GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) được tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973. Đến năm 1985, tên khoa học được xác định là Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân Sâm (Araliaceae). Hiện nay, Sâm Việt Nam cũng đã được lựa chọn là cây thuốc hàng đầu trong danh mục sản phẩm quốc gia. Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng đề án: “Chương trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dược liệu trong nước và các sản phẩm từ dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030. Xây dựng hồ sơ 40 dược liệu có tiềm năng khai thác và phát triển thị trường”, trong đó cây Sâm Việt Nam được chọn đứng vị trí đầu tiên trong danh sách. Sâm Việt Nam được thế giới biết đến như là một loài Sâm mới và có giá trị cao. Hiện nay, Sâm Việt Nam được trồng tại một số vùng đặc hữu như Kon Tum và Quảng Nam. Trên thị trường Sâm Việt Nam thường bị giả mạo bởi những dược liệu khác, vì vậy việc kiểm nghiệm đánh giá chất lượng Sâm Việt Nam là cần thiết. Về mặt dược lý của Sâm Việt Nam mọc hoang có tác dụng tăng lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ, tăng cường miễn dịch...Tuy nhiên, hiện nay nguồn Sâm sử dụng trên thị trường chủ yếu là từ nguồn trồng trọt. Vì các lý do cần thiết trên tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam”. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu: 1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin chính trong Sâm Việt Nam trồng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) và phương pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC–DAD). 2. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng. 3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi - Tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi - Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƢƠNG HỒNG TỐ QUYÊN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV., ARALIACEAE) NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2019 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI CỦA TÁC GIẢ Tạp chí nƣớc Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng thực nghiệm gây tổn thương gan carbon tetrachlorid chuột nhắt trắng”, Y Học TP.Hồ Chí Minh, tập 19 phụ số 5, tr.143-148 Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Vũ Huỳnh Kim Long, Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Y Học TP.Hồ Chí Minh, tập 19 phụ số 5, tr 157-164 Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Lê Huỳnh Thi, Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu tác dụng giải lo âu chống trầm cảm cao chiết từ Sâm Việt Nam trồng chuột bị stress cô lập”, Dược liệu, tập 20, số 6/2015 , tr 378-383 Duong Hong To Quyen, Nguyen Thai Minh Truc, Nguyen Thi Thu Huong, Nguyen Minh Duc (2015), “Effect of cultivated Vietnamese ginseng extract on endurance capacity in mice”, Journal of Medicinal Materials , vol.20, No.3 pp 181-186 Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh Đức (2017), “Khảo sát tác dụng bột chiết từ Sâm Việt Nam trồng rút ngắn giấc ngủ pentobarbital gây stress cô lập”, Dược liệu, (22), tr.109-113 Duong Hong To Quyen, Nguyen Thi Thu Huong, Nguyen Thuy Viet Phuong, Nguyen Minh Duc (2017), “Hepatoprotective activity of cultivated Vietnamese ginseng on oxidative stress-induced liver injury in mice”, Journal of Medicinal Materials, vol.22, No.3 pp 183-189 Tạp chí quốc tế Quyen H T Duong, Phuong T V Nguyen, Huong T T Nguyen, Duc M Nguyen (2016), “Effects of ocotillol-type saponins majonoside-R1 and vina-ginsenoside-R2 on abrogating depression and neuronal oxidative stress in socially isolated depression mouse model”, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol (2), pp 27-32 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) tìm thấy vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973 Đến năm 1985, tên khoa học xác định Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân Sâm (Araliaceae) Hiện nay, Sâm Việt Nam lựa chọn thuốc hàng đầu danh mục sản phẩm quốc gia Năm 2011, Bộ Y Tế triển khai xây dựng đề án: “Chương trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dược liệu nước sản phẩm từ dược liệu giai đoạn từ đến năm 2020 tầm nhìn đến 2030 Xây dựng hồ sơ 40 dược liệu có tiềm khai thác phát triển thị trường”, Sâm Việt Nam chọn đứng vị trí danh sách Sâm Việt Nam giới biết đến loài Sâm có giá trị cao Hiện nay, Sâm Việt Nam trồng số vùng đặc hữu Kon Tum Quảng Nam Trên thị trường Sâm Việt Nam thường bị giả mạo dược liệu khác, việc kiểm nghiệm đánh giá chất lượng Sâm Việt Nam cần thiết Về mặt dược lý Sâm Việt Nam mọc hoang có tác dụng tăng lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ, tăng cường miễn dịch Tuy nhiên, nguồn Sâm sử dụng thị trường chủ yếu từ nguồn trồng trọt Vì lý cần thiết tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa đánh giá số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam” Đề tài thực với mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng đánh giá quy trình định lượng đồng thời số saponin Sâm Việt Nam trồng phương pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) phương pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC–DAD) Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng Đánh giá số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam trồng tuổi - Tác dụng tăng lực Sâm Việt Nam trồng tuổi - Tác dụng bảo vệ gan Sâm Việt Nam trồng tuổi - Tác dụng chống stress tâm lý Sâm Việt Nam trồng tuổi - Tác dụng chống stress tâm lý saponin thuộc nhóm ocotillol: Majonosid-R1, majonosid-R2, vinaginsenosid-R2 Tính cấp thiết đề tài Theo Quyết định số 787/QĐ/TTg ngày 05/6/2017 Thủ tướng phủ, Sâm Việt Nam sản phẩm thuộc chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 Cho thấy vai trò hướng phát triển Sâm Việt Nam nước quan tâm nhiều Tuy nhiên, gần phát thứ Sâm Panax vietnamensis var Fuscidiscus mọc hoang Vân Nam thuộc Trung Quốc, có hình thái giống Sâm Việt Nam Lồi Sâm đánh giá bước đầu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao cho thấy thành phần saponin có nhóm ocotillol Sâm Việt Nam Do đó, vấn đề nghiên cứu tiêu chuẩn hóa đánh giá số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam trồng (Sâm VN) vấn đề cấp thiết, nhằm góp phần xây dựng thương hiệu quốc gia Sâm Việt Nam Những đóng góp luận án Luận án đạt số kết mới, đóng góp vào cơng trình nghiên cứu cho Sâm VN : - Có nhiều nghiên cứu cơng bố phương pháp định lượng đồng thời nhiều ginsenosid Nhân Sâm, Sâm Tam thất, Sâm Mỹ Nhưng chủ yếu saponin thuộc nhóm protopanaxadiol, protopanaxatriol Đề tài lần công bố xây dựng phương pháp định lượng đồng thời saponin Ginsenosid-Rg1, Ginsenosid-Rb1, Ginsenosid-Rd, Majonosid-R2 (M-R2) Vinaginsenosid-R2 (V-R2) phương pháp HPLC-Q-TOF-MS, có 02 saponin thuộc nhóm ocotillol M-R2 V-R2 có Sâm VN mà khơng có Nhân Sâm - Đề tài xây dựng tiêu chuẩn Sâm VN với tiêu yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển có xây dựng thêm tiêu đánh giá như: Kim loại nặng, xác định chất chiết methanol 70%, xây dựng quy trình định lượng đồng thời 05 saponin phương pháp HPLC- Q-TOF-MS phương pháp đại, nhanh, xác với độ tin cậy cao sử dụng phổ biến giới - Đề tài lần công bố kết đánh giá số tác dụng sinh học Sâm VN tuổi có so sánh đối chiếu với Nhân Sâm trồng tuổi: + Các kết nghiên cứu cho thấy Sâm VN tuổi có tác dụng tăng lực thử nghiệm chuột bơi kiệt sức Brekhman, liều 50 mg/kg Sâm VN có tác dụng tăng lực điển hình Nhân Sâm (NS) Tác dụng tăng lực Sâm VN tương đương NS thử nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng + Sâm VN có tác dụng bảo gan khỏi tác nhân gây tổn thương gan CCl4, cyclophosphamid, ethanol + Sâm VN có tác dụng chống stress tâm lý (tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm, chống stress oxy hóa não in vivo) tương đương NS - Đề tài lần công bố kết so sánh tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm, chống stress oxy hóa tế bào não in vivo MR1, M-R2 V-R2; saponin giống khung genin khác gốc đường nhóm chức acetyl Các saponin thuộc nhóm ocotillol có Sâm VN với hàm lượng tương đối cao mà khơng tìm thấy NS Các thực nghiệm trước Sâm VN để đánh giá tác dụng chống trầm cảm stress tâm lý dựa thực nghiệm bơi bắt buộc (FST) Bởi vì, thực nghiệm FST bị ảnh hưởng yếu tố hạ thân nhiệt thực mơi trường nước, để có kết tin cậy đề tài thực hai thử nghiệm FST treo đuôi chuột (TST) Kết M-R1, M-R2 V-R2 có tác dụng giải lo âu chống trầm cảm, chống stress oxy hóa não Bố cục luận luận án Luận án gồm quyển: luận án phụ lục Quyển luận án: gồm có trang Bìa, trang Lời cam đoan 11 trang tài liệu tham khảo không đánh số, trang đánh số La Mã bao gồm trang: Mục lục, Danh mục hình ảnh, bảng biểu Ký hiệu viết tắt Nội dung luận án gồm 137 trang đánh số tự nhiên (Ả Rập), mở đầu trang, chương tổng quan tài liệu 29 trang, chương đối tượng phương pháp nghiên cứu 25 trang, chương kết nghiên cứu 55 trang, chương bàn luận 23 trang, kết luận trang, kiến nghị trang Luận án có 67 bảng, 20 hình, 146 tài liệu tham khảo, 18 tài liệu tham khảo tiếng việt 127 tài liệu tham khảo tiếng nước trang web Quyển phụ lục: gồm có phụ lục với 123 trang trang bìa phụ lục khơng đánh số Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chi Panax Phân loại thực vật chi Panax: Hiện theo The Plant list có 13 lồi thuộc chi Panax chấp nhận Thành phần hóa học lồi thuộc chi Panax: Gồm có đường, acid béo, acid amin, nguyên tố đa vi lượng, saponin phân nhóm Protopanaxadiol (PPD), Protopanaxatriol (PPT), Ocotillol (OCT) Ngồi có saponin cấu trúc acid oleanolic (OA), saponin có mạch nhánh C-17, saponin có khung khơng phổ biến khác Phương pháp xác định saponin loài thuộc chi Panax Saponin định lượng phương pháp HPLC kết hợp với detector UV hay đầu dò tán xạ bay (ELSD), DAD, detector phổ khối tứ cực thời gian bay (HPLC- Q-TOF- MS) Sự liên quan cấu trúc hoạt tính chống oxy hóa ginsenosid: Chủ yếu liên quan đến phần đường khung genin Kiểm nghiệm Sâm thuộc chi panax theo chuyên luận Dược điển Các tiêu phân tích kiểm nghiệm Sâm theo số Dược điển như: Châu âu (EP 8.0), Mỹ (USP 4.0, NF35), Nhật Bản (JP 17), Trung Quốc (CP 2015), Hàn Quốc (KP X) Dược điển Việt Nam V 1.2 SÂM VIỆT NAM Thực vật học Sâm Việt Nam thảo, sống lâu năm, cao 40-80 cm có tới m Thân rễ nạc, mọc bò ngang, có nhiều đốt, khơng phân nhánh, dài 30-40 cm hay dài hơn, có nhiều vết sẹo thân khí sinh lụi hàng năm để lại, mặt màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối rễ củ hình quay Thành phần hóa học: Cho đến từ phần mặt đất phần mặt đất phân lập 61 saponin Ngoài nhiều thành phần khác Sâm VN nghiên cứu xác định thành phần acid amin, acid béo, thành phần nguyên tố đa vi lượng polyacetylen Một số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam Tác dụng chủ yếu Sâm Việt Nam tác dụng tăng lực, bảo vệ gan, chống stress tâm lý, kích thích miễn dịch, giảm đường huyết, giảm cholesterol… Phương pháp định tính, định lượng saponin Sâm Việt Nam Định tính sắc ký lớp mỏng Phương pháp định lượng saponin Sâm Việt Nam Hiện nay, thường dùng phương pháp HPLC-DAD, HPLC-ELSD CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Bộ phận mặt đất Sâm Việt Nam trồng từ 2- tuổi, thu hái vào tháng 11/2012 Trạm Dược liệu Trà Linh thuộc Công ty Cổ phần Dược phẩm Quảng Nam Sau thu hái rửa sấy khô; mẫu Sâm VN tuổi dùng để xây dựng quy trình định lượng, tiêu chuẩn hóa chiết cao tồn phần thử tác dụng dược lý Mẫu Sâm - năm tuổi dùng xác định hàm lượng số saponin 2.1.2 Chất đối chiếu Các chất đối chiếu: Ginenosid-Rg1 số lô: GRg1 Ref 012011, ginenosid-Rd số lô: GRd-001-0913, ginenosid-Rb1 số lô: GRb1 Ref 012011 Majonosid-R2 số lô: Majo.Ref 012012, vinaginsenosid-R2 số lô: VR2 Ref 012015 Các chất đối chiếu cung cấp Viện Kiểm Nghiệm thuốc Tp.HCM 2.1.3 Hóa chất dùng nghiên cứu Các thuốc thử, dung mơi, hóa chất sử dụng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích Hóa chất dùng thử nghiệm dược lý: Carbon tetrachlorid, cyclophosphamid monohydrat, ethanol Thuốc thử ellman [5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)], thiobarbituric acid (TBA), natri pentobarbital Hóa chất định lượng: AST, ALT Thuốc đối chiếu: Diazepam mg, fluoxetin, silymarin 2.1.4 Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh chủng Swiss albino trọng lượng 20 ± g cung cấp Viện Vaccin Sinh phẩm Y Tế Nha Trang 2.1.5 Thiết bị dùng nghiên cứu Hệ thống HPLC 1290 Agilent (USA), cột phân tích cột Zorbax Eclipse Plus (150 x 4,6 mm, 3,5µm) Bộ tiêm tự động cho HPLC Agilent Tất liệu ghi xử lý phần mềm masshunter Hệ thống phổ khối phân giải cao 6500 series Q-TOF-MS (Agilent) Hệ thống HPLC 1200 agilent (USA) bao gồm: cột phân tích Phenomenex gemini C18 (250 x 4,6 mm, μm) detector DAD Tất liệu ghi xử lý phần mềm chemstation Ngồi có thêm số thiết bị nghiên cứu khác 2.1.6 Nơi thực đề tài Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM: Ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện Thử nghiệm dược lý tiến hành Trung tâm Sâm Dược liệu Tp HCM Phòng phân tích thí nghiệm hóa phân tích, mơn di truyền – Đại học Khoa học tự nhiên 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng đánh giá quy trình định lượng đồng thời số saponin Sâm Việt Nam trồng - Xây dựng đánh giá quy trình định lượng đồng thời số saponin hai phương pháp HPLC-MS HPLC-DAD: Khảo sát điều kiện thông số HPLC-MS HPLC-DAD, khảo sát điều kiện chiết xuất mẫu 2.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng tuổi - Nghiên cứu thực vật Mô tả cảm quan mô tả chi tiết phận dùng (hình dạng, màu sắc, đặc điểm riêng biệt) Nghiên cứu đặc điểm vi học: Cắt làm tiêu vi phẫu, soi bột thân rễ rễ, mô tả chụp ảnh - Định tính: Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Định lượng: Định lượng đồng thời 05 saponin (G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 V-R2) phương pháp HPLC-Q-TOF-MS - Thử tinh khiết: Các tiêu thử tinh khiết tiến hành theo DĐVN V: Độ ẩm (Phụ lục 9.6), tro toàn phần (phụ lục 9.8), t lệ vụn nát (phụ lục 12.12), tạp chất (phụ lục 12.11), giới hạn kim loại nặng 2.2.4 Đánh giá tác dụng sinh học Sâm Việt Nam trồng 2.2.4.1 Chiết xuất cao toàn phần, saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng tuổi Chiết xuất cao toàn phần phương pháp ngấm kiệt với cồn 45%, cô thu hồi dung môi, phần dịch chiết lại đem đơng khơ Kiểm nghiệm cao toàn phần gồm số tiêu: Cảm quan, định tính, định lượng Chiết xuất saponin tồn phần từ Sâm Việt Nam trồng tuổi phương pháp Diaion HP-20 Rửa giải với nước, methanol, cloroform Thu phân đoạn methanol cô thu hồi dung môi, dịch chiết lại đem đơng khơ thu saponin tồn phần 2.2.4.2 Khảo sát độc tính cấp Dựa vào thể tích tối đa cho uống chuột nhắt trắng uống với thể tích 20 ml/kg thể trọng kim đầu tù chuyên dụng 2.2.4.3 Tác dụng tăng lực - Tiến hành 02 thử nghiệm: Thử nghiệm chuột bơi kiệt sức Brekhman thử nghiệm bơi bể bơi điều chỉnh tốc độ dòng Liều thử nghiệm mẫu 10 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg 2.2.4.4 Tác dụng bảo vệ gan Sâm Việt Nam trồng in vitro Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cao tồn phần, saponin tồn phần số saponin nhóm ocotillol từ Sâm VN tuổi tế bào Hep G2 Thử nghiệm khả kháng oxy hóa nội bào xác định dựa vào nguyên tắc hoạt động 2’,7’- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) 2.2.4.5 Tác dụng bảo vệ gan Sâm Việt Nam trồng in vivo Tác dụng Sâm VN thực nghiệm gây tổn thương gan carbon tetraclorid, cyclophosphamid, ethanol Các tiêu đánh giá: AST, ALT huyết thanh, hàm lượng MDA, GSH gan 2.2.4.6 Tác dụng chống stress tâm lý Sâm Việt Nam trồng - Thực nghiệm gây stress cô lập: Tiến hành nuôi cô lập chuồng riêng biệt khơng tiếp xúc với nhau, kích thước chuồng 22 x 34 x 25 cm Mỗi chuồng ngăn cách carton để chặn nhìn thấy chuột Mục tiêu thử nghiệm để đánh giá thời gian chuột bị stress cô lập, tiêu đánh giá dựa vào mức độ hồi phục giấc ngủ pentobarbital bị rút ngắn stress - Khảo sát tác dụng Sâm VN rút ngắn giấc ngủ pentobarbital gây stress cô lập - Tác dụng giải lo âu chống trầm cảm Sâm VN + Thực nghiệm hộp sáng tối (Light-dark box test) để đánh giá tác dụng giải lo âu + Thực nghiệm FST để đánh giá tác dụng chống trầm cảm 2.2.4.7.Tác dụng M-R1, MR2, V-R2 giảm lo âu, chống 10 Thông số đầu dò phổ khối Đề tài dùng chế độ Scan với phần mềm Data Acquisition, liệu MS ghi với chế độ ion dương khoảng m/z từ 400-1700 Dalton Bảng 3.7 Thông số detector phổ khối định lượng saponin Buồng ion hóa Thơng Bộ lập khối Thơng số số Gas temp (oC) 300 Fragmentor 140 Gas flow (l/min) 10 Skimmer 65 Nebulizer (psig) 35 OctopoleRFPeak 650 SheathGastemp 300 SheathGasFlow 12 Vcap 3500 Nozzle voltage (V) 400 Nhận diện saponin mẫu thử chuẩn MS Bảng 3.8 Kết HPLC-MS nhận dạng ion saponin đối chiếu Saponin Công thức Rt (phút) Ion phân tử (m/z) (Da) G-Rg1 C42H72O14 13,681 823,4722 M-R2 C41H70O14 13,834 809,4562 V-R2 C43H72O15 15,205 851,4677 G-Rb1 C54H92O23 17,365 1131,5931 G-Rd C48H82O18 18,534 969,5391 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Kết lựa chọn điều kiện chiết xuất để thu 05 saponin với hàm lượng cao: Phương pháp siêu âm, dung môi MeOH 70%, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 25 oC 11 3.1.1.2.Đánh giá quy trình định lượng saponin phương pháp HPLC-MS Tính tương thích hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối t lệ tín hiệu diện tích pic nồng độ chất chuẩn qua sáu lần tiêm liên tiếp có giá trị RSD < % Do qui trình đạt tính tương thích hệ thống Tính đặc hiệu: Dữ liệu phổ MS xác định tất 05 saponin cần định lượng có số IP > 4, phương pháp định lượng có tính đặc hiệu Tính tuyến tính: có tương quan nồng độ diện tích pic khoảng tuyến tính (0,05-50 μg/ml), riêng G-Rb1 có khoảng tuyến tính (0,1-50 μg/ml), hệ số tương quan R2 ≥ 0,9995 Độ lặp lại: Kết độ lặp lại ngày có % RSD < 5% Độ đúng: Các giá trị hiệu suất thu hồi hiệu suất thu hồi trung bình nằm tiêu chuẩn chấp nhận 80 - 110 % , qui trình đạt yêu cầu độ Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) saponin Bảng 3.24 Giới hạn phát định lượng HPLC-MS Saponin (ng/ml) Giới hạn G-Rg1 M-R2 V-R2 G-Rb1 G-Rd LOD 0,582 3,209 3,307 0,306 0,234 LOQ 1,940 10,697 11,023 1,018 0,778 Ứng dụng phƣơng pháp LC- MS để định lƣợng saponin mẫu Sâm Việt Nam trồng -6 năm tuổi Hàm lượng G-Rg1, M-R2, V-R2, G-Rb1 G-Rd tăng dần theo độ tuổi Ginsenosid–Rb1, M-R2 đạt hàm lượng cao vào năm thứ Tổng hàm lượng saponin tăng dần theo độ tuổi với hàm lượng cao năm thứ 3.1.2 Xây dựng đánh giá quy trình định lượng saponin Sâm Việt Nam trồng phương háp HPLC-DAD 3.1.2.1 Xây dựng quy trình định lượng saponin phương háp HPLC- DAD Khảo sát số thông số HPLC Máy: Agilent HPLC 1200 Detector: Bước sóng 196 nm, nhiệt độ cột: 40 °C Cột: Phenomenex Gemini 5u C18 110A (250 × 4,6 nm, µm) 12 Thể tích tiêm mẫu: 10 µl, tốc độ dòng: ml/phút Đề tài thăm dò số điều kiện sắc ký tìm điều kiện tối ưu: Điều kiện 3: –1 phút (80 % A : 20 % B), - phút (68 % A : 32 % B), - 12 phút (68 % A : 32 % B), 12 - 17 phút (55 % A : 45 % B), 17 - 20 phút (50 % A: 50% B), 20 - 24 phút (10 % A: 90% B), 24-24,1 phút (0 % A: 100 % B), 24,1-28 phút (0% A : 100 % B), 28-28,1 phút ( 80 % A : 20 % B), 28,1 - 35 phút (80 % A : 20 % B) Thăm dò điều kiện chiết mẫu Kết lựa chọn điều kiện chiết xuất để thu 05 saponin với hàm lượng cao: Chiết phương pháp siêu âm, dung môi MeOH 70%, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 25 oC 3.1.2.2 Đánh giá quy trình định lượng saponin phương pháp HPLC-DAD Tính tương thích hệ thống Các thơng số thời gian gian lưu (Rt) diện tích đỉnh (S) có % RSD < %, hệ số kéo đuôi nằm khoảng 0,8 - 1,5, pic có độ phân giải Rs ≥ 1,5 Như quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống Tính đặc hiệu Sắc ký đồ thể đạt độ tinh khiết pic, thời gian lưu pic mẫu chuẩn mẫu thử tương đương Mẫu trắng tín hiệu trùng với thời gian lưu pic quan tâm Khi thêm chuẩn vào dung dịch thử, diện tích đỉnh mẫu thử tăng lên Quy trình đáp ứng yêu cầu tính đặc hiệu quy trình định lượng Tính tuyến tính Kết có tương quan nồng độ diện tích pic khoảng tuyến tính, giá trị hệ số tương quan 0,9995 ≤ R2 ≤ 0,9999 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) LOD G-Rd thấp 2,9 µg/ml, M-R2 cao 63 µg/ml LOQ G-Rd 8,6 µg/ml, M-R2 cao 190 µg/ml 13 Độ lặp lại phương pháp HPLC-DAD Độ lặp lại ngày: Kết định lượng mẫu thử độc lập cho hàm lượng G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 có % RSD < 2% Do quy trình định lượng đạt yêu cầu độ lặp lại Độ lặp lại liên ngày: Kết định lượng mẫu thử độc lập, lặp lại ngày khác nhau, hàm lượng G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 có % RSD < 5% Do đó, quy trình định lượng đạt u cầu độ lặp lại Độ phương pháp định lượng saponin HPLC-DAD Kết có t lệ phục hồi ginsenosid thực nghiệm giới hạn cho phép t lệ phục hồi lý thuyết chất phân tích (90-107 %) 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng Xây dựng tiêu chuẩn sở Sâm Việt Nam trồng gồm có số tiêu: Vi phẫu, soi bột, thử tinh khiết (độ ẩm, tro tồn phần, giới hạn kim loại nặng), định tính, định lượng phương pháp HPLC-QTOF-MS 3.3 Đánh giá số tác dụng sinh học Sâm Việt Nam trồng tuổi 4.3.1 Chiết xuất cao toàn phần, saponin toàn phần Chiết xuất cao toàn phần: Kết từ 300 g nguyên liệu có độ ẩm 7,56 % phương pháp chiết ngấm kiệt thu 150,6 g cao, hiệu suất (54,32 %).Hàm lượng số saponin cao toàn phần SÂM VNT: G-Rg1 (102,2 mg/g), G-Rb1 (35,1 mg/g), G-Rd (36,4 mg/g), M-R2 (73,9 mg/g), V-R2 (0,5 mg/g) Chiết xuất saponin toàn phần Kết từ 50 g cao toàn phần có độ ẩm 4,45% thu 14,86 g saponin toàn phần với độ ẩm 3,48%, hiệu suất (30,02%) 3.3.2 Kết khảo sát độc tính cấp Khơng ghi nhận phân suất tử vong liều cao tối đa cho chuột uống Dmax 48,5 g/kg, thể tích uống 20 ml/kg trọng lượng chuột 3.3.3 Khảo sát tác dụng tăng lực Sâm Việt Nam trồng 3.3.3.1 Ảnh hưởng cao Sâm Việt Nam trồng thực nghiệm chuột bơi kiệt sức Brekhman 14 Kết cho thấy thời điểm T60, T7, T14: Các lô chuột uống cao Sâm VN hay cao NS liều 10 mg/kg, 50 mg/kg 100 mg/kg làm tăng phần trăm thời bơi có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng nước cất (p