2. .3 Phương pháp nghiên cứu
4.2. Về giai đoạn tinh chế
Nguyên tắc tinh chế acid shikimic được rút ra từ nghiên cứu này:
- Acid shikimic chiếm lượng lớn trong quả đại hồi nhưng rất khó kết tủa, phân lập nếu trong dịch chiết xử lý còn lẫn tạp. Vì vậy, cần phải xử lý, loại gần như hết tạp trong dịch chiết.
- Trong quá trình tinh chế cần phải hạn chế sự có mặt của nước. Nước hòa tan rất tốt acid shikimic vì vậy trong dịch chiết xử lý phải loại hết nước để có thể kết tủa acid shikimic.
- Lựa chọn dung môi tinh chế đảm bảo khả năng kết tủa hoạt chất, mức độ độc hại và tính kinh tế (giá cả, khả năng thu hồi tái sử dụng, thất thoát). Để acid shikimic kết tinh được trong dung môi tinh chế cần phải giảm dần độ tan của acid shikimic (bằng cách thêm đối dung môi hoặc giảm nhiệt độ) hoặc tạo ra dung dịch quá bão hòa (bằng cách làm bay hơi bớt dung môi tinh chế).
- Tẩy màu bằng than hoạt và kết tinh lại để thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao.
Qua khảo sát 4 loại dung môi tinh chế (methanol, hỗn hợp methanol- isopropanol, isopropanol, hỗn hợp methanol-aceton) cho thấy hỗn hợp methanol-aceton và isopropanol cho hiệu quả chiết tách acid shikimic tốt (70,68% và 66,87%). Tuy nhiên, khó khăn lớn nhất khi sử dụng hỗn hợp methanol-aceton là việc thu hồi, tái sử dụng dung môi; do dung môi thu hồi
có lẫn nước từ cao chiết nước. Với aceton thu hồi có lẫn methanol và nước, quá trình kết tủa acid shikimic trở nên khó khăn. Trong khi đó, isopropanol có thể khắc phục được tình trạng này. Song, lượng nước còn lại trong hỗn hợp để kết tủa hoạt chất càng lớn thì khả năng mất mát acid shikimic trong dịch lọc càng cao và thời gian kết tủa hoàn toàn càng lâu. Isopropanol là dung môi có tiềm năng để tinh chế thu acid shikimic, đáp ứng được các yêu cầu: loại được nhiều tạp, hiệu suất quy trình tốt, thu hồi dung môi dễ dàng và dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại.
Hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế, tạp chất, nhiệt độ,… là các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình kết tủa hoạt chất bằng isopropanol. Như đã trình bày ở trên, với điều kiện nghiên cứu và thời gian còn hạn chế, chúng tôi mới chỉ bước đầu khảo sát các yếu tố hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế và cho kết quả cũng như nhận định còn sơ bộ. Qua thực nghiệm cho thấy, áp dụng các biện pháp giảm tối đa lượng nước lẫn vào hỗn hợp đem tinh chế (sử dụng máy cất quay chân không, cô dịch chiết đến cao đặc) và loại tạp (sử dụng ethanol 96%, bột talc) giúp rút ngắn thời gian tạo tủa, giảm thiểu lượng hoạt chất mất mát trong dịch lọc. Tạp chất hòa tan làm tăng độ nhớt của dung dịch, gây cản trở quá trình kết tinh hoạt chất. Qua thực nghiệm cho thấy, có thể sử dụng bột talc hoặc bột giấy lọc trong giai đoạn tạo tủa thô và sử dụng than hoạt trong giai đoạn kết tinh lại để loại bớt tạp chất này, tạo điều kiện cho quá trình kết tủa/kết tinh hoạt chất. Tạp chất làm cho khối dịch rất khó lọc; do đó, việc hạn chế lượng nước lẫn trong hỗn hợp đem tinh chế và áp dụng các biện pháp loại tạp giúp cho thao tác lọc thu hoạt chất trở nên dễ dàng hơn.
Dịch lọc có độ nhớt lớn, đồng thời acid shikimic tuy khó tan, nhưng vẫn tan một phần trong isopropanol, do đó một lượng acid shikimic bị mất mát trong dịch lọc. Gộp các dịch lọc, dịch rửa, cô thu hồi dung môi, để kết
tinh thu hồi acid shikimic. Với các dung môi tinh chế khác, lượng acid shikimic thu hồi từ dịch lọc là không đáng kể.
Phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước được đề xuất có những ưu điểm sau đây:
- Không sử dụng nhựa trao đổi ion (phương pháp này tốn kém và chỉ áp dụng trong phòng thí nghiệm).
- Không sử dụng hoá chất độc hại (methanol, formaldehyd,…). - Ít thất thoát dung môi hơn khi sử dụng ethyl acetat hoặc aceton. - Có thể tái thu hồi sử dụng dung môi.
- Quy trình thao tác dễ dàng, sử dụng thiết bị đơn giản.
Tóm lại: Mặc dù acid shikimic đã được quan tâm nghiên cứu trong và ngoài nước từ nhiều năm gần đây với nhiều công trình được công bố nhưng mới chỉ có ứng dụng ở quy mô nghiên cứu. Các quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi còn khá phức tạp, sử dụng dung môi độc hại, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, lượng dung môi sử dụng lớn nên tính kinh tế không cao và khó áp ụng vào thực tiễn sản xuất (nội dung chi tiết đã được trình bày trong mục 1.2.5).
Với quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi với dung môi nước được chúng tôi đề xuất (hình 3.10), các thao tác thực hiện khá dễ dàng, thiết bị đơn giản, sử dụng nước làm dung môi chiết và các dung môi tinh chế dễ kiếm, rẻ tiền, ít độc hại (ethanol 96%, isopropanol). Quy trình được thử nghiệm với cỡ mẻ 2kg, lượng nước cho mỗi lần chiết được giảm đi do cỡ mẻ lớn, dược liệu xen kẽ vào nhau nên chỉ cần lượng nước với tỷ lệ nhỏ hơn mẻ 100g mà vẫn đảm bảo chiết được gần như toàn bộ hoạt chất; đồng thời giúp rút ngắn quá trình cô dịch chiết. Lượng dung môi tinh chế là tương đối nhiều, tuy nhiên có thể thu hồi tái sử dụng. Quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi với dung môi nước được đề xuất là ổn định và cho hiệu suất quy trình đạt 67,83 ± 1,62 (n = 3).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Mặc dù thời gian có hạn và điều kiện thực nghiệm còn nhiều hạn chế, nghiên cứu đã đạt được 2 mục tiêu đề ra:
1. Đã khảo sát và lựa chọn phương pháp chiết xuất acid shikimic kết hợp thu tinh dầu từ đại hồi với dung môi nước.
2. Đã xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết
nước.
Cụ thể như sau :
- Đã khảo sát hai phương pháp thu được acid shikimic kết hợp cất tinh dầu: phương pháp chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước và phương pháp ngâm lạnh cất tinh dầu sau; so sánh về tốc độ chiết (thời điểm cân bằng là khoảng 3 giờ và 14 giờ), về hiệu suất chiết (98,4% và 93,7%), về tính chọn lọc (hàm lượng hoạt chất trong cắn lần lượt là 54,57% và 60,65%) và về thể tích tinh dầu thu được (9,5mL và 8mL). Lựa chọn phương pháp: Cất lấy tinh dầu đại hồi bằng phương pháp cất kéo hơi nước, hỗn hợp còn lại đem chiết lấy acid shikimic.
- Đã khảo sát 4 loại dung môi tinh chế gồm có: methanol, hỗn hợp methanol-isopropanol, isopropanol và hỗn hợp methanol-aceton. Isopropanol được lựa chọn để tinh chế thu acid shikimic do đáp ứng được các yêu cầu: loại được nhiều tạp, hiệu suất quy trình tốt, thu hồi dung môi dễ dàng và dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại.
- Bước đầu khảo sát liên quan đến hàm ẩm của cao chiết nước. Kiểm soát lượng nước lẫn trong hỗn hợp để tạo tủa hoạt chất và áp dụng nhiều biện pháp loại tạp sẽ tạo thuận lợi cho quá trình tạo tủa acid shikimic sử dụng dung môi tinh chế là isopropanol.
- Từ các kết quả thu được, đã đề xuất quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi, áp dụng trên 3 mẻ thực nghiệm với cỡ mẻ 2kg nguyên liệu cho kết quả tương đối đồng nhất với hiệu suất quy trình đạt 67,83 ± 1,62 (n = 3). Phương pháp không yêu cầu thiết bị phức tạp, dễ tiến hành, chỉ dùng những dung môi an toàn và dễ kiếm.
Kiến nghị
Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. Chúng tôi xin kiến nghị:
Tiếp tục triển khai đánh giá quy trình chiết xuất acid shikimic trên quy mô lớn hơn để khẳng định tính khả thi của phương pháp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT:
1. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ
thực vật hạt kín ở Việt Nam, Nxb. Nông nghiệp, tr. 9.
2. Đỗ Huy Bích, Nguyễn Thượng Dong và cs. (2004), Cây thuốc và
động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb. Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tập I, tr. 986-990.
3. Đỗ Huy Bích, Nguyễn Văn Tập và cs. (1993), Tài nguyên cây thuốc
Việt Nam, Nxb. Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr. 534-535. 4. Bộ Y tế (2007), Dược liệu học, Nxb. Y học, tập II, tr. 234. 5. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr. 748-749.
6. Nguyễn Quyết Chiến và cs. (2006), “Phân lập acid shikimic từ quả hồi Việt Nam (Illicium verum Hook.f. – Illciaceae)”, Tạp chí Hóa học, 44(6), tr. 745-748.
7. Nguyễn Quyết Chiến (2007), “Chọn lựa một hướng đi trong nghiên cứu tổng hợp Oseltamivir (Tamiflu) ở Việt Nam”, Tạp chí Hóa học, 45(2), tr. 199-206.
8. Nguyễn Thượng Dong, Nguyễn Thị Bích Thu (2010), Nghiên cứu
phát triển cây hồi làm nguyên liệu sản xuất acid shikimic và khai
thác tinh dầu, Đề tài Khoa học Công nghệ cấp Bộ y tế, Viện Dược
liệu.
9. Trần Công Khánh, Nguyễn Thị Sinh (1997), Thực vật dược, Trường Đại học Dược Hà Nội.
10.Đỗ Thị Loan (2011), Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi
bằng nước, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
12.Nguyễn Đình Luyện (2006), “Chiết xuất acid shikimic từ hoa hồi
(Illicium verum Hook. f.)”, Tạp chí Dược học, 358, tr. 8-9.
13.Hà Thị Mai Trang (2007), Nghiên cứu định lượng acid shikimic trong đại hồi bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH:
14.Abrecht S., Harrington P., Iding H., Karpf M. et al (2004), “The Synthetic Development of the Anti-Influenza Neuraminidase Inhibitor Oseltamivir Phosphate (Tamiflu®)”, Chimia, 58(9), pp. 621-630.
15.Ambhaikar N. (2005), Shikimic acid, The Baran laboratory Group Meeting, The Scripps Research Institute.
16.Bogosian G. et al. (2008), Use of glyphosate to produce shikimic
acid in microorganisms, WIPO Patent Application
WO/2008/128076.
17.Denis V. Bochkov et al. (2012), “Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources”, J. Chem. Biol., 5(1), pp. 5–17.
18.Amalia M. Estévez and Ramón J. Estévez (20112), “A Short Overview on the Medicinal Chemistry of (—)-Shikimic Acid”,
Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 12, pp. 1443-1454.
19.Katarína Hroboňováa, Jozef Lehotaya and Jozef Čižmárik (2007), “Determination of Quinic and Shikimic Acids in Products Derived from Bees and their Preparates by HPLC”, Journal of Liquid
Chromatography & Related Technologies, 30(17), pp. 2635-2644.
20.LI Wei, CAO Yong, WEI Hua, ZHOU Dong-wu (2008), “Reversed-Phase HPLC Determination of Shikimic Acid in Illicium
Verum Hook. f.” - Abtract, Journal of Jishou University(Natural Sciences Edition), 01.
21.Merck & Co., Inc (2001), The Merk Index 13th edition, pp. 1457- 1458.
22.Ohira H., Torii N., Aida M. T., Watanabe M., Smith L. R. (2009), “Rapid separation of shikimic acid from Chinese star anise (Illicium
verum Hook. f.) with hot water extraction”, Separation and
Purification Tech., 69, pp. 102-108.
23.Payne R., Edmonds M. (2005), “Isolation of Shikimic Acid from Star Aniseed”, J. Chem. Edu., 82(4), pp. 599-600.
24.Sakaguchi I. et al. (2004), “The water soluble extract of Illicium
anisatum stimulas mouse vibrissae follicles in organs culture”, Exp.
Dermatol, 13(8), pp. 449-504.
25.Sankar I. V. et al. (2007), Method for obtaining shikimic acid, WIPO Patent Application WO/2007/138607.
26.Shingh G., Jiang S. (1998), “Chemical synthesis of shikimic acid and its analogues”, Tetrahedron, 54, pp. 4697-4753.
27.Shyluk J. P. et al. (1967), “Gas chromatography of the trimethylsilyl derivatives of shikimic acid and biochemically related compounds”,
J. Chroma., 26, pp. 268.
28.Stavric B., Stoltz D. R. (1976), “Shikimic acid”, Food Cosmet.
Toxicol., 14( 2), pp. 141-145.
29.The United State Pharmacopeia 30, NF 25 (2007), pp. 1063.
TÀI LIỆU TIẾNG TRUNG QUỐC:
30. Thư viện hóa chất BASECHEM, URL: http://www.basechem.org/chemical/2869.
PHỤ LỤC