Nghiên cứu thành phần hoá học của thân cây an xoa (helicteres hirsuta lour ) ở bá thước, thanh hoá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC LÊ ANH TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA THÂN CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) Ở BÁ THƯỚC, THANH HOÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THANH HÓA, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC LÊ ANH TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA THÂN CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) Ở BÁ THƯỚC, THANH HỐ LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 844.01.14 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Hoa THANH HÓA, NĂM 2022 Danh sách Hội đồng chấm luận văn Thạc sỹ khoa học (Theo Quyết định số : / QĐ- ĐHHĐ ngày tháng năm 2022 Hiệu trưởng Trường Đại học Hồng Đức) Học hàm, học vị Họ tên Chức danh Cơ quan Công tác Hội đồng Chủ tịch HĐ UV Phản biện UV Phản biện Uỷ viên Thư ký Xác nhận Người hướng dẫn Học viên chỉnh sửa theo ý kiến Hội đồng Ngày tháng năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn khơng trùng lặp với khóa luận, luận văn, luận án cơng trình nghiên cứu công bố Người cam đoan Lê Anh Tuấn i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành kính trọng sâu sắc tới TS Lê Thị Hoa - giảng viên trường Đại học Hồng Đức tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tác giả suốt q trình hồn thành luận văn Tác giả xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, khoa KHTN-Trưòng đại học Hồng Đức tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả suốt trình học tập trường Qua tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành thầy giáo mơn hóa học - Khoa KHTN- Trường Đại học Hồng Đức đọc, đánh giá cho ý kiến quý báu để luận văn phong phú hoàn thiện Tác giả xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn đồng nghiệp, Ban giám hiệu trường THPT Hà Văn Mao, người động viên tạo điều kiện tốt để tác giả hồn thành khóa học Tuy có nhiều cố gắng thời gian khả nghiên cứu hạn chế nên luận văn cịn thiếu sót khó tránh khỏi Tác giả mong nhận đóng góp ý kiến thầy bạn đồng nghiệp để luận văn hoàn thiện Luận văn thực hoàn thành trường đại học Hồng Đức, tỉnh Thanh Hoá hướng dẫn TS Lê Thị Hoa Thanh Hóa, tháng năm 2022 Học viên Lê Anh Tuấn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU………………………………………………………………… … 1 Lý chọn đề tài 2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu đề tài Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu Chương TỔNG QUAN…………………………………………………… 1.1 Giới thiệu chung chi Dó (Helicteres) 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Dó (Helicteres) 1.1.2 Một số lồi thuộc chi Dó (Helicteres) Việt Nam 1.1.3 Một số kết nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Dó 1.1.4 Thành phần hóa học số lồi chi Dó Helicteres 1.2 Cây An xoa Helicteres hirsuta Lour 12 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố An xoa Helicteres hirsuta Lour……………………………………………………………………………13 1.2.2 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Helicteres hirsuta Lour (An xoa) 13 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 19 2.1 Phương pháp nghiên cứu 19 2.1.1 Phương pháp lấy mẫu xử lý mẫu 19 2.1.2 Phương pháp tách, phân lập chất 19 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất 19 2.2 Hoá chất thiết bị 19 2.2.1 Hoá chất 19 iii 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 20 2.3 Thực nghiệm 20 2.3.1 Thu mẫu xử lý mẫu 20 2.3.2 Xử lý cao chiết tách chất 21 2.4 Dữ liệu phổ hợp chất phân lập 23 2.4.1 Oleanolic acid (A1) 23 2.4.2 18α-oleanolic acid………………………………………………………24 2.4.3 Stigmasterol (A3)……………………………………………………….25 2.5 Thử hoạt tính chống oxi hóa A1…………………………………… 25 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Xác định cấu trúc hợp chất A1 27 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất A2 36 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất A3 45 3.4 Thử hoạt tính chống oxi hóa A1 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Được hiểu Kí hiệu, chữ viết tắt MS (ESI MS) Phổ khối (Electro spay Ionization) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ proton H NMR 13 C NMR Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 TLC Sắc ký lớp mỏng A1 Oleanolic acid A2 Epi oleanolic acid A3 Stigmasterol v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Giá trị phổ 1H-NMR 13C-NMR chất A1 so với tài liệu tham khảo 28 Bảng 3.2 Giá trị phổ 1H-NMR 13C-NMR chất A2 so với tài liệu tham khảo 37 Bảng 3.3 Giá trị phổ 1H-NMR 13C-NMR chất A3 so với tài liệu tham khảo [c] 46 vi DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Thân Helicteres viscida Bl [trích nguồn Ydhvn.com]………….4 Hình 1.2 Cây Helicteres angustifolia L [trích nguồn Ydhvn.com]………… Hình 1.3 Cây Helicteres glabriuscula Wall Hình 1.4 Cây An xoa thu hái Bá Thước, Thanh Hóa………………… ….12 Hình 3.1 Phổ khối lượng (MS) hợp chất A1 29 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR hợp chất A1 30 Hình 3.3 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất A1 31 Hình 3.4 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất A1 32 Hình 3.5 Phổ 13C-NMR hợp chất A1 33 Hình 3.6 Phổ 13C-NMR giãn hợp chất A1 34 Hình 3.7 Phổ DEPT hợp chất A1 35 Hình 3.8 Phổ DEPT hợp chất A1 36 Hình 3.9 Phổ khối lượng (GC-MS) hợp chất A2 38 Hình 3.10 Phổ 1H-NMR hợp chất A2 39 Hình 3.11 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất A2 40 Hình 3.12 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất A2 41 Hình 3.13 Phổ 13C-NMR hợp chất A2 42 Hình 3.14 Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất A2 43 Hình 3.15 Phổ DEPT hợp chất A2 44 Hình 3.16 Phổ DEPT hợp chất A2 44 Hình 3.17 Phổ GC-MS hợp chất A3 47 Hình 3.18 Phổ 1H-NMR hợp chất A3 48 Hình 3.19 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất A3…………………………49 vii Hình 3.15 Phổ DEPT hợp chất A2 Hình 3.16 Phổ DEPT hợp chất A2 43 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất A3 Chất A3 thu có dạng tinh thể hình kim màu trắng màu tím hồng với vanilin Phổ MS chất A3 cho thấy pic ion M+ m/z 412.0 cho phép dự đốn cơng thức phân tử H-NMR (500 MHz CD3OD) δH (ppm): Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu cộng hưởng proton olefin, proton olefin mạch hở dạng HC=CH δH 5.16 (dd, 1H, J = 8.5; 15.0 Hz) 5.02 (dd, 1H, J = 8.5; 15.0 Hz), cịn có tín hiệu đặc trưng cho proton liên kết đôi dạng >C=CH C5 C6 khung stigmastan δH 5.35 (m, 1H) Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton liên kết với -COH 3.52 (m, 1H, H-3) proton nhóm methyl δ 1.02 (d, 3H, J = 6.5 Hz) 1.01 (s, 3H) 0.85 (d, 3H, J = 6.5 Hz) 0.81 (t, 3H, J = 7,0 Hz) 0.80 (d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.70 (s 3H) 13 C NMR (125 MHz CD3OD) δ (ppm): Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất A3 thể tín hiệu cộng hưởng 29 carbon có carbon olefin δC 140.77; 138.33; 129.28; 121.74 ppm; carbon liên kết với -OH δC 71.83 ppm nhóm CH3 Từ chứng phổ nói chất A3 xác định sterol có tên gọi stigmasterol Từ liệu phổ khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân phân tích gợi ý hợp chất A3 hợp chất stigmasterol hay Stigmasta-5,22-dien-3β-ol So sánh với nghiên cứu Venkata Sai Prakash Chaturvedula cộng [38] stigmasterol cho thấy tương đồng số liệu phổ tương ứng Bảng 3.3 Giá trị phổ 1H-NMR 13C-NMR chất A3 so 44 với tài liệu tham khảo [38] Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 H-NMR δH (ppm) Chất A3 Tài liệu [38] 3.52 (m, 1H) 5.35 (m, 1H) 3.51(tdd, 1H, J =4.5,4.2,3.8 Hz) 5.31 (t, 1H, J = 6.1 Hz) - - - - 1.02 (d, 3H, J = 6.5 Hz) 0.91(d, 3H, J = 6.2Hz) 45 C-NMR δC(ppm) Chất A3 Tài liệu [38] 37.32 37.6 33.95 32.1 13 71.83 72.1 42.33 121.74 42.4 121.8 140.77 141.1 31.73 31.96 50.14 36.16 21.14 39.83 42.33 56.78 24.34 28.29 56.06 40.51 31.8 31.8 50.2 36.6 21.5 39.9 42.4 56.8 24.4 29.3 56.2 40.6 19.83 21.7 20 21 22 23 24 25 26 5.02 (dd, 1H, J = 8.5; 15.0 Hz) 5.16 (dd, 1H, J = 8.5; 15.0 Hz) 0.81 (t, 3H, J = 7.0 Hz) 4.98 (m, 1H) 5.14 (m, 1H) 0.83 (t, 3H, J = 7.1 Hz) 28 0.85 (d, 3H, J = 6.5 Hz) 0.80 (d, 3H, J = 6.5 Hz) 0.70 (s, 3H) 0.82 (d, 3H, J = 6.6 Hz) 0.80 (d, 3H, J = 6.6 Hz) 0.71 (s, 3H) 29 1.01 (s, 3H) 1.03 (s, 3H) 27 138.33 138.7 129.28 129.6 45.85 26.11 46.1 25.4 11.99 12.1 29.16 29.6 19.41 20.2 19.04 19.8 18.79 18.9 12.06 12.2 Các giá trị phổ thu hình sau đây: Hình 3.17 Phổ GC/MS hợp chất A3 46 Hình 3.18 Phổ 1H-NMR hợp chất A3 47 Hình 3.19 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất A3 Hình 3.20 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất A 48 Hình 3.21 Phổ 13C-NMR hợp chất A3 Hình 3.22 Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất A3 49 Hình 3.23 Phổ DEPT hợp chất A3 Hình 3.24 Phổ DEPT hợp chất A3 50 Hình 3.25 Phổ DEPT hợp chất A3 3.4 Kết thử hoạt tính chống oxi hóa A1 STT Tên mẫu A1 Phần trăm (%) ức chế nồng độ µg/mL 256 64 16 81 53,5 22 16 Chất tham khảo Acarbose Giá trị IC50 (g/mL) 58,65±1,20 77.11 ± 2,51 Từ bảng kết cho thấy, mẫu chất A1 biểu hoạt tính chống oxi hóa với giá trị IC50 = 58.65 g/mL 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Quá trình nghiên cứu thành phần hóa học hợp chất tách chiết từ dịch chiết dịch chiết ethanol thân An Xoa với tên khoa học Helicteres hirsuta Lour., TS Triệu Anh Trung - Khoa Sinh học trường ĐHSP Hà Nội nhận dạng, thu kết sau: Đã thực trình tách chiết chất từ thân An Xoa với tên khoa học Helicteres hirsuta Lour dung môi hệ dung môi khác Đã sử dụng phương pháp tinh chế khác tách ba hợp chất Bằng phương pháp phân tích lý hóa đại như: xác định ba hợp chất tách là: acid oleanolic (A1), 18α-oleanolic acid (A2) stigmasterol (A3) Đã thử hoạt tính chống oxi hóa hợp chất A1, kết cho thấy A1 thể hoạt tính chống oxi hóa 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Trương Thị Bảy, Đỗ Thị Hồng Tươi (2020), “Khảo sát độc tính cấp đường uống tác động phịng ngừa xơ gan cao nước an xoa (H hirsuta L.) chuột nhắt gây xơ gan CCl4”, Ho Chi Minh City Journal of Medicine, 24(2), pp 265 – 271 [2] Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học [3] Nguyễn Hữu Duyên Lê Thanh Phước (2016), “Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào hep-g2 an xoa (Helicteres hirsuta L.)”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 47, pp 93-97 [4] Lê Trung Hiếu , Lê Lâm Sơn, Hồ Xuân Anh Vũ, Đặng Thị Thanh Hoa, Trần Thị Văn Thi (2019), “Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ an xoa (helicteres hirsuta lour.) Tỉnh Thừa Thiên Huế”, Tạp Chí Khoa Học Cơng Nghệ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế, 14, (2), pp 19 [5] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ tập TIẾNG ANH [6] B Ramesh Babu, P Krishnamoorthy, N Deepthi and M Nissi (2013),“Evaluation of antioxidants and molecular docking studies of Helicteres isora fruit extracts”, Journal of Drug Delivery & Therapeutics, (1), pp 33-35 [7] Bean M F., Antoun M., Abramson D., Chang C T., Mclaughlin J L., Cassady J M., (1985), “Cucurbitacin B and isocucurbitacin B: cytotoxic components of Helicteres isora”, Journal of Natural Products, 48, pp 500-508 [8] Bhavsar, S.K., Singh, S., Giri, S., Jain, M.R., Santani, D.D., (2009),“Effect of saponins from Helicteres isora on lipid and glucose metabolism regulating genes expression”, J Ethnopharmacol, 124, pp 426–433 53 [9] Cordell G A, Chang P T., Fong H H., Farnworth N R, (1977), “Xylosmacin, a new phenolic glucoside ester from Xylosma velutina (Flacourtiaceae)”, Journal of Natural Products, 40, pp 340-343 [10] Chakrabarti R., Vikramadithyan R.K., Mullangi R., Sharma V.M., Jagadheshan H., Rao Y.N., Sairam P., Rajagopalan R., (2002), “Antidiabetic and hypolipidemic activity of Helicteres isora in animal models”, J Ethnopharmacol, 81, 343–349 [11] Chang Y-S., Ku Y-R, Lin J-H., Lu K-L, Ho L-K., (2001), “Analysis of three lupane type triterpenoids in Helicteres angustifolia by highperformance liquid chromatography”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26, pp 849-855 [12] Chen ZT, Lee SW, Chen CM (1994), “New flavonoid glycosides of Helicteres angustifolia”, Heterocycles, 38, pp 1399–1406 [13] Chen L., Qiu W., Tang J., Wang Z F and He S Y., (2011), “Synthesis and bioactivity of novel nitric oxide-releasing ursolic acid derivatives”, Chinese Chemical Letters, 22, pp 413-416 [14] Chen W., Tang W., Lou L., Zhao W., (2006), “Pregnan, coumarin and lupane derivatives and cytotoxic constituents from Helicteres angustifolia”, Phytochemistry, 67, pp 1041-1047 [15] Chin YW, Jones WP, Rachman I, Riswan S, Kardono LB, Chai HB, Farnsworth NR, Cordell GA, Swanson SM, Cassady JM, Kinghorn AD (2006), “Cytotoxic lignans from the stems of Helicteres hirsuta collected in Indonesia”, Phytother Res, 20, pp 62–65 [16] Chiung Y-L, Hayashi H, Matsumoto H et al., (1994), “New metabolites, tetrahydrofuran lignans, produced by Strepto-myces sp IT-44”, J Antibiot, 47, pp 487–491 [17] De-Eknamkul W., Potduang B., (2003), “Biosynthesis of β-sitosterol and stigmasterol in Croton sublyratus proceeds via a mixed origin of isoprene units”, Phytochemistry, 62, pp 389-398 54 [18] Desai H K., Gawad D H., Joshi B.S., Parthasarathy P.C.(1997), “Ravindranath K R., Saindane M T., Sidhaye A R and Viswanathan N.”, Indian Journal of Chemistry, 14B, pp 291 [19] Didna B., Debnath S., Harigaya Y., (2007), “Naturally occurring iridoids A review, Part 1”, Chem Pharm Bull., 55 (2), pp 159-222 [20] Gohari AR, Saeidnia S, Hadjiakhoondi A, Abdoullahi M, Nezafati M (2009), “Isolation and Quantificative Analysis of Oleanolic Acid from Satureja mutica Fisch & C A Mey”, Journal of Medicinal Plants, 8(5), pp 65-69 [21] Kamiya K, Saiki Y, Hama T, Fujimoto Y, Endang H, Umar M, Satake T (2001), “Flavonoid glucuronides from Helicteres isora.”, Phytochemistry, 57, pp 297-301 [22] Kubitzki, K., Bayer, C., (2003), “Flowering Plants∙Dicotyledons: Malvales, Capparales, and Non-betalain Caryophyllales In The Families and Genera of Vascular Plants”, Springer-Verlag, Berlin, 5, pp 259– 260 [23] Kumar, G., Banu, G.S., Murugesan, A.G., Pandian, M.R., (2006), “Hypoglycaemic effect of Helicteres isora bark extract in rats”, J Ethnopharmacol, 107, pp 304–307 [24] Libman A., Bouamanivong S., Southavong B., Sydara K., Soejarto D.D., (2006), “Medicinal plants: an important asset to health care in a region of Central Laos”, J.Ethnopharmacol, 106, pp 303–311 [25] Nguyen Van Ky, Nguyen Huu Duyen, Le Thanh Phuoc (2019), “Derivatives of triterpene isolated from the dichloromethane extract of Helicteres hirsuta lour.”, AGU International Journal of Sciences, (4), pp 12 – 19 [26] Pan M-H, Chen C-M., Lee S-W and Chen Z-T., (2008), “Cytotoxic triterpenoids from the root bark of Helicteres angustifolia”, Chemistry and Biodiversity, 5, pp 565-574 55 [27] Pan H., Lundgren L N., Andersson R., 1994, “Triterpene ca eates from bark of Betula pubescens”, Phytochemistry, 37, pp 795–799 [28] Dang Ngoc Quang, Pham Thanh Chung, Le Thi Khanh Linh, Ta Ngoc Quynh, Dang Kim Ngoc, Hoang Thi Nhung, Pham Huu Dien (2019), “Cytotoxic constituents from Helicteres hirsuta collected in Vietnam”, Natural product research, 34(4), pp 585-589 [29] Ramesh P, Yuvarajan CR (1995), “A new flavone methyl ether from Helicteres isora”, J Nat Prod, 58, pp 1242–1243 [30] Satake T , Kamiya K., Saiki Y., Hama T., (1999), “Studies on the constituents of fruits of Helicteres isora L”, Chem Pharm Bull, 47 (10), pp 1444-1447 [31] Tezuka Y., Terazono M., Kusumoto TI., Kawashima Y., Hatanaka Y., Kadota Y., Hattori M., Namba T., Kikuchi T., Tanaka K., Supriyatna S (1999), “Helisterculins A and B, two new (7.50,8.20)-neolignans and helisorin the first (6.40,7.50,8.20)-neolignan, from the Indonesian medicinal plant Helicteres isora.”, Helv Chim Acta, 82, pp 408–417 [32] Tezuka Y., Terazono M., Kusumoto T I, Hatanaka Y., Kadota S., Hattoti M., Namba T and Kikuchi T., (2000), “Helicterins A-F, six new dimeric (7.5’,8.2’)- neolignans from the Indonesian medicinal plant Helicteres isora”, Helvetica Chimica Acta, 83, pp 2908-2919 [33] Pham Hong Ngoc Thuy, Nguyen Van Tang, Vuong Van Quan, Michael CB., Christopher JS, (2015), “Effect of Extraction Solvents and Drying Methods on the Physicochemical and Antioxidant Properties of Helicteres hirsuta Lour Leaves”, Technologies, 3, pp 285-301 [34] Pham Hong Ngoc Thuy, Nguyen Van Tang, Vuong Van Quan, Michael C Bowyer, Christopher J Scarlett., (2016), “Bioactive Compound Yield and Antioxidant Capacity of Helicteres hirsuta Lour Stem as Affected by Various Solvents and Drying Methods”, Journal of Food processing and preservation, 41 (1), pp 1-9 56 [35] Pham Hong Ngoc Thuy, Vuong Van Quan , Michael C Bowyer, Christopher J Scarlett (2020), “In vitro anti-pancreatic cancer activity of HPLC-derived fractions from Helicteres hirsuta Lour stem”, Molecular Biology Reports, 47(2), pp 897-905 [36] Pham Hong Ngoc Thuy , Jennette A Sakoff, Danielle R Bond, Vuong Van Quan, Michael C Bowyer, Christopher J Scarlett, 2018, “In vitro antibacterial and anticancer properties of Helicteres hirsuta Lour leaf and stem extracts and their fractions”, Molecular Biology Reports, 45 (6), pp 2125-2133 [37] Truiti M.C.T., Ferreira I.C.P., Zamuner M.L.M., Nakamura C.V., Sarragiotto M.H., Souza M.C., (2005), “Antiprotozoal and molluscicidal activities of five Brazilian plants”, Braz J Med Biol Res, 38, pp 1873– 1878 [38] Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Indra Prakash (2012), “Isolation of Stigmasterol and β-Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus”, International Current Pharmaceutical Journal, 1(9), pp 239-242 [39] Venkatesh S., Laxmi K.S., Reddy B.M., Ramesh M., (2007), “Antinociceptive activity of Helicteres isora”, Fitoterapia, 78, pp 146–148 [40] Werner Seebacher, Nebojsa Simic, Robert Weis, Robert Saf and Olaf Kunert (2003), “Complete assignments of 1H and 13C NMR resonances of oleanolic acid, 18α-oleanolic acid, ursolic acid and their 11-oxo derivatives”, Magnetic Resonance In Chemistry, 41, pp 636–638 [41] Yu Z., Zhang T., Zhou F., Xiao X., Ding X., He H., Rang J., Quan M., Wang T., Zuo M (2015), “Anticancer activity of saponins from Allium chinense against the B16 melanoma and 4T1 breast carcinoma cell”, Evid Based Complement Altern Med, pp 1-12 57