2. .3 Phương pháp nghiên cứu
3.2. Khảo sát giai đoạn chiết xuất
Phương pháp A là phương pháp gắn liền với thực tiễn chưng cất tinh dầu đại hồi. Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, chúng tôi thực hiện khảo sát phương pháp A với các nội dung nghiên cứu gồm có: tốc độ chiết acid shikimic, hiệu quả cất tinh dầu đại hồi, hiệu suất chiết acid shikimic và tính chọn lọc.
3.2.1.1. Khảo sát tốc độ chiết
Tiến hành: Cân 100g bột dược liệu cho vào bình cầu thể tích 2L có 2 cổ có nút mài. Một cổ lắp hệ thống cất thu hồi dung môi, một cổ có nút đậy để lấy mẫu định kỳ. Thêm 700mL nước. Đun sôi trong 5 giờ. Lấy mẫu sau khi sôi, sau mỗi giờ lấy mẫu 1 lần.
Các mẫu được pha loãng như sau: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1.
0 1.12 0.76 1.01 1.07 1.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 1 2 3 4 5
Thời gian (giờ)
N ồ n g đ ộ ( % ) PP A
Hình 3.3.Đồ thị biểu diễn nồng độ của acid shikimic theo thời gian của PP A
Nhận xét: Dựa trên đồ thị thấy, thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp A là khoảng 3giờ.
3.2.1.2. Cất tinh dầu đại hồi
Tiến hành: Cho 100g nguyên liệu vào bình cầu 2L. Cho thêm 1,5L nước. Lắp hệ thống cất kéo hơi nước. Cất cho đến khi hết tinh dầu. Dịch cất được cho thêm 50g muối NaCl, hòa tan muối rồi chuyển sang bình gạn 500mL. Để dịch cất tách lớp hoàn toàn. Gạn bỏ lớp nước bên dưới thu được tinh dầu. Thể tích tinh dầu được đong bằng ống đong thể tích 10mL.
Kết quả:Thu được 9,5mL tinh dầu.
Nhận xét: Thực nghiệm cho thấy: thời gian để cất hết tinh dầu là 5 giờ. Thể tích tinh dầu thu được khá cao 9,5% (9,5mL/100g dược liệu). Phương pháp cất kéo hơi nước tiến hành khá đơn giản.
3.2.1.3. Chiết xuất acid shikimic
Tiến hành: Hỗn hợp sau khi cất tinh dầu được lọc thu lấy dịch chiết. Bã còn lại được tiếp tục chiết thêm 2 lần nữa, mỗi lần 700mL, thời gian đun sôi với mỗi lần là 1 giờ. Lọc lấy dịch chiết. Xác định nồng độ acid shikimic trong từng dịch chiết bằng HPLC. Tiến hành như sau:
Dịch chiết lần 1: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
Dịch chiết lần 2: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
Dịch chiết lần 3: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 25mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi đem định lượng bằng phương pháp HPLC. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả hiệu suất chiết acid shikimic theo phương pháp A
Lần chiết Thể tích (mL) Nồng độ (%) Hiệu suất chiết (%) Lần 1 700 ± 26 1,12 ± 0,07 72,5 Lần 2 680 ± 13 0,29 ± 0,01 18,2 Lần 3 640 ± 5 0,13 ± 0,01 7,7 Tổng hiệu suất chiết = 98,4%
Nhận xét: Hiệu suất chiết acid shikimic trong dịch chiết lần 1 là 72,5 %, lần 2 là 18,2%, lần 3 là 7,7%. Hiệu suất chiết acid shikimic sau 3 lần chiết là 98,4%.
Kết quả cho thấy phương pháp chiết acid shikimic sau khi cất tinh dầu có thể thu được gần như hoàn toàn lượng acid shikimic trong dược liệu với 3 lần chiết. Như vậy trong quá trình cất tinh dầu acid shikimic hầu như không bị phân hủy.
3.2.1.4. Khảo sát tính chọn lọc
Tiến hành: Dịch chiết của 3 lần chiết theo mục 3.2.1.3 được gộp lại. Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Xác định nồng độ acid shikimic bằng phương pháp HPLC. Sau đó cô đến cắn, cân lượng cắn thu được.
Hàm lượng acid shikimic trong cắn (S) được tính theo công thức: C x V
S(%) =
m Trong đó :
C : Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết (%) V : Thể tích dịch chiết (mL)
m : Khối lượng cắn (g)
Đánh giá: S càng lớn thì dịch chiết càng ít tạp, quá trình tinh chế thuận lợi hơn.
Kết quả:Phương pháp A có S = 54,57 (%).
3.2.2. Chiết xuất theo phương pháp B
Phương pháp ngâm lạnh có khuấy trộn tiến hành chiết acid shikimic trước, cất tinh dầu sau. Quá trình được tóm tắt trong hình 3.4.
Khảo sát phương pháp B về tốc độ chiết, hiệu suất chiết acid shikimic, tính chọn lọc và thể tích tinh dầu thu được sau khi đã chiết acid shikimic. Tiến hành so sánh với phương pháp A, từ đó lựa chọn phương pháp chiết xuất acid shikimic cho hiệu suất cao.
3.2.2.1. Khảo sát tốc độ chiết
Khảo sát thời điểm cân bằng của phương pháp B trong dịch chiết lần 1 để so sánh tốc độ chiết với phương pháp A. Phương pháp nào nhanh đạt đến thời điểm cân bằng tức là có tốc độ chiết nhanh hơn.
Tiến hành: Cân 100g bột đại hồi cho vào cốc có mỏ có thể tích 1L. Thêm 30mL nước ngâm cho dược liệu trương nở hoàn toàn. Thêm 670 mL nước. Đậy kín. Đặt lên máy khuấy từ, để nhiệt độ phòng. Khảo sát trong 22 giờ, lấy mẫu sau mỗi giờ. Mẫu được xử lý trước khi đem định lượng bằng HPLC như sau: Lọc Khuấy liên tục 14 giờ Chiết 2 lần Cất tinh dầu Gộp dịch chiết Bột dược liệu (100g) Dịch chiết L1 Dịch chiết Bã DL Bã DL Dịch chiết L2,3 Bã DL Tinh dầu
Nước (700ml) Khuấy liên tục 14 giờ
H2O (700ml)
Mẫu lấy từ 1 giờ đến 5 giờ: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
Mẫu lấy từ 6 giờ đến 22 giờ: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1.
Kết quả: Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.5.
Bảng 3.2. Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết sau mỗi giờ theo PP B
Giờ Nồng độ (%) Giờ Nồng độ (%) 1 0,30 12 1,09 2 0,42 14 1,14 3 0,55 16 1,16 4 0,67 17 1,17 5 0,79 18 1,21 6 0,87 20 1,20 8 1,02 22 1,23 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 1 2 3 4 5 6 8 12 14 16 17 18 20 22
Thời gian (giờ) Nồng độ (%)
3.2.2.2. Xác định hiệu suất chiết
Hiệu suất chiết cho biết sau mỗi lần chiết, lượng acid shikimic trong dược liệu đã được chiết kiệt hay chưa. Tiến hành xác định hiệu suất chiết của phương pháp B để so sánh với phương pháp A, từ đó đánh giá hiệu quả của phương pháp.
Tiến hành: Cân 100g bột đại hồi cho vào cốc có mỏ có thể tích 1L. Thêm 30mL nước ngâm cho dược liệu trương nở hoàn toàn. Thêm 670 mL nước. Đậy kín. Đặt lên máy khuấy từ, để nhiệt độ phòng. Khuấy liên tục trong 14 giờ. Lọc lấy dịch chiết lần 1. Tiến hành chiết thêm 2 lần như trên, mỗi lần 700mL nước, khuấy liên tục trong 14 giờ. Lọc thu được dịch chiết lần 2 và 3. Xác định nồng độ acid shikimic trong từng dịch chiết bằng HPLC:
Dịch chiết lần 1: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
Dịch chiết lần 2: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
Dịch chiết lần 3: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 25mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1. Hiệu suất chiết được tính theo công thức 2 mục 2.3.1.3. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả hiệu suất 3 lần chiết acid shikimic bằng PP B
Lần chiết Thể tích (ml) Nồng độ (%) Hiệu suất chiết (%) Lần 1 630 ± 9 1,23 ± 0,06 71,5 Lần 2 620 ± 13 0,30 ± 0,02 17,2 Lần 3 610 ± 10 0,09 ± 0,01 5,0 Tổng hiệu suất chiết = 93,7%
3.2.2.3. Khảo sát tính chọn lọc
Tiến hành tương tự theo mục 3.2.1.4, ta có hàm lượng acid shikimic trong cắn tương ứng với phương pháp B là 60,65%.
3.2.2.4. Cất tinh dầu
Từ 100g dược liệu ban đầu, sau khi chiết hết acid shikimic, bã dược liệu được cho thêm 1L nước, lắp hệ thống cất kéo hơi nước, cất cho đến khi hết tinh dầu. Phương pháp thu được 8 ± 0,1 mL tinh dầu.
3.2.3. Đánh giá và lựa chọn phương pháp chiết xuất
3.2.3.1. Về tốc độ chiết
Tốc độ chiết của hai phương pháp được thể hiện trong hình 3.6.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 1 2 3 4 5 6 8 12 14 16 17 18 20 22
Thời gian (giờ) Nồng độ
(%) PP B PP A
Hình 3.6.Đồ thị biểu diễn nồng độ AS theo thời gian của 2 phương pháp
Nhận xét: Thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp A là khoảng 3giờ, thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp B là khoảng 14 giờ. Vậy phương pháp A có tốc độ chiết nhanh hơn phương pháp B.
3.2.3.2. Về hiệu suất chiết
Từ các kết quả thu được, ta có đồ thị so sánh hiệu suất chiết của hai phương pháp (hình 3.7).
Hình 3.7.Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết của 2 phương pháp
Nhận xét: Hàm lượng acid shikimic thu được sau mỗi lần chiết trong phương pháp A đều lớn hơn hàm lượng trong phương pháp B. Lần 1, phương pháp A thu được 72,5%, trong khi phương pháp B thu được 71,5%. Lần 2, phương pháp A thu được 18,2 %, phương pháp B thu được 17,2%. Lần 3 phương pháp A thu được 7,7% , phương pháp B thu được 5,0%. Tổng hiệu suất chiết của phương pháp A (98,4%) lớn hơn phương pháp B (93,7%) là 4,7%. Vậy hiệu suất chiết của phương pháp A cao hơn hiệu suất chiết của phương pháp B.
3.2.3.3. Về tính chọn lọc
Bảng 3.4. Kết quả xác định hệ số chọn lọc của 2 phương pháp V (mL) C (%) mAS(g)* m (g) S (%) Phương pháp A 2020 ± 36 0,53 ± 0,01 10,706 19,62 ± 0,89 54,57 Phương pháp B 1860 ± 9 0,54 ± 0,01 10,044 16,56 ± 1,08 60,65 * mAS = V.C/100
Nhận xét: Phương pháp A có hàm lượng AS trong cắn (S) thấp hơn, như vậy dịch chiết nhiều tạp hơn. Tuy nhiên sự khác biệt về giá trị S của hai phương pháp là không nhiều.
3.2.3.4. Kết quả cất tinh dầu
Tinh dầu được coi là sản phẩm phụ trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, đây vẫn là một sản phẩm giá trị từđại hồi và có ý nghĩa ứng dụng thực tế. Kết quả cất tinh dầu của hai phương pháp được tổng hợp trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả cất tinh dầu của hai phương pháp
Cảm quan Chỉ tiêu Phương pháp Thể tích (ml) Màu sắc Mùi vị Phương pháp A 9,5 Vàng nhạt Vị ngọt Phương pháp B 8,0 Vàng nhạt Vị ngọt 3.2.3.5. Nhận xét và lựa chọn phương pháp chiết xuất Các kết quảđược tổng hợp trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Bảng so sánh tốc độ cân bằng, hiệu suất chiết, hàm lượng AS trong cắn (S), thể tích tinh dầu và thời gian chiết xuất
PP Chỉ tiêu
PP A (chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước)
PP B (ngâm lạnh kết hợp cất tinh dầu sau) Tốc độ cân bằng (giờ) 3 14 Hiệu suất chiết (%) 98,4 93,7 S (%) 54,57 60,65 Thể tích tinh dầu (mL) 9,5 8,0 Thời gian chiết xuất và cất tinh dầu (giờ) 8,5 47 Các kết quả nghiên cứu nghiên cứu trên cho thấy rằng:
- Tốc độ cân bằng trong phương pháp cất tinh dầu trước (phương pháp A) nhanh hơn trong phương pháp ngâm lạnh (phương pháp B). Hiệu suất chiết và thể tích tinh dầu thu được cũng nhiều hơn. Tuy nhiên tính chọn lọc của phương pháp A là thấp hơn so với phương pháp B (thể hiện qua hàm lượng acid shikimic trong cắn).
- Khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên. Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Vì vậy tốc độ chiết của phương pháp A là nhanh hơn (thời gian đạt đến cân bằng khoảng 3 giờ) và chiết được hầu như toàn bộ acid shikimic (98,4%). Tốc độ chiết của phương pháp A nhanh hơn phương pháp B, đồng thời phương pháp này có thể kết hợp cất tinh dầu trong lần chiết thứ nhất do đó rút ngắn được thời gian chiết xuất và cất tinh dầu 5,5 lần so với phương pháp B. Tuy nhiên khi tăng nhiệt độ làm tăng độ tan của acid shikimic cũng làm tăng độ tan của các tạp
chất, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều chất nhầy, gôm… Phương pháp này có hàm lượng acid shikimic trong cắn thấp hơn và lượng tạp trong dịch chiết nhiều hơn phương pháp ngâm lạnh; tuy nhiên, xét về tổng thể, lượng hoạt chất thu được với phương pháp A (10,706 g) vẫn lớn hơn phương pháp B (10,044 g). Độ nhớt của dịch chiết tăng gây khó khăn trong việc lọc và loại tạp. Đồng thời, phương pháp cất tinh dầu trước có sử dụng nhiệt độ, tinh dầu được cất trước hết nên không bị thất thoát, do đó thu được lượng tinh dầu nhiều hơn phương pháp B. Như vậy phương pháp này có ưu điểm là: thời gian chiết nhanh, hiệu suất chiết acid shikimic tốt, thu được lượng tinh dầu cao. Nhược điểm: tiêu tốn nhiệt lượng, dịch chiết thu được khó lọc và nhiều tạp.
- Trong phương pháp ngâm lạnh có khuấy trộn liên tục để tạo ra sự chênh lệch nồng độ liên tục giữa lớp dung môi phía sát màng tế bào với lớp dung môi ở phía xa, từ đó đẩy nhanh tốc độ chiết. Tuy nhiên, thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp B là khoảng 14 giờ. Lượng tinh dầu thu được là 8 mL, ít hơn 1,5 mL so với phương pháp cất tinh dầu trước. Nguyên nhân có thể do tinh dầu bị bão hòa một phần trong dịch chiết nước trong quá trình khuấy trộn liên tục trong nhiều giờ. Dịch chiết thu được cũng khá nhớt và khó lọc.
Với những ưu điểm trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước là phương pháp A: Cất lấy tinh dầu đại hồi bằng phương pháp cất kéo hơi nước, hỗn hợp còn lại đem chiết lấy acid shikimic.
3.3. Tinh chế acid shikimic
Acid shikimic thường được phân lập bằng nhựa trao đổi ion. Hoạt chất này rất dễ tan trong nước, tan trong ethanol, methanol và khó kết tinh. I. V. Sankar (2007) phân lập acid shikimic bằng methanol, tránh được việc dùng nhựa trao đổi ion; nhưng quá trình tinh chế phức tạp, tốn dung môi, sử dụng
formaldehyd là dung môi độc hại. Trong khi đó, acid shikimic và nhiều tạp chất tan khá tốt trong methanol nên hiệu suất phân lập chưa cao. Các nghiên cứu khác đã công bố thường sử dụng hỗn hợp methanol và một dung môi khác (aceton, ethyl acetat) để kết tủa hoạt chất này, nên hiệu suất thu được còn thấp, sản phẩm kém tinh khiết và việc thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn. Nghiên cứu này được thực hiện với mong muốn tìm ra được phương pháp khắc phục các hạn chế nêu trên của các công trình đã công bố trước đây.
3.3.1. Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế
Trên nguyên tắc giảm dần độ tan của acid shikimic (bằng cách thêm đối dung môi hoặc giảm nhiệt độ), trước hết cao đặc chứa acid shikimic phải được hoà tan trong dung môi sao cho hoạt chất được chiết sang dung dịch. Methanol là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm và hoà tan tốt acid shikimic; trong khi đó hoạt chất này ít tan trong isopropanol và không tan trong aceton. Qua thực nghiệm thấy, nếu chỉ sử dụng dung môi methanol cũng có thể kết tinh hoạt chất. Vì vậy chúng tôi tiến hành so sánh hiệu quả tinh chế của 4 loại dung môi: methanol, isopropanol, hỗn hợp dung môi methanol – aceton, hỗn hợp dung môi methanol – isopropanol. Sản phẩm thô thu được được kết tinh lại