a) Thử độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của thuốc thử trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon và theo hướng dẫn của WHO.
Mẫu nghiên cứu: Lấy 100 ml cao lỏng Vĩ Ngân (cao 5/1), cô cách thủy đến
nồng độ đặc nhất có thể (nhưng vẫn đảm bảo hút được bằng kim đầu tù), thu được 80ml. Như vậy, 1ml cao đặc Vĩ Ngân tương đương 6,25g dược liệu.
Tiến hành thí nghiệm
Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con.
Chuột được uống cao đặc Vĩ Ngân với mức liều từ thấp nhất (0,1ml/10g thể trọng) đến mức liều cao nhất (0,25ml/10g thể trọng), 3 lần trong 24 giờ. Mỗi lần cách nhau 2 giờ.
- Lô 1: Uống cao đặc Vĩ Ngân liều 0,1ml/10g thể trọng (Tương đương: 30ml/kg/24 giờ; 187,50g dược liệu/kg/24 giờ).
- Lô 2: Uống cao đặc Vĩ Ngân liều 0,15ml/10g thể trọng (Tương đương: 45ml/kg/24 giờ; 281,25g dược liệu/kg/24 giờ).
- Lô 3: Uống cao đặc Vĩ Ngân liều 0,2ml/10g thể trọng (Tương đương: 60ml/kg/24 giờ; 375,00g dược liệu/kg/24 giờ).
26
- Lô 4: Uống cao đặc Vĩ Ngân liều 0,25ml/10g thể trọng (Tương đương 75ml/kg/24 giờ; 468,75g dược liệu/kg/24 giờ).
Theo dõi tình trạng chung của chuột, mỗi 30 phút trong 6 giờ đầu, sau đó 1 – 2 giờ trong 24 giờ. Các thay đổi cần theo dõi như da, lông, mắt, hô hấp, tuần hoàn, thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thể hiện qua các triệu chứng quan trọng như nôn, nước bọt, run, co giật, kích động, khó thở, tím tái, tiêu chảy, ngủ lịm, hôn mê…, và số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc. Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc [17], [39], [41], [48], [88].
b) Tác dụng chống viêm cấp
Mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin trên chuột cống trắng
Tiến hành
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (chứng): uống nước cất liều 1ml/100g.
- Lô 2 (đối chiếu): uống aspirin liều 200mg/kg.
- Lô 3: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương (TĐ) 42,24g dược liệu/kg (Liều gấp 3 lần liều dự kiến trên lâm sàng).
- Lô 4: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương (TĐ) 126,72g dược liệu/kg (Liều gấp 9 lần liều dự kiến trên lâm sàng).
Chuột được uống nước hoặc thuốc 4 ngày liên tục trước khi gây viêm. Ngày thứ 4, sau khi uống thuốc thử 1 giờ, gây viêm bằng cách tiêm carrageenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) 0,1ml/chuột vào gan bàn chân sau, bên phải của chuột.
Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệt vào các thời điểm: trước khi gây viêm (V0); sau khi gây viêm 2 giờ (V2), 4 giờ (V4), 6 giờ (V6) và 24 giờ (V24). Kết quả được tính theo công thức của Fontaine.
Độ tăng thể tích chân của từng chuột (độ phù) được tính theo công thức:
100 V V V % V 0 0 t
27
Trong đó, V0: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm Vt là thể tích chân chuột sau khi gây viêm
Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%)
I% = Vc% - Vt% % Vc
×100
Trong đó, Vc%: Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô chứng Vt% : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô đối chiếu /lô thử [18], [39], [45], [49], [72]
Mô hình gây viêm màng bụng chuột bằng carragenin trên chuột cống trắng
Tiến hành
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô. Mỗi lô 10 con. - Lô 1 (chứng): uống nước cất 1ml/100g.
- Lô 2 (đối chiếu): uống aspirin liều 200mg/kg.
- Lô 3: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 42,24g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 126,72g dược liệu/kg. Chuột được uống nước hoặc thuốc 5 ngày liền trước khi gây viêm. Ngày thứ 5, sau khi uống thuốc thử 1 giờ, gây viêm màng bụng chuột bằng dung dịch: carrageenin 0,05g, formaldehyd 1,4 ml, pha vừa đủ trong 100ml nước muối sinh lý, với thể tích tiêm 1ml/100g vào ổ bụng mỗi chuột.
Sau gây viêm 24 giờ, mở ổ bụng chuột, hút dịch rỉ viêm, đo thể tích dịch rỉ viêm, định lượng bạch cầu và protein trong dịch rỉ viêm. So sánh thể tích dịch rỉ viêm, số lượng bạch cầu và protein trong dịch rỉ viêm giữa lô thử với lô chứng và lô đối chiếu [39].
d) Tác dụng giảm ho
Tiến hành
40 chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con.
- Lô 1 (chứng): uống nước cất, thể tích 0,2ml/10g. - Lô 2 (đối chiếu): uống codein phosphat liều 20 mg/kg.
28
- Lô 3: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 63,36 g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 190,08g dược liệu/kg. Chuột được uống nước hoặc thuốc thử liên tục trong 3 ngày vào các buổi sáng. Ngày thứ 3 sau khi uống thuốc thử 1 giờ, tiến hành gây ho cho cả 4 lô chuột bằng khí amoniac liều 0,5ml/bình thủy tinh chuyên dụng. Xác định thời gian tiềm tàng (t) là thời gian tính từ khi thả chuột vào bình đến khi chuột xuất hiện cơn ho đầu tiên và tổng số cơn ho trung bình trong 10 phút, so sánh mức độ tăng (t) và mức độ giảm số cơn ho của các lô thử so với lô chứng và lô đối chiếu.
e) Tác dụng long đờm Tiến hành
40 chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (chứng): uống nước cất với thể tích 20ml/kg/ngày.
- Lô 2 (đối chiếu): N-acetylcystein 120mg/kg (Gói 200 mg pha vừa đủ 30ml, uống 0,2 ml/10g).
- Lô 3: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 63,36g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều tương đương 190,08g dược liệu/kg. Cho chuột uống thuốc thử với liều như trên trong 3 ngày. Ngày thứ 3 (ngày cuối cùng) sau uống thuốc 1 giờ, tiêm màng bụng cho tất cả các chuột dung dịch phenol đỏ 0,25% với liều 25ml/kg. Sau 30 phút tiêm nhắc lại một liều như vậy.
Chờ 30 phút sau, giết chuột bằng gây ngạt hơi chloroform, bộc lộ khí quản và luồn vào đó một kim tù. Rửa khí quản bằng cách dùng bơm tiêm lấy 0,5ml dung dịch NaHCO3 5% bơm vào khí quản, hút nhẹ nhàng rồi chuyển vào trong một ống nghiệm đã được đánh dấu từ trước.
Làm như vậy 3 lần đối với mỗi con, tập trung dịch rửa của cùng một con trong một ống nghiệm (thể tích dịch rửa thu được của các chuột bằng nhau). Ly tâm dịch rửa lấy dịch trong. Đo độ hấp thụ quang (ABS) của dịch rửa khí quản ở bước sóng 265 nm.
Độ hấp thụ quang càng lớn thì khả năng long đờm càng tốt. So sánh độ hấp thụ quang trung bình của các lô thử so với lô chứng và lô đối chiếu [39].
29
Xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t-test Student bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (µ= ± SD) hoặc sai số chuẩn (µ= ± SE). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p ≤ 0,05.
* Khác biệt so với nhóm chứng với p ≤ 0,05 ** Khác biệt so với nhóm chứng với p ≤ 0,01 *** Khác biệt so với nhóm chứng với p ≤ 0,005 **** Khác biệt so với nhóm chứng với p ≤ 0,001
30
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát một số chỉ tiêu chung của cao lỏng
3.1.1. Hình thức, cảm quan
- Thể chất, màu sắc, mùi vị: Là chất lỏng hơi sánh, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ, màu nâu đen, có vị đắng, mùi thơm đặc trưng của dược liệu.
- Độ đồng nhất: Lấy một ít cao, dàn đều trên lam kính, đặt lamen ép sát. Quan sát dưới kính hiển vi, nhận thấy cao thuốc đồng nhất, không có kết tủa, không phân lớp.
- Độ tan: Lấy 1g cao, hòa với 25ml nước, cao tan hoàn toàn.
3.1.2. Xác định hàm lượng nước trong cao lỏng
Cân chính xác khoảng 1,0000g cao thuốc, cho vào chén sứ (đã cân bì). Đun cách thủy đến cắn khô. Sấy ở 105°C đến khối lượng không đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5mg). Cho vào bình hút ẩm, làm nguội tới nhiệt độ phòng, rồi cân ngay. Làm 3 lần, tính kết quả trung bình.
Hàm lượng nước trong cao lỏng được tính theo công thức:
X(%)=M-m
M .100%
Trong đó: X: Hàm lượng nước của cao thuốc (%) M: Khối lượng cao trước khi làm khô (g) m: Khối lượng cao sau khi khi làm khô (g) Kết quả được ghi ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định hàm lượng nước trong cao lỏng
Lần M (g) m (g) X (%) (%)
1 1,0376 0,5624 45,80 45,94
2 1,1173 0,6211 44,41
3 1,1127 0,5829 47,61
31
3.1.3. Xác định chất chiết được bằng EtOH 70% trong cao thuốc
- Cân chính xác khoảng 4,0000g cao thuốc, cho vào bình nón nút mài 250ml. - Thêm chính xác 100,0 ml EtOH 70%, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6 giờ đầu. Sau đó để yên 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 20ml dịch lọc, cho vào một cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105°C trong 3 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy và tính % chất chiết được trong dịch lọc theo công thức:
A(%) = 5m.10
4
M(100-X) Trong đó,
A: Hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70% m: Khối lượng cắn của 20ml dịch lọc (g) M: Khối lượng cao thuốc (g)
X: Mất khối lượng do làm khô của cao thuốc (%)
Làm 3 lần, tính kết quả trung bình. Kết quả được ghi ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70%
Lần M (g) m (g) X (%) A (%) ATB (%)
1 4,0623 0,2547 45,94 57,99 58,20
2 4,0716 0,2565 58,27
3 4,1604 0,2624 58,33
Nhận xét: Hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70% trong cao lỏng Vĩ
Ngân là 58,20%