Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng và đánh giá một số tác dụng sinh học của cao lỏng từ bài thuốc vĩ ngân

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU TRANG XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO LỎNG TỪ BÀI THUỐC VĨ NGÂN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2014 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU TRANG XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO LỎNG TỪ BÀI THUỐC VĨ NGÂN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 Người hướng dẫn khoa học : TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Bùi Hồng Cường, người thầy tận tình hướng dẫn động viên tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn TS Phạm Thị Vân Anh – Trưởng Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Y Hà Nội kỹ thuật viên Bộ môn nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình làm thực nghiệm Tôi xin cảm ơn PGS.TS Cao Văn Thu – Trưởng môn Vi sinh, sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội, TS Lê Minh Hà – Phịng hóa dược, Viện hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện khoa học công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô cán Bộ môn Dược học cổ truyền bảo giúp đỡ thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu để hồn thành đề tài Hà Nội, tháng năm 2014 Dược sĩ Nguyễn Thị Thu Trang MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý bệnh viêm họng 1.2 Cao lỏng Vĩ Ngân 1.2.1 Bài thuốc Vĩ Ngân 1.2.2 Thông tin vị thuốc 1.2.2.1 Kim ngân hoa 1.2.2.2 Xạ can 1.2.2.3 Bạc hà 1.2.2.4 Húng chanh 1.2.2.5 Núc nác 1.2.2.6 Cam thảo 10 1.2.2.7 Cát cánh 12 1.2.2.8 Bàng đại hải (Lười ươi) 13 1.2.2.9 Huyền sâm 13 1.2.2.10 Mạch môn 14 1.2.2.11 Thiên môn 15 1.2.2.12 Sinh địa 16 1.2.3 Bào chế cao lỏng Vĩ Ngân 17 1.2.4 Cơ sở thiết kế thuốc Vĩ Ngân 18 1.3 Thông tin Tectoridin Tectorigenin 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN 23 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng 23 2.2 Phương tiện 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Khảo sát số tiêu chung cao lỏng 24 2.3.2 Nghiên cứu hóa học 24 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 25 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 Khảo sát số tiêu chung cao lỏng 30 3.1.4 Tỷ trọng cao thuốc 31 3.2 Nghiên cứu hóa học 32 3.2.1 Định tính nhóm chất phản ứng hóa học 32 3.2.2 Định tính so sánh cao vị thuốc sắc ký lớp mỏng 38 3.2.2.1 Kim ngân hoa 38 3.2.2.2 Cam thảo 40 3.2.2.3 Xạ can 41 3.2.2.4 Núc nác 43 3.2.2.5 Huyền sâm 44 3.2.2.6 Cát cánh, Thiên môn, Mạch môn 46 3.2.3 Định lượng Tectoridin Tectorigenin cao lỏng Vĩ Ngân 48 3.3 Đánh giá số tác dụng sinh học cao lỏng Vĩ Ngân 54 3.3.1 Đánh giá độc tính cấp 54 3.3.2 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp 55 3.3.3 Đánh giá tác dụng giảm ho 60 3.3.4 Đánh giá tác dụng long đờm 62 3.4 Bàn luận 64 3.4.1 Về dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao lỏng Vĩ Ngân 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 KẾT LUẬN 72 KIẾN NGHỊ 74 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABS Mật độ quang NN Núc nác ACN Acetonitril PGE2 Prostaglandin E2 CC Cát cánh SD Độ lệch chuẩn CT Cam thảo SĐ Sinh địa COX-2 Cyclooxygenase SE Sai số chuẩn dd Dung dịch SKĐ Sắc ký đồ DĐVN Dược điển Việt Nam SKLM Sắc ký lớp mỏng EtOAc Ethylacetat TĐ Tương đương EtOH Ethanol TM Thiên môn HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao TT Thuốc thử HS Huyền sâm VSV Vi sinh vật KNH Kim ngân hoa XC Xạ can MeOH Methanol MM Mạch mơn Trung bình YHCT Y học cổ truyền DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Bảng 3.20 Bảng 3.21 Bảng 3.22 Bảng 3.23 Bảng 3.24 Bảng 3.25 Kết xác định khối lượng làm khô Kết xác định hàm lượng chất chiết EtOH 70% Kết định tính nhóm chất cao lỏng dược liệu Kết phân tích SKĐ cao KNH bước sóng 366 nm Kết phân tích SKĐ cao CT bước sóng 254 nm Kết phân tích SKĐ cao XC sau phun thuốc thử Kết phân tích SKĐ cao NN bước sóng 254 nm Kết phân tích SKĐ cao HS sau màu Kết phân tích SKĐ cao CC, TM, MM sau màu Độ lặp lại thời gian lưu tectoridin tectorigenin Độ lặp lại diện tích pic tectoridin tectorigenin Độ phương pháp định lượng tectoridin tectorigenin Độ thu hồi phương pháp định lượng tectoridin tectorigenin Kết khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp định lượng Kết định lượng tectoridin tectorigenin cao Vĩ Ngân Ảnh hưởng cao Vĩ Ngân đến tỷ lệ chuột chết dấu hiệu độc tính cấp theo đường uống Kết thử hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm cao Vĩ Ngân Ảnh hưởng cao lỏng Vĩ Ngân lên khả ức chế phù chân chuột thời điểm khác Ảnh hưởng cao lỏng Vĩ Ngân lên thể tích dịch rỉ viêm Ảnh hưởng cao lỏng Vĩ Ngân đến số lượng bạch cầu dịch rỉ viêm Ảnh hưởng cao lỏng Vĩ Ngân đến số lượng protein dịch rỉ viêm Ảnh hưởng cao lỏng Vĩ Ngân lên thời gian tiềm tàng xuất ho Ảnh hưởng cao lỏng Vĩ Ngân lên tổng số ho Ảnh hưởng cao lỏng Vĩ Ngân lên mật độ quang Một số tiêu đề xuất dự thảo tiêu chuẩn kĩ thuật cao lỏng Vĩ Ngân Trang 27 28 34 36 38 39 41 42 44 47 48 48 49 49 51 52 55 56 58 59 60 62 63 65 69 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 2.1 Sơ đồ qui trình bào chế cao lỏng Vĩ Ngân 18 Hình 3.1 Sắc ký đồ cao-KNH bước sóng 366 nm 36 Hình 3.2 Sắc ký đồ cao-CT bước sóng 254 nm 38 Hình 3.3 Sắc ký đồ cao-XC sau màu 39 Hình 3.4 Sắc ký đồ cao-NN bước sóng 254 nm 41 Hình 3.5 Sắc ký đồ cao-HS sau màu 42 Hình 3.6 Sắc ký đồ CC- cao- TM- MM sau màu 44 Hình 3.7 Sắc ký đồ tectoridin chuẩn cao tổng Vĩ Ngân 46 bước sóng 330nm Hình 3.8 Sắc ký đồ tectorigenin chuẩn cao tổng Vĩ Ngân 47 bước sóng 263nm Hình 3.9 Đồ thị xác định khoảng tuyến tính tectoridin 50 Hình 3.10 Đồ thị xác định khoảng tuyến tính tectorigenin 50 Hình 3.11 Biểu đồ biểu thị độ phù chân chuột 56 thời điểm nghiên cứu Hình 3.12 Biểu đồ biểu thị thể tích dịch rỉ viêm 58 Hình 3.13 Biểu đồ biểu thị số lượng bạch cầu dịch rỉ viêm 59 Hình 3.14 Biểu đồ biểu thị hàm lượng protein dịch rỉ viêm 60 Hình 3.15 Biểu đồ biểu thị thời gian tiềm tàng xuất ho chuột 62 Hình 3.16 Biểu đồ biểu thị tổng số ho chuột 63 Hình 3.17 Biểu đồ biểu thị mật độ quang bước sóng 265 nm 65 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm họng bệnh lý viêm nhiễm thường gặp, xảy lứa tuổi, không phân biệt giới tính Bệnh tái phát nhiều lần Nguyên nhân thường nhiễm trùng (virus, vi khuẩn) nguyên khác dị ứng, chấn thương, hóa chất, nhiễm mơi trường…Bệnh đặc trưng triệu chứng niêm mạc họng sưng, nóng, đỏ, đau, thường xuất kèm theo tăng tiết đờm, ho Mục đích điều trị chủ yếu sử dụng thuốc làm giảm triệu chứng giảm đau, chống viêm, giảm ho, long đờm…kết hợp sử dụng thuốc kháng sinh để phòng ngừa điều trị có bội nhiễm Các thuốc sử dụng điều trị viêm họng thị trường phần nhiều thuốc tân dược, đặt nhiều vấn đề bất cập như: tình trạng lạm dụng dẫn tới kháng thuốc kháng sinh, tác dụng phụ thuốc gây độc với gan, thận, rối loạn tiêu hóa, viêm loét dày…Do vậy, việc nghiên cứu cho đời chế phẩm đông dược, sử dụng điều trị triệu chứng viêm họng, hạn chế tác dụng phụ thuốc có ý nghĩa quan trọng, mang lại lợi ích thiết thực cho người bệnh Dựa kinh nghiệm sử dụng thuốc y học cổ truyền tác dụng dược lý nghiên cứu dược liệu, Công ty Dược phẩm Hoa Linh xây dựng phương thuốc Vĩ Ngân dùng chữa viêm họng, họng sưng đau, ho rát họng, nhiều đờm…và bào chế dạng cao lỏng Vĩ Ngân Nhằm tiêu chuẩn hóa đánh giá số tác dụng sinh học cao lỏng Vĩ Ngân, đề tài “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng đánh giá số tác dụng sinh học cao lỏng từ thuốc Vĩ Ngân” thực với mục tiêu cụ thể sau: Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao lỏng Vĩ Ngân Thử độc tính cấp tác dụng: Chống viêm cấp, giảm ho, long đờm cao lỏng Vĩ Ngân CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý bệnh viêm họng Theo quan điểm Y học đại: - Viêm họng tình trạng viêm nhiễm niêm mạc họng, có nhiều ngun nhân chủ yếu virus vi khuẩn gây viêm vùng lân cận viêm mũi, viêm xoang mặt làm dịch tiết chảy xuống họng hay vi khuẩn gây sâu lan đến họng Ngoài ra, việc tiếp xúc với khói bụi, hóa chất thời gian dài, hút thuốc lá, uống rượu, thay đổi thời tiết… gây tổn thương niêm mạc họng, làm họng chức bảo vệ - Phân loại: + Viêm họng cấp: viêm cấp tính niêm mạc họng, nguyên nhân virus vi khuẩn (thường bội nhiễm sau nhiễm virus) với triệu chứng: đau họng kèm theo cảm giác nóng rát, họng đỏ, nuốt đau, sốt cao, mệt mỏi,… + Viêm họng mạn: tình trạng viêm họng kéo dài, ảnh hưởng nghẹt, tắc mũi, phải thở miệng, mùa lạnh; viêm xoang, viêm amidan mạn; hút thuốc lá, uống rượu, tiếp xúc nhiều với hóa chất, khói bụi; địa: dị ứng, đái tháo đường, suy gan…với triệu chứng: cảm giác họng khơ, nóng, rát; ngứa họng, vướng họng tăng lên nuốt, có nhầy qnh, thường bị ho vào ban đêm, lạnh [19], [30], [36] Theo quan điểm y học cổ truyền (YHCT): - Hầu đảm nhiệm chức hít thở thuộc phế, họng cửa đường vị, cửa ngõ tạng Viêm họng khí nhiệt gây đờm kết, chứng bệnh sưng, nóng, đỏ, đau gọi hầu tý [34] - Nguyên nhân: Ngoại tà xâm nhập, ăn uống không điều độ, tình chí bị tổn thương, phủ tạng điều hịa… [9], nhiệt độc phế vị xơng lên nhiễm khí độc dịch lệ, tổn thương phế âm [4] - Viêm họng có thể: cấp tính mạn tính Viêm họng cấp tính cảm phải phong tà bên kết hợp với đàm nhiệt bên thể mà gây bệnh; viêm họng mạn tính đàm nhiệt lâu ngày làm tổn thương phế âm mà gây bệnh Lô 2: Chứng dương (Codein phosphate 20mg/kg) STT Trọng lượng (g) Thời gian tiềm tàng (s) Số ho p 2-1 20.5 26 50 33 47 33.5 42.5 36 42 34.90 2ph 3ph 4ph 5ph 6ph 7ph 8ph 9ph 10ph Tổng 530 120 184 247 69 305 225 160 194 226.00 44.43 0 0 0 0 0.00 0 0 0 0.60 0 0 0.60 1.10 0 1.00 2 1.30 1 1 1.20 0 0.90 2 0 1.10 1 0 0 0.60 0.045 TB SE 1ph 0.331 0.343 0.053 0.076 0.059 0.067 0.029 0.019 0.066 0.001 13 38 9.33 3.75 0.011 Lô 3: Cao lỏng Vĩ Ngân liều thấp (63,36g dược liệu/kg) 10 TB 30.5 32 33 26.5 31 29 32.5 22 34 35 Thời gian tiềm tàng (s) 162 565 135 90 170 120 475 470 45 172 30.55 STT 240.40 Trọng lượng (g) Số ho 1ph 2ph 3ph 4ph 5ph 6ph 7ph 8ph 9ph 10ph Tổng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 1 0 3 3 1 2 0 3 0 21 17 34 18 1 21 18 0.10 0.10 1.20 1.20 2.30 2.30 1.90 1.60 1.50 2.10 14.30 SE p 3-1 59.19 0.081 0.422 0.065 0.273 0.087 0.630 0.321 0.116 0.060 0.122 0.057 3.34 0.033 p 3-2 0.851 0.331 0.339 0.296 0.886 0.111 0.285 0.412 0.303 0.553 0.024 0.335 Lô 4: Cao lỏng Vĩ Ngân liều cao (190,08g dược liệu/kg) TB 42 19.5 33 43 36.5 29.5 22 23.5 42 33.20 STT Thời gian tiềm tàng (s) 241 470 116 269 530 51 140 135 468 268.89 Trọng lượng (g) Số ho 1ph 2ph 3ph 4ph 5ph 6ph 7ph 8ph 9ph 10ph Tổng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2 0 2 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 32 12 2 0.00 0.20 0.70 0.30 1.10 0.90 0.90 0.60 0.90 0.70 SE p 4-1 59.45 0.030 0.331 0.089 3.39 0.070 0.004 0.104 0.024 0.013 0.006 0.037 0.002 0.005 p 4-2 0.571 #DIV/0! 0.449 0.861 0.190 0.894 0.594 0.699 0.593 0.761 0.806 0.650 p 4-3 0.739 0.331 0.556 0.379 0.122 0.193 0.101 0.220 0.052 0.323 0.048 0.144 PHỤ LỤC Kết đánh giá tác dụng long đờm chuột nhắt trắng STT 10 SE p so chứng Lô Chứng sinh học ABS 0.334 0.410 0.531 0.470 0.358 0.503 0.548 0.321 0.176 0.406 Lô Chứng dương ABS 0.404 0.555 0.521 0.506 0.489 0.565 0.468 0.570 0.677 0.528 Lô Cao lỏng Vĩ Ngân liều thấp (63,36g dược liệu/kg) ABS 0.395 0.609 0.337 0.492 0.517 0.583 0.374 0.463 0.256 0.447 Lô Cao lỏng Vĩ Ngân liều cao (190,08g dược liệu/kg) ABS 0.630 0.672 0.749 0.611 0.667 0.614 0.640 0.731 0.654 0.667 0.406 0.036 0.528 0.023 0.447 0.035 0.664 0.015 0.0101 0.448 2.22523E-05 PHỤ LỤC DỰ THẢO TIÊU CHUẨN KĨ THUẬT CỦA CAO LỎNG VĨ NGÂN Cao lỏng Vĩ Ngân bào chế từ thuốc Vĩ Ngân cách chiết với nước ethanol 70%, cô đến đậm độ định, thu cao lỏng 5/1 I YÊU CẦU KỸ THUẬT Công thức điều chế 100ml cao lỏng: Kim ngân hoa (Flos Lonicerae) 56,8g Xạ can (Rhizoma Belamcandae) 68,2g Bạc hà (Herba Menthae) 56,8g Húng chanh (Folium Coleus) 45,5g Núc nác (Cortex Oroxyli) 45,5g Cát cánh (Radix Platycodi grandiflori) 22,7g Bàng đại hải (Semen Scaphii) 22,7g Huyền sâm (Radix Scrophulariae) 45,5g Mạch môn (Radix Ophiopogonis) 22,7g Thiên môn (Radix Asparagi) 22,7g Sinh địa (Radix Rhemanniae glutinosae) 45,5g Cam thảo (Radix Glycyrrhizae) 45,5g a) Hình thức, cảm quan - Thể chất, màu sắc, mùi vị: Là chất lỏng sánh, khơng có váng mốc, khơng có cặn bã dược liệu vật lạ, màu nâu đen, có vị đắng, mùi thơm đặc trưng dược liệu - Độ đồng nhất: Cao thuốc đồng nhất, khơng có kết tủa, khơng phân lớp - Độ tan: Cao tan hồn tồn nước b) Mất khối lượng làm khô: Không 46% c) Xác định chất chiết ethanol 70% cao thuốc: Không 58% d) Tỷ trọng cao thuốc: Ở 20°C, từ 1,180 – 1,181 e) Định tính nhóm chất hữu phản ứng hóa học: Cao lỏng phải thể phép thử dương tính nhóm chất: flavonoid, saponin f) Định tính có mặt vị thuốc sắc ký lớp mỏng: Cao lỏng phải thể có mặt vị thuốc: Kim ngân hoa, Xạ can, Cam thảo, Núc nác, Huyền sâm, Cát cánh, Thiên môn, Mạch môn g) Định lượng: Cao lỏng phải chứa không 0,2% tectoridin không 0,02% tectorigenin II PHƯƠNG PHÁP THỬ Hình thức, cảm quan (Theo phụ lục 1.1 – DĐVN IV) - Thể chất, màu sắc, mùi vị: Là chất lỏng sánh, khơng có váng mốc, khơng có cặn bã dược liệu vật lạ, màu nâu đen, có vị đắng, mùi thơm đặc trưng dược liệu - Độ đồng nhất: Lấy cao, dàn lam kính, đặt lamen ép sát Quan sát kính hiển vi, nhận thấy cao thuốc đồng nhất, khơng có kết tủa, khơng phân lớp - Độ tan: Lấy 1g cao, hòa với 25ml nước, cao tan hoàn toàn Xác định hàm lượng nước cao thuốc (Theo phụ lục 9.6 – DĐVN IV) Cân xác khoảng 1,0000g cao thuốc, cho vào chén sứ (đã cân bì) Đun cách thủy đến cắn khơ Sấy 105°C đến khối lượng không đổi (chênh lệch lần cân khơng q 0,5mg) Cho vào bình hút ẩm, làm nguội tới nhiệt độ phòng, cân Làm lần, tính kết trung bình Hàm lượng nước cao thuốc tính theo cơng thức: M-m X(%)= 100% M Trong đó: X: Hàm lượng nước cao thuốc (%) M: Khối lượng cao trước làm khô (g) m: Khối lượng cao sau khi làm khô (g) Xác định chất chiết ethanol 70% cao thuốc (Theo phương pháp chiết nguội, Phụ lục 12.10 – DĐVN IV) - Cân xác khoảng 4,0000g cao thuốc, cho vào bình nón nút mài 250ml - Thêm xác 100,0 ml EtOH 70%, đậy kín, ngâm lạnh, lắc đầu Sau để yên 18 Lọc qua phễu lọc khơ vào bình hứng khơ thích hợp Lấy xác 20ml dịch lọc, cho vào cốc thủy tinh cân bì trước, cách thủy đến cắn khô Sấy cắn 105°C Lấy để nguội bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau sấy tính % chất chiết dịch lọc theo cơng thức: A(%) = 5m.104 M(100-X) Trong đó, A: Hàm lượng chất chiết EtOH 70% m: Khối lượng cắn 20ml dịch lọc (g) M: Khối lượng cao thuốc (g) X: Hàm lượng nước cao thuốc (%) Tỷ trọng cao thuốc (Theo phương pháp dùng tỷ trọng kế, phụ lục 6.5 – DĐVN IV) Lau tỷ trọng kế ethanol ether Cho cao thuốc vào cốc thủy tinh Dùng đũa thủy tinh trộn cao thuốc Đặt nhẹ nhàng tỷ trọng kế vào cao thuốc cho tỷ trọng kế không chạm vào thành đáy cốc Chỉnh nhiệt độ tới 20°C Khi tỷ trọng kế ổn định, đọc kết theo vòng khum mức chất lỏng Định tính nhóm chất phản ứng hóa học 5.1 Định tính Flavonoid * Chiết xuất: Lấy 0,5g cao lỏng, thêm 10 ml EtOH 90% Đun cách thủy lắc kĩ cho tan, lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc thu dùng để tiến hành phản ứng định tính - Phản ứng Cyanidin Cho vào ống nghiệm nhỏ ml dung dịch thử Thêm bột magnesi kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ giọt HCl đặc (3 – giọt) Để yên vài phút Kết quả: Dung dịch có màu đỏ thẫm - Phản ứng với kiềm loãng Cho vào ống nghiệm nhỏ ml dung dịch thử Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Kết quả: Xuất tủa vàng - Phản ứng với amoniac Nhỏ giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô để lên miệng lọ amoniac đặc mở nút Nhỏ giọt khác làm chứng Kết quả: Vết dịch chiết chuyển màu vàng đậm - Phản ứng với FeCl3 Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dung dịch thử Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Kết quả: Xuất tủa màu xanh đen - Phản ứng diazo hóa Cho ml dung dịch thử vào ống nghiệm, kiềm hóa dung dịch NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazo pha, lắc đều, đun nóng nhẹ Kết quả: Xuất kết tủa màu đỏ cam 5.2 Định tính Saponin - Quan sát tượng tạo bọt: Lấy 0,1g cao lỏng cho vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước, đun nóng nhẹ, lắc mạnh – phút, để yên Kết quả: Xuất cột bọt cao 2-3 cm, bền vững 15 phút Phản ứng Salkowski - + Lấy 0,5 g cao lỏng, cô tạo cắn, thêm từ từ ml dung dịch H2SO4 đặc Kết quả: Xuất màu đỏ đậm - Phản ứng Liebermann – Burchard Lấy 1-2 ml cao lỏng, cô tạo cắn, thêm vào ml anhydrid acetic, lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ giọt H2SO4 đặc Kết quả: Xuất vòng màu đỏ tía mặt phân cách Định tính có mặt vị thuốc cao thuốc SKLM 6.1 Kim ngân hoa Chuẩn bị - Bản mỏng: Silica gel 60 F254, 4x10 cm, hoạt hóa 1100 C 60 phút - Dung môi khai triển: Toluen – chloroform – aceton - acid formic (8:5:7:0,2) Chiết xuất - Dung dịch thử: Lấy 5g cao lỏng, thêm 30ml methanol, đun cách thủy 15 phút, lọc Chiết thêm lần Gộp dịch chiết methanol, cô cách thủy đến cạn Khuấy kỹ cắn với n – butanol lần, lần 10 ml Gộp dịch chiết butanol, cách thủy đến cạn Hịa tan cắn 1ml methanol dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch đối chiếu: Lấy g kim ngân hoa tán nhỏ vào bình nón, đậy nắp, thêm 20ml methanol, đun cách thủy 20 phút, lọc, cô dịch lọc đến cắn Làm tương tự dung dịch thử “ khuấy kỹ cắn….sắc ký” Tiến hành Chấm riêng biệt lên mỏng l dung dịch thử µl dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, quan sát vết đèn UV bước sóng 366 nm Kết Sắc ký đồ cao lỏng kim ngân hoa bước sóng 366 nm có vết tương đương: Rf = 0,08; 0,25; 0,28; 0,32; 0,59 , vết có màu xanh 6.2 Xạ can Chuẩn bị - Bản mỏng Silica gel 60 F254 , 4x10 cm, hoạt hóa 1100 C 60 phút - Dung môi triển khai: Toluen – ethylacetat – acid formic (5:6:1,5) - Thuốc thử màu: Dung dịch KOH 5%/ EtOH 96% Chiết xuất - Dung dịch thử: Lấy 5g cao lỏng, thêm 60ml nước, đun nóng nhẹ, lắc kỹ cho tan, để nguội, lọc Lắc với ethyl acetat lần, lần 20ml Gộp dịch chiết ethyl acetat, cách thủy đến cạn Hịa tan cắn 1ml ethanol 96% dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch đối chiếu: Lấy g xạ can tán nhỏ, thêm 40ml nước, đun sôi nhẹ 20 phút, để nguội, lọc Làm tương tự với dung dịch thử, “Lắc với ethyl acetat … đến sắc ký” Tiến hành Chấm riêng biệt lên mỏng l dung dịch thử µl dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, phun thuốc thử màu, sấy 1200 C, quan sát ánh sáng thường Kết Sắc ký đồ cao lỏng xạ can sau phun thuốc thử có vết tương đương: Rf= 0,55 (tím nhạt), Rf= 0,64 (nâu nhạt) 6.3 Cam thảo Chuẩn bị - Bản mỏng: Silica gel 60 F254, 4x10 cm, hoạt hóa 1100 C 60 phút - Dung mơi khai triển: Ethyl acetat – acid acetic băng – acid formic – nước (15:1:1:2) Chiết xuất - Dung dịch thử: Lấy g cao lỏng, thêm 20ml nước, đun nóng nhẹ lắc kĩ cho tan Để nguội, chiết 20ml n – butanol, gạn lấy lớp dịch chiết n – butanol cô thu hồi dung môi đến cắn Hòa tan cắn vào 1ml methanol dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch đối chiếu: Lấy 1g bột cam thảo, thêm 40ml ether, đun hồi lưu cách thủy giờ, bỏ dịch chiết ether Thêm 30ml methanol vào phần bã cam thảo, đun hồi lưu cách thủy giờ, lọc, bốc dịch lọc đến khô, hòa tan cắn 1ml methanol dung dịch chấm sắc ký Tiến hành Chấm riêng biệt lên mỏng l dung dịch thử l dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, quan sát đèn tử ngoại bước sóng 254 nm Kết Sắc ký đồ cao lỏng cam thảo bước sóng 254 nm có vết tương đương: Rf= 0,20; 0,28; 0,48, vết có màu đen 6.4 Núc nác Chuẩn bị - Bản mỏng: Silica gel 60 F254 , 4x10 cm, hoạt hóa 1100 C 60 phút - Dung môi khai triển: Chloroform - Ethylacetat – acid formic (2:2:1) Chiết xuất - Dung dịch thử: Lấy 5g cao lỏng, thêm 60ml methanol, đun cách thủy 15 phút, lọc Chiết thêm lần Gộp dịch chiết methanol, cô cách thủy đến cạn Khuấy kỹ cắn với n – butanol lần, lần 20 ml Gộp dịch chiết butanol, cô cách thủy đến cạn Hòa tan cắn 1ml methanol dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch đối chiếu: Lấy 4g núc nác tán nhỏ, thêm 20 ml EtOH 70%, ngâm lạnh, lọc, cô dịch chiết đến cắn, hòa tan cắn với 1ml methanol dung dịch chấm sắc ký Tiến hành Chấm riêng biệt lên mỏng 4l dung dịch thử 6µl dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, quan sát vết đèn UV bước sóng 254 nm Kết Sắc ký đồ cao lỏng núc nác bước sóng 254 nm có vết tương đương: Rf= 0,13; 0,25; 0,75, vết có màu đen 6.5 Huyền sâm Chuẩn bị - Bản mỏng Silica gel 60 F254 , 4x10 cm, hoạt hóa 1100 C 60 phút - Dung môi triển khai: Chloroform – methanol - acid formic (9:1: 0,2) - Thuốc thử màu: Thuốc thử vanilin sulfuric (100 ml Vanillin 1% /EtOH 96%+ ml dung dịch H2SO4 đặc) Chiết xuất - Dung dịch thử: Lấy 5g cao lỏng vào bình nón, thêm 60ml methanol, đậy nắp kín, đun cách thủy 15 phút, lọc Chiết lần Gộp dịch chiết methanol, cô cách thủy đến cạn Khuấy kỹ cắn với n – butanol lần, lần 20ml, khuấy phút Gộp dịch chiết butanol, cô cách thủy đến cắn Hoà tan cắn 1ml ethanol 96% dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch đối chiếu: Lấy 1g huyền sâm cắt nhỏ, thêm 20ml butanol, đun sôi hồi lưu giờ, để nguội, lọc Cô dịch lọc cách thủy đến cạn Hòa cắn 1ml ethanol 96% dung dịch chấm sắc ký Tiến hành Chấm riêng biệt lên mỏng 6l dung dịch thử dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc kí, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phòng; phun thuốc thử màu, sấy 1200C rõ vết Kết Sắc ký đồ cao lỏng huyền sâm sau phun thuốc thử có vết tương đương: Rf= 0,05 (đen); 0,09 (đen) ; 0,18 (xanh lá); 0,36 (nâu); 0,42 (xanh lá); 0,68 (hồng) 6.6 Cát cánh, Thiên môn, Mạch môn Chuẩn bị - Bản mỏng: Silica gel 60 F254 , 6x10 cm, hoạt hóa 1100 C 60 phút - Dung môi khai triển: Toluen – ethylacetat – acid formic (5:5:1) - Thuốc thử màu: Thuốc thử vanilin sulfuric (100 ml Vanillin 1% /EtOH 96% + ml dung dịch H2SO4 đặc) Chiết xuất: - Dung dịch thử: Lấy g cao lỏng, thêm 10ml methanol, đun hồi lưu cách thủy 20 phút, lọc lấy dịch chiết, thủy phân dịch chiết HCl 5% khoảng giờ, chiết 5ml chloroform x lần Cô dịch chiết chloroform đến cắn, hòa tan cắn 1ml EtOH 96% thu dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch đối chiếu: Lấy g dược liệu loại, cắt nhỏ, làm tương tự với dung dịch thử, “thêm 10ml methanol… sắc ký” Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 6l dung dịch thử 5µl dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng; phun thuốc thử màu, sấy 1200 C rõ vết Kết - Sắc ký đồ cao lỏng mạch môn sau phun thuốc thử có vết tương đương: Rf= 0,25; 0,51; 0,85; 0,95 ( màu tím) - Sắc ký đồ cao lỏng cát cánh, thiên môn sau phun thuốc thử có vết tương đương: Rf= 0,25 (tím); Rf= 0,40 (xanh lá); Rf= 0,51 (tím); Rf= 0,73 (tím); Rf= 0,85 (tím); Rf= 0,95 (tím) Định lượng tectoridin: Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Xử lí nguyên liệu Cao lỏng Vĩ Ngân loại nước thiết bị cô quay áp suất giảm Tiến hành: Cân xác khoảng 10g cao lỏng Vĩ Ngân, cho vào bình cầu cân trước bì Loại nước thiết bị cô quay áp suất giảm đến thể chất cô đặc Sấy 105°C đến khối lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm, cân Tính hàm lượng cao đặc so với cao lỏng theo cơng thức: X%= m ×100 M Trong đó, m (g): Khối lượng cao lỏng M (g): Khối lượng cao đặc Chuẩn bị mẫu Mẫu chuẩn: - Lấy xác mg mẫu tectoridin (chuẩn) hòa tan vào 1ml MeOH, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45µm, dung dịch gốc tectoridin 2mg/ml - Dùng dung dịch gốc để pha dung dịch chuẩn chứa tectoridin với nồng độ 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5 µg/ml Mẫu thử: Cao Vĩ Ngân: Cân xác 5mg cao đặc Vĩ Ngân, pha 1ml MeOH, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45µm Điều kiện sắc ký - Pha tĩnh: Cột HiQsil C18 (250 x 4,6mm ID; 5µm) - Tốc độ dịng: 0,6ml/phút - Thể tích tiêm: 30µl - Pha động: Acetonitril (ACN) : acid formic 0,1%, chạy gradient theo chương trình sau: Thời gian ACN (%) (phút) Acid formic Kiểu rửa giải 0,1% (%) 0-10 10-16 90-84 Gradient 10-52 16-17 84-83 Gradient 52-53 17-25 83-75 Gradient 53-80 25 75 80-110 25-28 75-72 Gradient 110-113 28-100 72-0 Gradient Đẳng dịng Bước sóng phân tích - Chọn bước sóng 330nm để phát tectoridin Xây dựng đường chuẩn Tiêm riêng biệt mẫu chuẩn, tiến hành sắc ký điều kiện nêu, ghi nhận thời gian lưu diện tích pic pic chuẩn Thiết lập đường chuẩn biểu diễn tương quan diện tích pic nồng độ chất chuẩn, theo phương trình tuyến tính: y = ax + b Trong đó, y: diện tích pic; x(µg/ml): nồng độ chất chuẩn Định lượng Tiêm dung dịch thử, ghi nhận sắc ký đồ, xác định pic có thời gian lưu với pic chuẩn Nồng độ chất dung dịch thử xác định dựa cơng thức: Ct = Trong đó, S-b a Ct (µg/ml): Nồng độ chất dung dịch thử S: Diện tích pic a, b: Hệ số phương trình tuyến tính xác định thực nghiệm Nồng độ chất cao lỏng Vĩ Ngân tính theo cơng thức: C (%) = Trong đó, Ct.X 5.103 C(%): Nồng độ chất cao lỏng Ct (µg/ml): Nồng độ chất dung dịch thử X: Hàm lượng cao đặc cao lỏng III ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN, BẢO QUẢN - Đóng gói bao bì kín - Ghi nhãn đầy đủ, quy chế - Bảo quản nơi khô ráo, nhiệt độ không 30°C, tránh ánh sáng Hà Nội, ngày………tháng……… năm Giám đốc công ty Người xây dựng tiêu chuẩn DS Nguyễn Thị Thu Trang ... đề tài ? ?Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng đánh giá số tác dụng sinh học cao lỏng từ thuốc Vĩ Ngân? ?? thực với mục tiêu cụ thể sau: Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao lỏng Vĩ Ngân Thử...BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU TRANG XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO LỎNG TỪ BÀI THUỐC VĨ NGÂN LUẬN... Linh xây dựng phương thuốc Vĩ Ngân dùng chữa viêm họng, họng sưng đau, ho rát họng, nhiều đờm? ?và bào chế dạng cao lỏng Vĩ Ngân Nhằm tiêu chuẩn hóa đánh giá số tác dụng sinh học cao lỏng Vĩ Ngân,