a) Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học
- Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy trong cao lỏng có các
thành phần cơ bản tương tự như thành phần của các vị thuốc, bao gồm: flavonoid, saponin, tanin, acid amin, polysaccharid, đường khử.
- Như vậy, hai nhóm chất chính trong cao lỏng là flavonoid và saponin. Do đó, chúng tôi đã tiến hành chiết chọn lọc theo từng nhóm chất đối với các dược liệu có thành phần chính là một trong hai nhóm chất này. Nhóm chứa flavonoid gồm các dược liệu: xạ can, núc nác; nhóm chứa saponin gồm các dược liệu: cát cánh, mạch môn, thiên môn. Phương pháp này tốn dung môi và nhiều công đoạn nhưng có ưu điểm là loại được nhiều tạp chất và các nhóm chất khác, vì vậy sẽ cho kết quả chính xác hơn. Đối với các dược liệu có cả hai thành phần trên như cam thảo, kim ngân hoa, chúng tôi đã tiến hành chiết không chọn lọc: dùng dung môi methanol, n- butanol để chiết nhiều thành phần có trong dược liệu và cao lỏng.
b) Định tính so sánh cao và vị thuốc bằng SKLM
- Trên sắc ký đồ của các dược liệu, ngoài các vết tương đương với cao lỏng
còn xuất hiện nhiều vết khác, cụ thể: cát cánh có thêm 3 vết, thiên môn có thêm 4 vết, mạch môn có thêm 3 vết, huyền sâm có thêm 4 vết, núc nác có thêm 3 vết, xạ can có thêm 1 vết, cam thảo có thêm 4 vết, kim ngân hoa có thêm 3 vết, do trong quá trình bào chế, một số thành phần trong dược liệu đã bị giảm hoặc mất đi. Ngoài ra, một số vết xuất hiện giữa các dược liệu khá giống nhau (cát cánh, thiên môn, mạch môn) có thể do cấu trúc gần giống nhau giữa các thành phần trong cùng nhóm
65
chất. Một số vết trong cao có màu đậm hơn hoặc nhạt hơn so với các vết tương ứng của dược liệu có thể do sự biến đổi các chất trong quá trình bào chế cao, chiết xuất dược liệu, lượng mẫu chấm.
- Qua quá trình nghiên cứu và triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định dấu vân tay của các vị thuốc, chúng tôi nhận thấy rằng, để có kết quả tốt thì cần thực hiện các bước khảo sát về khối lượng mẫu nghiên cứu cần dùng, hệ dung môi khai triển, lượng mẫu chấm trên bản mỏng, và tính lặp lại của kết quả.
c) Định lượng Tectoridin và Tectorigenin
Tectoridin và tectorigenin là 2 hoạt chất chính trong thân rễ Xạ can (Belamcanda chinensis). Trong đó, hàm lượng tectoridin khá lớn (khoảng 1% so với nguyên liệu mẫu khô tuyệt đối). Cả 2 hoạt chất này đều có hoạt tính chống viêm mạnh và đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế kháng viêm của Belamcanda chinensis, thông qua khả năng ức chế sự sản sinh PGE2 và COX-2 sinh ra trong các phản ứng viêm. Bởi vậy, xác định hàm lượng của tectoridin và tectorigenin trong cao lỏng Vĩ Ngân là một chỉ tiêu kĩ thuật quan trọng, có liên hệ với hoạt tính chống viêm của phương thuốc.
Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, đã định lượng được đồng thời hàm lượng tectoridin và tectorigenin trong cao lỏng Vĩ Ngân, lần lượt tương ứng là 0,2413% (± 0,0042%) và 0,0319% (± 0,0009%). Từ kết quả này, có thể suy ra hàm lượng tectoridin tương ứng trong dược liệu Xạ can là khoảng 0,88%, tương đối phù hợp với hàm lượng trung bình đã được biết đến của tectoridin trong Xạ can là khoảng 1% [23]. Như vậy việc chiết riêng Xạ can bằng EtOH 70% bằng phương pháp ngấm kiệt đã giúp tối ưu hóa việc chiết xuất hoạt chất từ dược liệu.
Hàm lượng lượng tectoridin trong cao lỏng là khá cao; trong khi hàm lượng tectorigenin trong cao lỏng lại tương đối thấp. Do vậy, chúng tôi đề xuất đưa hàm lượng tectoridin vào dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật của cao lỏng Vĩ Ngân.
Từ các kết quả trên, chúng tôi đề xuất một số chỉ tiêu trong dự thảo tiêu chuẩn
66
Bảng 3.25. Một số chỉ tiêu về hóa học đề xuất trong dự thảo tiêu chuẩn kĩ thuật của cao lỏng Vĩ Ngân
Chỉ tiêu định tính Yêu cầu
Phản ứng hóa học Flavonoid Phản ứng Cyanidin + Với FeCl3 +
Với kiềm (NaOH 10%,NH3) +
Phản ứng diazo hóa + Saponin Tạo bọt + Phản ứng Salkowski + Libermann- Burchard + Sắc ký lớp mỏng Cao- Kim ngân hoa
Hệ dung môi: Toluen- CHCl3- aceton- HCOOH (8:5:7:0,2) Quan sát ở bước sóng 366nm Có 5 vết tương đương: Rf = 0,08; 0,25; 0,28; 0,32; 0,59 (màu xanh) Cao- Cam thảo
Hệ dung môi: EtOAc– a.acetic băng-HCOOH- H2O (15:1:1:2) Quan sát ở bước sóng 254 nm Có 3 vết tương đương: Rf= 0,20; 0,28; 0,48 (màu đen) Cao - Xạ can
Hệ dung môi: Toluen-EtOAc- HCOOH (5:6: 1,5)
Quan sát: phun TT KOH/EtOH
Có 2 vết tương đương: Rf= 0,55 (tím nhạt) Rf= 0,64 (nâu nhạt) Cao-
Núc nác
Hệ dung môi: CHCl3 - EtOAc - HCOOH (2:2:1) Quan sát ở bước sóng 254 nm Có 3 vết tương đương: Rf= 0,13; 0,25; 0,75 (màu đen) Cao- Huyền sâm
Hệ dung môi: CHCl3 – MeOH- HCOOH (9:1: 0,2)
Quan sát: TT vanilin sulfuric
Có 6 vết tương đương:
Rf= 0,05; 0,09; 0,18; 0,36; 0,42; 0,68 (đen, đen, xanh lá, nâu, xanh lá, hồng)
Cao- Saponin (cát cánh, thiên môn, mạch môn)
Hệ dung môi: Toluen- EtOAc - HCOOH (5:5:1)
Quan sát: phun TT vanilin sulfuric Cao-CC,TM: có 6 vết tương đương: Rf= 0,25; 0,40; 0,51; 0,73; 0,85; 0,95 (tím, xanh lá, tím, tím, tím, tím, tím) Cao-MM: có 4 vết tương đương: Rf= 0,25; 0,51; 0,85; 0,95 (đều tím)
Chỉ tiêu định lượng Yêu cầu
67
3.4.2. Về tác dụng sinh học Nguyên tắc tính liều
Liều bình thường: Khối lượng dược liệu trong phương thuốc Vĩ Ngân là 88g/người (50kg)/ngày, tương đương với liều 1,76 g/kg/ngày đối với người. Theo tương đương sinh học, liều của chuột nhắt trắng gấp 12 lần người, liều của chuột cống trắng gấp 8 lần người [39]. Do vậy, liều bình thường của chuột nhắt là 21,12g dược liệu/kg/ngày; liều bình thường của chuột cống trắng là 14,08g dược liệu/kg/ngày. Từ đó làm cơ sở cho tính liều thử tác dụng sinh học. Qua khảo sát ở một số mức liều khác nhau, chọn ra các mức liều: gấp 3 lần (liều thấp), gấp 9 lần (liều cao) liều tương đương lâm sàng, tương ứng với liều 42,24g và liều 126,72g dược liệu/kg để thử tác dụng chống viêm cấp trên chuột cống trắng; liều 63,36 và liều 190,08 g dược liệu/kg để thử tác dụng giảm ho, long đờm trên chuột nhắt trắng.
3.4.2.1. Độc tính cấp
Cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 468,75g dược liệu/kg/ngày (liều tối đa có thể dùng được bằng đường uống, gấp 22,19 lần liều tương đương lâm sàng) không thể hiện độc tính cấp trên chuột nhắt trắng theo đường uống. Không xác định được LD50 trên chuột nhắt trắng theo đường uống. Như vậy, sử dụng cao lỏng Vĩ Ngân trong thời gian ngắn là an toàn; và có thể tiếp tục đánh giá các tác dụng sinh học khác của cao lỏng Vĩ Ngân theo hướng ứng dụng trong điều trị.
3.4.2.2.Tác dụng chống viêm cấp
Trên mô hình gây phù chân chuột và mô hình gây viêm màng bụng chuột trên chuột cống trắng, kháng nguyên sử dụng là carrageenin, có bản chất là polysaccharid gần giống với cấu trúc vỏ vi khuẩn, vì vậy đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ yếu là đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu với sự giam gia chủ yếu của đại thực bào, bạch cầu múi trung tính [86]. Biểu hiện của quá trình viêm này là giãn mạch, bạch cầu xuyên mạch đi tới các ổ viêm và tập trung nhiều ở đây, tăng tiết dịch tại ổ viêm gây phù nề, quá trình thực bào của bạch cầu đối với kháng nguyên làm tăng giải phóng các chất trung gian hóa học có bản chất là các protein như prostaglandin, histamine, leucotrien…Đồng thời, các đại thực bào khi được hoạt hóa bởi tác nhân gây bệnh, sẽ phóng thích một loạt các cytokine như interleukin - 1,
68
yếu tố hoại tử khối u TNFα, interleukin – 6, interleukin – 8, interleukin – 12…hoạt hóa nhiều tế bào miễn dịch khác nhau, và có bản chất là protein tan trong nước. Biểu hiện quan sát được của quá trình viêm là sưng (phù nề), nóng (sốt), đỏ, đau [7]. Trong đó, triệu chứng sưng, phù nề được đánh giá thông qua độ tăng thể tích chân chuột sau khi gây viêm trên mô hình gây phù chân chuột cống trắng bằng carrageenin. Quá trình viêm còn được phản ánh thông qua sự gia tăng thể tích dịch rỉ viêm, sự gia tăng số lượng bạch cầu và số lượng protein trong dịch rỉ viêm trên mô hình gây viêm màng bụng chuột cống trắng bằng carrageenin. Do vậy, tác dụng chống viêm cấp của thuốc thử được đánh giá thông qua khả năng làm giảm mức độ phù chân chuột, giảm thể tích dịch rỉ viêm, giảm số lượng bạch cầu và protein trong dịch rỉ viêm khi so sánh lô thử với lô chứng và lô đối chiếu.
Aspirin là thuốc chống viêm không có nhóm steroid, tác dụng chủ yếu chống viêm cấp nên được chọn làm thuốc chứng dương trong các mô hình viêm cấp [28], [29].
Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của thuốc trên thực nghiệm trên thế giới và Việt Nam thường dựa vào 2 mô hình gây phù thực nghiệm bằng kaolin hoặc carrageenin. Carrageenin đã được Winter và cộng sự sử dụng lần đầu tiên vào năm 1963 gây phù ở chân chuột cống trắng để làm mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của indomethacin [87]. Carrageenin có tính chất tan mạnh trong nước vì vậy khi pha thành dung dịch ta sẽ được dung dịch đồng nhất nên lượng lấy để tiêm vào chân chuột sẽ chính xác hơn khi dùng kaolin để gây mô hình viêm cấp tính. Kaolin cũng là một kháng nguyên hay được sử dụng trong gây mô hình viêm cấp, tuy nhiên có nhược điểm do không tan trong nước nên sẽ tạo thành hỗn dịch khi pha với nước. Để hạn chế phần nào sự lắng nhanh của kaolin người ta phải nghiền kaolin với dung dịch gôm adragant 0,2 %, và trước khi tiêm cho chuột phải nghiền lại để kaolin trộn đều trong dung dịch gôm. Ngoài ra, trong nghiên cứu của mình, Đỗ Trung Đàm đã chứng mình rằng carrageenin làm xuất hiện mức độ viêm tốt, đồng đều giữa các cá thể và sớm hơn so với dùng kaolin (2 giờ 30 phút – 3 giờ so với 5 giờ sau khi tiêm) [18]. Chính những ưu điểm đó nên trong nghiên cứu này, carrageenin được lựa chọn để gây mô hình viêm cấp.
69
Trên mô hình gây phù chân chuột cống trắng bằng carrageenin, kết quả nghiên cứu cho thấy:
+ Aspirin liều 200mg/kg có tác dụng làm giảm độ tăng thể tích chân chuột ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô chứng (p < 0,05).
- Cao lỏng Vĩ Ngân ở cả 2 liều (liều tương đương 42,24g dược liệu/kg và 126,72g dược liệu/kg), có tác dụng làm giảm độ tăng thể tích chân chuột sau khi gây viêm ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô chứng. Tuy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), nhưng cao lỏng Vĩ Ngân đã thể hiện xu hướng tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột cống trắng bằng carrageenin.
Trên mô hình gây viêm màng bụng chuột cống trắng bằng carrageenin và formaldehyd, kết quả nghiên cứu cho thấy:
- Đối với thể tích dịch rỉ viêm:
+ Aspirin liều 200mg/kg có tác dụng làm giảm thể tích dịch rỉ viêm so với lô chứng (p < 0,05), với mức giảm là 51,95%.
+ Cao lỏng Vĩ Ngân liều thấp, tương đương 42,24g dược liệu/kg có tác dụng làm giảm thể tích dịch rỉ viêm so với lô chứng, với mức giảm là 25,78%. Nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
+ Cao lỏng Vĩ Ngân liều cao, tương đương 126,72g dược liệu/kg có tác dụng làm giảm thể tích dịch rỉ viêm so với lô chứng (p < 0,05), với mức giảm là 42,19%. Như vậy, cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 126,72g dược liệu/kg đã thể hiện tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây viêm màng bụng chuột cống trắng bằng carrageenin. Tác dụng này rõ rệt hơn tác dụng của cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 42,24g dược liệu/kg. Có thể tác dụng chống viêm cấp của cao lỏng Vĩ Ngân phụ thuộc liều.
- Đối với số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm:
+ Aspirin liều 200mg/kg có tác dụng làm giảm rõ rệt số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm so với lô chứng (p < 0,01), với mức giảm là 62,5%.
70
+ Cao lỏng Vĩ Ngân liều thấp, tương đương 42,24g dược liệu/kg có tác dụng làm giảm số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm, với mức giảm là 37,5%. Nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
+ Cao lỏng Vĩ Ngân liều cao, tương đương 126,72g dược liệu/kg có tác dụng
làm giảm rõ rệt số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm so với lô chứng (p < 0,01), với
mức giảm là 50%. Như vậy, cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 126,72g dược
liệu/kg đã thể hiện tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây viêm màng bụng
chuột cống trắng bằng carrageenin. Tác dụng này tương đương với tác dụng của
Aspirin liều 200mg/kg (p > 0,05); và rõ rệt hơn tác dụng của cao lỏng Vĩ Ngân liều
tương đương 42,24g dược liệu/kg. Có thể tác dụng chống viêm cấp của cao lỏng Vĩ
Ngân phụ thuộc liều.
- Đối với số lượng protein trong dịch rỉ viêm:
+ Aspirin liều 200mg/kg có tác dụng làm giảm số lượng protein trong dịch rỉ viêm so với lô chứng (p < 0,05), với mức giảm là 50%.
+ Cao lỏng Vĩ Ngân liều thấp, tương đương 42,24g dược liệu/kg không có tác dụng làm giảm số lượng protein trong dịch rỉ viêm so với lô chứng.
+ Cao lỏng Vĩ Ngân liều cao, tương đương 126,72g dược liệu/kg có tác dụng làm giảm số lượng protein trong dịch rỉ viêm so với lô chứng (p < 0,05), với mức giảm là 50%. Tác dụng này tương đương với tác dụng của aspirin liều 200mg/kg (p > 0,05). Như vậy, cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 126,72g dược liệu/kg đã thể hiện tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây viêm màng bụng chuột cống trắng bằng carrageenin. Tác dụng chống viêm cấp của cao lỏng Vĩ Ngân phụ thuộc liều.
Tóm lại, cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 126, 72g dược liệu/kg có tác dụng chống viêm cấp trên chuột cống trắng thông qua làm giảm thể tích dịch rỉ viêm, giảm số lượng bạch cầu và protein trong dịch rỉ viêm. Tác dụng này phù hợp với tác dụng của các vị thuốc trong phương thuốc.
3.4.2.3.Tác dụng giảm ho
Codein có tác dụng giảm ho do ức chế trực tiếp trung tâm ho, nhưng làm khô và tăng độ quánh của dịch tiết phế quản. Dùng codein trong trường hợp ho khan gây khó chịu, mất ngủ và trong các chứng đau nhẹ và vừa. Đây là thuốc ho dùng khá
71
phổ biến nên trong nghiên cứu, codein được chọn làm thuốc đối chứng trên mô hình gây ho bằng khí amoniac ở chuột nhắt trắng.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 190,08g dược liệu/kg có tác dụng làm tăng thời gian tiềm tàng xuất hiện cơn ho và làm giảm số cơn ho của chuột nhắt trắng trên mô hình gây ho bằng amoniac. Tác dụng này tương đương với tác dụng của codein phosphate liều 20mg/kg.
3.4.2.4.Tác dụng long đờm
N- acetylcystein: Dùng làm thuốc tiêu chất nhày trong bệnh nhày nhớt, các bệnh lý hô hấp có đờm nhày quánh như trong viêm phế quản cấp hoặc mạn, làm thuốc giải độc khi dùng quá liều paracetamol. N- acetylcystein là một trong những thuốc long đờm sử dụng phổ biến nhất trên lâm sàng nên được chọn làm thuốc đối chứng trong mô hình thực nghiệm.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, cao lỏng Vĩ Ngân ở mức liều tương đương
190,08g dược liệu/kg có tác dụng long đờm thông qua làm tăng nồng độ phenol đỏ trong dịch rửa khí phế quản chuột nhắt trắng. Tác dụng này mạnh hơn tác dụng của N – acetylcystein liều 120mg/kg.
Như vậy, cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 190,08g dược liệu/kg có tác dụng giảm ho và long đờm trên chuột nhắt trắng, tác dụng này phù hợp với tác dụng của các vị thuốc trong phương thuốc.
