpene from Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino", Acta Crystallogr Sec C: Crystal Struct Commun, 47(pp 790-793 38 Quin Z Zhao L, Bi S and You L (1992), "Saponin constituents anh resource of Gynostemma pentaphyllum", Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa, 4(1), pp 83-98 39 Razmovski-naumovski V Duke Rk, Turner P & Duke CC (2005), "2a; 3b; 12b- Trihydroxydammar-24-ene 20-O-b-D-glucopyranoside (Gynosaponin TN1) as the 2,5-methanol solvate", Acta Crystallogr Sec.E, 61(5), pp 12391241 40 Stefan U Ruepp Robert P Tonge and al (2002), "Genomics and proteomics analysisof acetaminophen toxicity in mouse liver", Toxicolgical sciences 65(pp 135-150 41 Sumioka I Matsura T and Yamada K (2004), "Acetaminophen - induced hepatotoxicity: Still an important insue", Yonago Acta medica, 47(pp 17-28 42 Takemoto T Arihara S, Nakajima T& Okuhira M (1983), "Studies on the constituents of Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino I Structures of Gypennoside I-XIV", Yakugaku Zasshi 103(2), pp 173-185 43 University China Pharmaceutical (1996), Encyclopedia of Chinese Herbs Vol 2, pp 1878-1882, Science and Technology publisher, China 44 WU Xiang-yang, HOU Hui-rong, YANG Liu-qing, QI Xue-yong et al (2007), "Isolation and purification of total saponins in Gymnema sylvestre by adsorption resin [J]", Journal of Jiangsu University (Natural Science Edition), 5(pp 018 45 Wu Zheng Yi Peter H Raven, Hong Deyuan (2008), Flora of China Vol Vol.19 Science Press, China 46 Yoshikawa Kazuko, Arihara Shigenobu, Matsuura Kouji, Miyaset Toshio (1992), "Dammarane saponins fromGymnema sylvestre", Phytochemistry, 31(1), pp 237-241 47 Zhang Chongxi ZHENG Lan, Chun-hong, et al (2003), "Macroporous resin adsorption process and regeneration of ginsenosides used in this study", Chinese Pharmaceutical Journal, 9(pp 661 ... tơi nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất tiêu chuẩn cao gypenosid GCL lá; từ đánh giá tác dụng chống oxy bảo vệ gan saponin giảo cổ lam theo đề tài: ? ?Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn nghiên cứu tác. ..BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ MAI PHƢƠNG XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO GIẢO CỔ LAM LÁ (GYNOSTEMMA LONGIPES) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng... tác dụng bảo vệ gan cao Giảo cổ lam Gynostemma longipes” với mục tiêu chính: - Xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế cao gypenosid GCL - iểm nghiệm đƣa dự thảo tiêu chuẩn cao gypenosid GCL - Nghiên