3.2.1.1. Định tính Flavonoid
Chiết xuất:
+ Lấy 0,5g cao lỏng, thêm 10 ml EtOH 90%. Đun cách thủy và lắc kĩ cho tan, lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc thu được dùng để tiến hành các phản ứng định tính.
+ Lấy 5g bột dược liệu, thêm 20 ml EtOH 90%. Đun cách thủy, lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc thu được dùng để tiến hành các phản ứng định tính.
- Phản ứng Cyanidin
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dung dịch thử. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10 mg). Nhỏ từng giọt HCl đặc (3 – 5 giọt). Để yên một vài phút.
Kết quả: Mẫu cao và các dược liệukim ngân hoa, xạ can, núc nác, cam thảo:
dung dịch có màu đỏ thẫm (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với kiềm loãng
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dung dịch thử. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%.
Kết quả: Mẫu cao và các dược liệu kim ngân hoa, xạ can, núc nác, cam thảo:
xuất hiện tủa vàng (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với hơi amoniac
Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ ammoniac đặc đã được mở nút. Nhỏ một giọt khác làm chứng.
Kết quả: Vết dịch chiết của cao và các dược liệu kim ngân hoa, xạ can, núc
nác, cam thảo: chuyển màu vàng đậm hơn (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dung dịch thử. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Kết quả:Mẫu cao và các dược liệu kim ngân hoa, xạ can, núc nác, cam thảo:
xuất hiện tủa màu xanh đen (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng diazo hóa
Cho 1 ml dung dịch thử vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng nhẹ.
33
Kết quả: Mẫu cao và dược liệu kim ngân hoa, xạ can, núc nác, cam thảo: có
kết tủa màu đỏ cam (Phản ứng dương tính).
Nhận xét:Cao lỏng và các dược liệu: kim ngân hoa, xạ can, núc nác, cam thảo có flavonoid.
3.2.1.2. Định tính coumarin
- Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1-2ml dịch chiết: + Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. + Ống 2: Để yên.
Đun cả 2 ống nghiêm đến sôi, để nguội, quan sát. Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều, quan sát. Thêm vào ống 1 vài giọt HCl, quan sát.
Kết quả: Tất cả các mẫu: ống 1: tủa đục, ống 2: trong suốt; sau khi thêm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nước cất và HCl: không có hiện tượng gì (Phản ứng âm tính). - Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy 10 phút, để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha.
Kết quả: Không có kết tủa (Phản ứng âm tính).
- Quan sát huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, nhỏ tiếp 1 giọt dung dịch NaOH 10%, sấy nhẹ cho đến khô. Che 1 nửa diện tích bằng một mẩu kim loại, soi đèn tử ngoại trong vài phút, bỏ miếng kim loại ra, tiếp tục chiếu sáng bị phần che sáng.
Kết quả: Không thấy sự khác biệt về màu sắc giữa 2 phần (Phản ứng âm tính).
Nhận xét:Cao lỏng và các dược liệu không có coumarin.
3.2.1.3. Định tính Saponin
- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Lấy 0,1g cao lỏng hoặc 1g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước, đun nóng nhẹ, lắc mạnh trong 2 – 3 phút, để yên.
Kết quả:Mẫu cao lỏng và các dược liệu cát cánh, kim ngân hoa, mạch môn,
34
Chiết xuất: Lấy 2g bột dược liệu, thêm 10 ml nước, đun sôi 10 phút, lọc nóng, dịch lọc thu được để tiến hành các phản ứng.
- Phản ứng Salkowski
+ Lấy 0,5 g cao lỏng, cô tạo cắn, thêm từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đặc. + Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 10 ml nước, đun sôi 10 phút, lọc nóng, cô dịch lọc đến cắn, thêm 2 ml dung dịch H2SO4 đặc.
Kết quả: Mẫu cao lỏng và các dược liệu cát cánh, kim ngân hoa, mạch môn,
thiên môn, cam thảo: xuất hiện màu đỏ đậm (Phản ứng dương tính). - Phản ứng Liebermann – Burchard
Lấy 1-2 ml cao lỏng hoặc 2 ml dịch lọc, cô tạo cắn, thêm vào 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm 450 , thêm từ từ từng giọt H2SO4 đặc.
Kết quả: Mẫu cao lỏng và các dược liệu cam thảo, cát cánh, mạch môn, thiên
môn, kim ngân hoa: có vòng màu đỏ tía ở mặt phân cách (Phản ứng dương tính).
Nhận xét: Cao lỏng và các dược liệu: cam thảo, kim ngân hoa, cát cánh, mạch môn, thiên môn có saponin.
3.2.1.4. Định tính Alcaloid
Chiết xuất: Lấy 0,5 g cao lỏng hoặc 5g dược liệu, cho vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch ammoniac 6N đến pH = 9-10, Chiết Alcaloid base bằng chloroform (3 lần x 5ml). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natrisulfat khan.
Tiến hành : Lấy một phần dịch chiết chloroform, lắc với acid sulfuric 1N 2 lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết. Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 – 3 giọt các thuốc thử sau:
+ Ống 1: Thuốc thử Mayer. + Ống 2: Thuốc thử Bouchardat. + Ống 3: Thuốc thử Dragendorff.
Kết quả: Cả 3 ống của tất cả các mẫu: không xuất hiện tủa (Phản ứng âm tính).
35
3.2.1.5. Định tính Glycosid tim
Chiết xuất: Lấy 5ml cao lỏng hoặc 4 g bột dược liệu, cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml EtOH 25%, ngâm 24h. Gạn lấy dịch chiết, thêm 3ml dd chì acetat 30% cho đến dư (tủa hết), khuấy đều, lọc qua giấy lọc gấp nếp (thử lại dịch lọc đến khi không còn tủa với chì acetat). Lắc dịch lọc với CHCl3 (2 lần x 5ml), chiết lấy lớp CHCl3, cho vào các ống nghiệm nhỏ, cô lấy cắn.
- Phản ứng Liebermann – Burchard
Thêm vào 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ, để nghiêng 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả: Không xuất hiện vòng màu tím đỏ và chất lỏng phía dưới màu
hồng, phía trên màu xanh lá (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng Baljet
Thêm vào 1ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (So sánh với ống chứng không có cắn).
Kết quả: Giữa 2 ống không có sự khác biệt (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng Keller – Kiliani
Thêm vào 0,5 ml EtOH 90%, lắc đều cho tan, thêm vài giọt dd FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều, nghiêng ống 450, thêm từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc.
Kết quả: Không xuất hiện vòng màu tím đỏ và lớp chất lỏng phía trên màu
xanh lá (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Cao lỏng và các dược liệu không có glycosid tim.
Chiết xuất: Lấy 0,5g cao lỏng hòa tan trong 20ml nước cất nóng, hoặc lấy 2g dược liệu, thêm 20 ml nước, đun sôi cách thủy 15 phút, lọc lấy dịch, để nguội. Dịch lọc để làm các phản ứng định tính tanin, acid hữu cơ, polysaccharid, đường khử, acid amin.
3.2.1.6. Định tính tanin
Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dịch lọc: + Ống 1: Thêm 2 giọt FeCl3 5% .
36
Kết quả: Mẫu cao lỏng và dược liệu: núc nác, kim ngân hoa, cát cánh: xuất
hiện tủa màu xanh đen (Phản ứng dương tính). + Ống 2: Thêm 2 giọt chì acetat 10%.
Kết quả: Mẫu cao lỏng và dược liệu:núc nác, kim ngân hoa, cát cánh: xuất
hiện tủa bông trắng (Phản ứng dương tính). + Ống 3: Thêm 5 giọt gelatin 1%.
Kết quả: Mẫu cao lỏng và dược liệu:núc nác, kim ngân hoa, cát cánh: xuất
hiện tủa bông trắng (Phản ứng dương tính).
Nhận xét: Cao lỏng và dược liệu:núc nác, kim ngân hoa, cát cánh có tanin.
3.2.1.7. Định tính acid hữu cơ
Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm to. Thêm một ít Na2CO3, lắc nhẹ.
Kết quả: Tất cả các mẫu: không có bọt khí (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Cao lỏng và các dược liệu không có acid hữu cơ.
3.2.1.8. Định tính polysaccharid
Cho 2ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 2 giọt thuốc thử Lugol.
Kết quả: Tất cả các mẫu: xuất hiện tủa màu xanh đen (Phản ứng dương tính).
Nhận xét: Cao lỏng và các dược liệu có polysaccharid.
3.2.1.9. Định tính đường khử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 1 ml dd Fehling A (TT) và 1ml dd Fehling B (TT), lắc kỹ, đun cách thủy.
Kết quả: Mẫu cao lỏng và các dược liệu sinh địa, thiên môn, huyền sâm, cam
thảo, cát cánh: xuất hiện tủa đỏ gạch (Phản ứng dương tính).
Nhận xét: Cao lỏng và các dược liệu: sinh địa, thiên môn, huyền sâm, cam
thảo, cát cánh có đường khử.
3.2.1.10. Định tính acid amin
Lấy 2ml dịch lọc, thêm 3 giọt thuốc thử Ninhydrin, đun cách thủy 2-3 phút.
Kết quả: Mẫu cao lỏng và các dược liệu: huyền sâm, sinh địa, thiên môn:
dung dịch có màu tím sẫm (Phản ứng dương tính).
Nhận xét:Cao lỏng và các dược liệu: huyền sâm, sinh địa, thiên môn có acid amin.
37
Kết quả định tính các nhóm chất trong cao lỏng và dược liệu bằng phương pháp hóa học được tóm tắt ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả định tính các nhóm chất trong cao lỏng và dược liệu
TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Cao XC CT KNH NN MM TM CC HS SĐ 1 Flavonoid - Cyanidin +++ +++ +++ +++ +++ - - - - - - Với FeCl3 5% +++ +++ ++ +++ +++ - - + - - -Với NaOH 10% +++ +++ +++ +++ ++ - - - - - - Với hơi NH3 +++ +++ +++ +++ ++ - - - - - - Diazo hóa +++ +++ +++ +++ ++ - - - - - 2 Saponin - Tạo bọt +++ - +++ +++ - +++ +++ ++ - - - Salkowski +++ - +++ +++ - +++ +++ ++ - - -Libermann- Burchard +++ - ++ ++ - ++ ++ ++ - -
3 Tanin -Với FeCl3 5% +++ +++ ++ +++ +++ - - + - -
-Với chì acetat +++ - - ++ ++ - - ++ - -
-Với gelatin1% ++ - - + + - - ++ - -
4 Glycosid tim - - - - - - - - - -
5 Alcaloid TT chung của
acaloid
- - - - - - - - - -
6 Coumarin - - - - - - - - - -
7 Acid amin -Với TT
Ninhydrin
+++ - - - - - +++ - ++ ++
8 Polysaccharid -Với TT Lugol +++ +++ ++ ++ + + + ++ + +
9 Đường khử - TT FehlingA,
Fehling B
+++ - + - - ++ ++ ++ ++ ++
10 Acid hữu cơ -Với Na2CO3 - - - - - - - - - - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chú thích: (-): phản ứng âm tính (+): phản ứng dương tính (++): phản ứng dương tính rõ (+++): phản ứng dương tính rất rõ
38
Nhận xét:
- Cao lỏng có flavonoid, saponin, tanin, acid amin, polysaccharid, đường khử. - Xạ can có flavonoid, polysaccharid.
- Cam thảo có flavonoid, saponin, polysaccharid, đường khử. - Kim ngân hoa có flavonoid, saponin, polysaccharid, tanin. - Núc nác có flavonoid, polysaccharid, tanin.
- Mạch môn có saponin, polysaccharid, đường khử.
- Thiên môn có saponin, acid amin, polysaccharid, đường khử. - Cát cánh có saponin, tanin, polysaccharid, đường khử. - Huyền sâm có acid amin, polysaccharid, đường khử. - Sinh địa có acid amin, polysaccharid, đường khử