Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) được tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973. Đến năm 1985, tên khoa học được xác định là Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân Sâm (Araliaceae). Hiện nay, Sâm Việt Nam cũng đã được lựa chọn là cây thuốc hàng đầu trong danh mục sản phẩm quốc gia. Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng đề án: “Chương trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dược liệu trong nước và các sản phẩm từ dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030. Xây dựng hồ sơ 40 dược liệu có tiềm năng khai thác và phát triển thị trường”, trong đó cây Sâm Việt Nam được chọn đứng vị trí đầu tiên trong danh sách. Sâm Việt Nam được thế giới biết đến như là một loài Sâm mới và có giá trị cao. Hiện nay, Sâm Việt Nam được trồng tại một số vùng đặc hữu như Kon Tum và Quảng Nam. Trên thị trường Sâm Việt Nam thường bị giả mạo bởi những dược liệu khác, vì vậy việc kiểm nghiệm đánh giá chất lượng Sâm Việt Nam là cần thiết. Về mặt dược lý của Sâm Việt Nam mọc hoang có tác dụng tăng lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ, tăng cường miễn dịch...Tuy nhiên, hiện nay nguồn Sâm sử dụng trên thị trường chủ yếu là từ nguồn trồng trọt. Vì các lý do cần thiết trên tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam”. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu: 1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin chính trong Sâm Việt Nam trồng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) và phương pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC–DAD). 2. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng. 3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi - Tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi - Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI CỦA TÁC GIẢ

Tạp chí trong nước

1 Dương Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh

Đức (2015), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của saponin toàn phần

từ Sâm Việt Nam trồng trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng

carbon tetrachlorid trên chuột nhắt trắng”, Y Học TP.Hồ Chí Minh, tập

19 phụ bản của số 5, tr.143-148

2 Dương Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Vũ Huỳnh Kim

Long, Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa

in vitro của saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Y Học TP.Hồ Chí Minh, tập 19 phụ bản

của số 5, tr 157-164

3 Dương Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Lê Huỳnh Thi,

Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của cao chiết từ Sâm Việt Nam trồng trên chuột bị stress cô

lập”, Dược liệu, tập 20, số 6/2015 , tr 378-383

4 Duong Hong To Quyen, Nguyen Thai Minh Truc, Nguyen Thi Thu

Huong, Nguyen Minh Duc (2015), “Effect of cultivated Vietnamese

ginseng extract on endurance capacity in mice”, Journal of Medicinal

Materials , vol.20, No.3 pp 181-186

5 Dương Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh

Đức (2017), “Khảo sát tác dụng của các bột chiết từ Sâm Việt Nam trồng trên sự rút ngắn giấc ngủ pentobarbital gây bởi stress cô lập”,

Dược liệu, 2 (22), tr.109-113

6 Duong Hong To Quyen, Nguyen Thi Thu Huong, Nguyen Thuy

Viet Phuong, Nguyen Minh Duc (2017), “Hepatoprotective activity of cultivated Vietnamese ginseng on oxidative stress-induced liver injury

in mice”, Journal of Medicinal Materials, vol.22, No.3 pp 183-189

Tạp chí quốc tế

7 Quyen H T Duong, Phuong T V Nguyen, Huong T T Nguyen, Duc

M Nguyen (2016), “Effects of ocotillol-type saponins majonoside-R1 and vina-ginsenoside-R2 on abrogating depression and neuronal oxidative stress in socially isolated depression mouse model”,

International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol 9

(2), pp 27-32

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) được tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973

Đến năm 1985, tên khoa học được xác định là Panax vietnamensis Ha

et Grushv., họ Nhân Sâm (Araliaceae) Hiện nay, Sâm Việt Nam cũng

đã được lựa chọn là cây thuốc hàng đầu trong danh mục sản phẩm quốc gia Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng đề án: “Chương trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dược liệu trong nước và các sản phẩm từ dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến

2030 Xây dựng hồ sơ 40 dược liệu có tiềm năng khai thác và phát triển thị trường”, trong đó cây Sâm Việt Nam được chọn đứng vị trí đầu tiên trong danh sách Sâm Việt Nam được thế giới biết đến như là một loài Sâm mới và có giá trị cao Hiện nay, Sâm Việt Nam được trồng tại một số vùng đặc hữu như Kon Tum và Quảng Nam Trên thị trường Sâm Việt Nam thường bị giả mạo bởi những dược liệu khác, vì vậy việc kiểm nghiệm đánh giá chất lượng Sâm Việt Nam là cần thiết

Về mặt dược lý của Sâm Việt Nam mọc hoang có tác dụng tăng lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ, tăng cường miễn dịch Tuy nhiên, hiện nay nguồn Sâm sử dụng trên thị trường chủ yếu

là từ nguồn trồng trọt Vì các lý do cần thiết trên tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam” Đề tài được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu:

1 Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin chính trong Sâm Việt Nam trồng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) và phương pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC–DAD)

2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng

3 Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

- Tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

- Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

- Tác dụng chống stress tâm lý của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

- Tác dụng chống stress tâm lý của saponin thuộc nhóm ocotillol: Majonosid-R1, majonosid-R2, vinaginsenosid-R2

2 Tính cấp thiết của đề tài

Theo Quyết định số 787/QĐ/TTg ngày 05/6/2017 của Thủ tướng chính phủ, Sâm Việt Nam là sản phẩm thuộc chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 Cho thấy vai trò cũng như hướng phát triển của Sâm Việt Nam trong nước đang được quan tâm rất nhiều Tuy

nhiên, gần đây sự phát hiện một thứ của cây Sâm này là Panax

vietnamensis var Fuscidiscus mọc hoang tại Vân Nam thuộc Trung

Quốc, có hình thái giống Sâm Việt Nam Loài Sâm này đã được đánh giá bước đầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy trong thành phần saponin có nhóm ocotillol như Sâm Việt Nam Do

đó, vấn đề nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng (Sâm VN) là vấn đề cấp thiết, nhằm góp phần xây dựng thương hiệu quốc gia về Sâm Việt Nam

3 Những đóng góp mới của luận án

Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình nghiên cứu cho Sâm VN :

- Có nhiều nghiên cứu đã công bố phương pháp định lượng đồng thời nhiều ginsenosid trong Nhân Sâm, Sâm Tam thất, Sâm Mỹ Nhưng chủ yếu saponin thuộc nhóm protopanaxadiol, protopanaxatriol

Đề tài lần đầu tiên công bố xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 5 saponin là Ginsenosid-Rg1, Ginsenosid-Rb1, Ginsenosid-Rd, Majonosid-R2 (M-R2) và Vinaginsenosid-R2 (V-R2) bằng phương pháp HPLC-Q-TOF-MS, trong đó có 02 saponin thuộc nhóm ocotillol

là M-R2 và V-R2 chỉ có trong Sâm VN mà không có trong Nhân Sâm

- Đề tài đã xây dựng tiêu chuẩn Sâm VN với các chỉ tiêu yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển và có xây dựng thêm chỉ tiêu đánh giá như: Kim loại nặng, xác định chất chiết được trong methanol 70%, xây dựng quy trình định lượng đồng thời 05 saponin bằng phương pháp HPLC-

Q-TOF-MS là phương pháp hiện đại, nhanh, chính xác với độ tin cậy cao và được sử dụng phổ biến trên thế giới

- Đề tài lần đầu tiên công bố các kết quả đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm VN 6 tuổi có so sánh đối chiếu với Nhân Sâm trồng 6 tuổi:

+ Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng Sâm VN 6 tuổi có tác dụng tăng lực trên thử nghiệm chuột bơi kiệt sức Brekhman, tại liều 50 mg/kg Sâm VN có tác dụng tăng lực điển hình hơn Nhân Sâm (NS) Tác dụng tăng lực của Sâm VN tương đương NS trên thử nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng

+ Sâm VN có tác dụng bảo gan khỏi tác nhân gây tổn thương gan bởi CCl4, cyclophosphamid, ethanol

+ Sâm VN có tác dụng chống stress tâm lý (tác dụng giải lo âu, chống

trầm cảm, chống stress oxy hóa não trên in vivo) tương đương NS

- Đề tài lần đầu tiên đã công bố kết quả và so sánh tác dụng giải lo âu,

chống trầm cảm, chống stress oxy hóa tế bào não trên in vivo của

M-R1, M-R2 và V-R2; các saponin này giống nhau khung genin chỉ khác nhau giữa các gốc đường và nhóm chức acetyl Các saponin trên thuộc nhóm ocotillol chỉ có trong Sâm VN với hàm lượng tương đối cao mà không tìm thấy trong NS Các thực nghiệm trước đây trên Sâm VN để đánh giá tác dụng chống trầm cảm bởi stress tâm lý chỉ dựa trên thực nghiệm bơi bắt buộc (FST) Bởi vì, thực nghiệm FST bị ảnh hưởng bởi yếu tố hạ thân nhiệt do thực hiện trong môi trường nước, để có kết quả tin cậy đề tài thực hiện trên cả hai thử nghiệm FST và treo đuôi chuột (TST) Kết quả M-R1, M-R2 và V-R2 có tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm, chống stress oxy hóa trên não

4 Bố cục luận luận án

Luận án gồm 2 quyển: 1 quyển luận án và 1 quyển phụ lục

Quyển luận án: gồm có 1 trang Bìa, 1 trang Lời cam đoan và 11 trang tài liệu tham khảo không đánh số, 8 trang đánh số La Mã bao gồm các trang: Mục lục, Danh mục hình ảnh, bảng biểu và Ký hiệu viết tắt Nội dung luận án gồm 137 trang được đánh số tự nhiên (Ả Rập), mở đầu 2 trang, chương 1 tổng quan tài liệu 29 trang, chương 2 đối tượng và phương pháp nghiên cứu 25 trang, chương 3 kết quả nghiên cứu 55

trang, chương 4 bàn luận 23 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang Luận án có 67 bảng, 20 hình, 146 tài liệu tham khảo, 18 tài liệu tham khảo tiếng việt và 127 tài liệu tham khảo tiếng nước ngoài và 1 trang web

Quyển phụ lục: gồm có 9 phụ lục với 123 trang và 1 trang bìa phụ lục không đánh số

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về chi Panax

Phân loại thực vật chi Panax: Hiện nay theo The Plant list có 13 loài

thuộc chi Panax được chấp nhận

Thành phần hóa học các loài thuộc chi Panax: Gồm có đường, acid

béo, acid amin, nguyên tố đa và vi lượng, saponin phân 4 nhóm chính

là Protopanaxadiol (PPD), Protopanaxatriol (PPT), Ocotillol (OCT) Ngoài ra còn có saponin cấu trúc acid oleanolic (OA), saponin có mạch nhánh C-17, các saponin có khung không phổ biến khác

Phương pháp xác định saponin trong loài thuộc chi Panax

Saponin được định lượng bằng phương pháp HPLC kết hợp với detector là UV hay đầu dò tán xạ bay hơi (ELSD), DAD, detector phổ khối tứ cực thời gian bay (HPLC- Q-TOF- MS)

Sự liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của ginsenosid:

Chủ yếu liên quan đến phần đường trên khung genin

Kiểm nghiệm Sâm thuộc chi panax theo chuyên luận Dược điển

Các chỉ tiêu phân tích kiểm nghiệm Sâm theo một số Dược điển như: Châu âu (EP 8.0), Mỹ (USP 4.0, NF35), Nhật Bản (JP 17), Trung Quốc (CP 2015), Hàn Quốc (KP X) và Dược điển Việt Nam V

1.2 SÂM VIỆT NAM

để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối là rễ củ hình con quay

Thành phần hóa học:

Cho đến nay từ phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất đã phân lập được 61 saponin Ngoài ra nhiều thành phần khác trong Sâm VN đã được nghiên cứu và xác định như thành phần acid amin, acid béo, thành phần nguyên tố đa vi lượng và 7 polyacetylen

Một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam

Tác dụng chủ yếu của Sâm Việt Nam là tác dụng tăng lực, bảo vệ gan, chống stress tâm lý, kích thích miễn dịch, giảm đường huyết, giảm cholesterol…

Phương pháp định tính, định lượng saponin trong Sâm Việt Nam

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Phương pháp định lượng saponin trong Sâm Việt Nam

Hiện nay, thường dùng phương pháp HPLC-DAD, HPLC-ELSD

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam trồng từ 2- 6 tuổi, thu hái vào tháng 11/2012 tại Trạm Dược liệu Trà Linh thuộc Công ty Cổ phần Dược phẩm Quảng Nam Sau khi thu hái được rửa sạch và sấy khô; mẫu Sâm VN 6 tuổi được dùng để xây dựng quy trình định lượng, tiêu chuẩn hóa và chiết cao toàn phần thử tác dụng dược lý Mẫu Sâm 2 - 5 năm tuổi dùng xác định hàm lượng một số saponin

2.1.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích Hóa chất dùng trong thử nghiệm dược lý: Carbon tetrachlorid, cyclophosphamid monohydrat, ethanol Thuốc thử ellman [5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)], thiobarbituric acid (TBA), natri pentobarbital Hóa chất định lượng: AST, ALT Thuốc đối chiếu: Diazepam 5 mg, fluoxetin, silymarin

2.1.4 Động vật thử nghiệm

Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh chủng Swiss albino trọng lượng 20 ±

2 g được cung cấp bởi Viện Vaccin và Sinh phẩm Y Tế Nha Trang

2.1.5 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Hệ thống HPLC 1290 của Agilent (USA), cột phân tích cột Zorbax Eclipse Plus (150 x 4,6 mm, 3,5µm) Bộ tiêm tự động cho HPLC của Agilent Tất cả các dữ liệu được ghi và xử lý bằng phần mềm masshunter Hệ thống phổ khối phân giải cao 6500 series Q-TOF-MS (Agilent) Hệ thống HPLC 1200 của agilent (USA) bao gồm: cột phân tích Phenomenex gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm) và detector DAD Tất cả các dữ liệu được ghi và xử lý trên phần mềm chemstation

Ngoài ra còn có thêm một số thiết bị nghiên cứu khác

2.1.6 Nơi thực hiện đề tài

Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM: Ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện Thử nghiệm dược lý được tiến hành tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM Phòng phân tích thí nghiệm hóa phân tích, bộ môn di truyền – Đại học Khoa học tự nhiên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin trong Sâm Việt Nam trồng

- Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin bằng hai phương pháp HPLC-MS và HPLC-DAD: Khảo sát điều kiện thông số HPLC-MS và HPLC-DAD, khảo sát điều kiện chiết xuất mẫu

2.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

- Nghiên cứu thực vật Mô tả bằng cảm quan mô tả chi tiết bộ phận dùng (hình dạng, màu sắc, đặc điểm riêng biệt) Nghiên cứu đặc điểm

vi học: Cắt và làm tiêu bản vi phẫu, soi bột thân rễ và rễ, mô tả và chụp ảnh

2.2.4 Đánh giá tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng

2.2.4.1 Chiết xuất cao toàn phần, saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

Chiết xuất cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 45%,

cô thu hồi dung môi, phần dịch chiết còn lại đem đông khô Kiểm nghiệm cao toàn phần gồm một số chỉ tiêu: Cảm quan, định tính, định lượng

Chiết xuất saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi bằng phương pháp Diaion HP-20 Rửa giải lần lượt với nước, methanol,

cloroform Thu phân đoạn methanol cô thu hồi dung môi, dịch chiết còn lại đem đông khô thu được saponin toàn phần

2.2.4.4 Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng trên in vitro

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao toàn phần, saponin toàn phần và một số saponin nhóm ocotillol từ Sâm VN 6 tuổi trên tế bào Hep G2 Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa nội bào được xác định dựa vào nguyên tắc hoạt động của 2’,7’- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)

2.2.4.5 Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng trên in vivo

Tác dụng của Sâm VN trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid, cyclophosphamid, ethanol

Các chỉ tiêu đánh giá: AST, ALT trong huyết thanh, hàm lượng MDA, GSH trong gan

2.2.4.6 Tác dụng chống stress tâm lý của Sâm Việt Nam trồng

- Thực nghiệm gây stress cô lập: Tiến hành nuôi cô lập mỗi chuồng 1 con riêng biệt không tiếp xúc với nhau, kích thước chuồng 22 x 34 x

25 cm Mỗi chuồng sẽ được ngăn cách nhau bằng tấm carton để chặn

sự nhìn thấy nhau giữa các chuột Mục tiêu của thử nghiệm để đánh giá thời gian chuột bị stress do cô lập, chỉ tiêu đánh giá dựa vào mức độ hồi phục giấc ngủ pentobarbital bị rút ngắn do stress

- Khảo sát tác dụng của Sâm VN trên sự rút ngắn giấc ngủ pentobarbital gây bởi stress cô lập

- Tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của Sâm VN

+ Thực nghiệm hộp sáng tối (Light-dark box test) để đánh giá tác dụng giải lo âu

+ Thực nghiệm FST để đánh giá tác dụng chống trầm cảm

2.2.4.7.Tác dụng của M-R1, MR2, V-R2 trên sự giảm lo âu, chống

trầm cảm và stress oxy hóa tế bào não gây ra bởi stress cô lập trên chuột nhắt trắng

- Thực nghiệm hộp sáng tối đánh giá tác dụng giải lo âu

- Thực nghiệm FST và TST đánh giá tác dụng chống trầm cảm

- Xác định hàm lượng MDA và GSH trong não chuột

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin trong Sâm Việt Nam trồng

3.1.1 Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC-MS

3.1.1.1 Xây dựng quy trình định lượng

Khảo sát điều kiện HPLC

Điều kiện tối ưu sau quá trình khảo sát được lựa chọn:

Hệ thống sắc ký: Agilent HPLC 1290 kết hợp hệ thống phổ khối phân giải cao 6500 series Q-TOF

Pha tĩnh: Cột Zorbax Eclipse Plus (150 x 4,6 mm, 3,5µm)

Pha động: Kênh A là H2O chứa 0,1 % acid formic, kênh B là acetonitril chứa 0,1 % acid formic theo chương trình sau:

0 - 15 phút (80 % A : 20% B), 15 -17 phút (20% A : 80% B), 17- 19 phút (5% A : 95% B), 19,1 - 25 phút (80% A : 20% B)

Thể tích mẫu tiêm: 10 µl Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

Nhiệt độ cột: 40 oC

Thông số đầu dò phổ khối

Đề tài dùng chế độ Scan với phần mềm Data Acquisition, dữ liệu MS được ghi với chế độ ion dương và khoảng m/z từ 400-1700 Dalton Bảng 3.7 Thông số của detector phổ khối định lượng saponin

Buồng ion hóa Thông

số

Bộ cô lập khối Thông số

Gas temp (oC) 300 Fragmentor 140

Gas flow (l/min) 10 Skimmer 1 65

Nebulizer (psig) 35 OctopoleRFPeak 650

Nhận diện saponin trong mẫu thử và chuẩn bằng MS

Bảng 3.8 Kết quả HPLC-MS nhận dạng ion của 5 saponin đối chiếu

Saponin Công thức Rt (phút) Ion phân tử (m/z) (Da)

G-Rg1 C42H72O14 13,681 823,4722

M-R2 C41H70O14 13,834 809,4562

V-R2 C43H72O15 15,205 851,4677

G-Rb1 C54H92O23 17,365 1131,5931 G-Rd C48H82O18 18,534 969,5391

Khảo sát điều kiện chiết mẫu

Kết quả lựa chọn điều kiện chiết xuất để thu được 05 saponin với hàm lượng cao: Phương pháp siêu âm, dung môi MeOH 70%, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 25 oC

3.1.1.2.Đánh giá quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC-MS

Tính tương thích hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối của t lệ tín hiệu diện tích pic trên nồng độ chất chuẩn qua sáu lần tiêm liên tiếp có giá trị RSD < 2 % Do đó qui trình đạt tính tương thích hệ thống

Tính đặc hiệu: Dữ liệu phổ MS xác định tất cả 05 saponin cần định lượng có chỉ số IP > 4, phương pháp định lượng có tính đặc hiệu Tính tuyến tính: có sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong khoảng tuyến tính (0,05-50 μg/ml), riêng G-Rb1 có khoảng tuyến tính (0,1-50 μg/ml), các hệ số tương quan R2 ≥ 0,9995

Độ lặp lại: Kết quả độ lặp lại trong ngày có % RSD < 5%

Độ đúng: Các giá trị hiệu suất thu hồi và hiệu suất thu hồi trung bình đều nằm trong tiêu chuẩn chấp nhận 80 - 110 % , qui trình đạt yêu cầu

Ứng dụng phương pháp LC- MS để định lượng saponin trong mẫu Sâm Việt Nam trồng 2 -6 năm tuổi

Hàm lượng G-Rg1, M-R2, V-R2, G-Rb1 và G-Rd tăng dần theo độ tuổi Ginsenosid–Rb1, M-R2 đạt hàm lượng cao vào năm thứ 6 Tổng hàm lượng saponin tăng dần theo độ tuổi với hàm lượng cao nhất ở năm thứ 6

3.1.2 Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng saponin trong Sâm Việt Nam trồng bằng phương háp HPLC-DAD

3.1.2.1 Xây dựng quy trình định lượng saponin bằng phương háp HPLC- DAD

Khảo sát một số thông số HPLC

Máy: Agilent HPLC 1200

Detector: Bước sóng 196 nm, nhiệt độ cột: 40 °C

Cột: Phenomenex Gemini 5u C18 110A (250 × 4,6 nm, 5 µm)