3.1. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong cao chiết etanol từ cây An xoa
Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong cao chiết etanol từ cây An xoa được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1.Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong cao chiết etanol từ cây
An xoa Nhóm hợp chất Thuốc thử và cách thực hiện Kết quả Alkaloid Dragendorff + Bouchardat + Anthraquinol Amoniac 10% - Plavonoid Phản ứng NaOH 10% + FeCl3 5% +
Steroid Acid sunfuric +
Triterpenoid Anhydric acetic +
Coumarin Mở đóng vịng lacton -
Saponin Phản ứng tạo bọt +
Tamin Chì acetat +
Qua bảng 3.1 ta thấy: cao chiết từ cây An xoa cho phản ứng dương tính với các thuốc thử nhóm lớp chất: flavonoids, saponin, ancaloid, steroid, triterpenoid và tamin.
- Trong thử nghiệm phản ứng giữa dung dịch FeCl3 5% vào hỗn hợp dịch chiết ethanol của cây An xoa (cao chiết + nước), kết quả dung dịch chuyển thành màu xanh đen đặc trưng cho thấy sự có mặt của flavonoids trong cao chiết. Kết quả này một lần nữa được khẳng định trong thử nghiệm phản ứng giữa cao chiết với NaOH 10%. Khi cho NaOH 10% vào hỗn hợp dung dịch cao chiết, dung dịch cao chiết chuyển sang màu vàng, tiếp tục nhỏ acid hydrochloric và dung dịch, màu vàng của dung dịch sẽ nhanh chóng mất đi.
- Trong thử nghiệm định tính saponin sau khi tiến hành thử nghiệm xuất hiện cột bọt kéo dài hơn 15 phút điều này chứng tỏ trong thành phần cao chiết có mặt các hợp chất thuộc lớp chất saponin.
- Sau khi tiến hành thử nghiệm phản ứng với thuốc thử Bouchardat, kết quả thu được là kết tủa nâu đỏ, điều này chứng tỏ trong thành phần hóa học của cao chiết có các hợp chất thuộc lớp chất ancaloid. Kết quả này một lần nữa được khẳng định qua phản ứng của cao chiết với thuốc thử Dragendoff.
- Sau khi tiến hành thử nghiệm kết quả thu được là xuất hiện một vòng nâu đỏ ở vùng tiếp xúc với 2 chất lỏng màu xanh lục trong lớp phân tách, điều này chứng tở trong
18
thành phần hóa học của cao chiết có các hợp chất steroid và triterpenoid. Kết quả này một lần nữa được khẳng định qua phản ứng của cao chiết với Anhydric acetic.
- Cùng với kết quả thử nghiệm chuyển thành màu xanh đen khi nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 5% vào dịch chiết. Kết quả thử nghiệm dịch chiết với chì acetate dung dịch tạo ra kết tủa vàng chứng tỏ rằng trong thành phần cao chiết cây Sài đất có các hợp chất thuộc lớp chất tannin.
Như vậy trong cao chiết của cây An xoa có chứa các hợp chất thuộc lớp chất: flavonoids, saponin, ancaloid.
3.2. Kết quả khảo sát độc tính cấp của cao chiết ethanol từ cây An xoa trên chuột thí nghiệm nghiệm
Độc tính cấp được xác định theo phương pháp của Bộ Y tế ban hành với mục tiêu nhằm xác định LD50 của cao chiết ethanol từ cây An xoa. Sau khi cho chuột uống cao chiết, quan sát, theo dõi biểu hiện và hoạt động của chuột trong thời gian 24h và 72h.
Kết quả thí nghiệm kiểm tra độc tính cấp của mẫu cao chiết ethanol từ cây An xoa được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độc tính cấp của cao chiết ethanol từ cây An xoa trên
chuột thí nghiệm Lơ Cao chiết ethanol từ cây An xoa (mg/kgP/lần) Số chuột chết/ số chuột sống (sau 72 giờ)
Biểu hiện chức năng trong vòng 24 giờ
1 125 0/6
Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng và âm thanh tốt.
2 250 0/6
Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng và âm thanh tốt.
3 500 0/6
Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng và âm thanh tốt.
4 1000 0/6
Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng và âm thanh tốt.
5 Đối chứng
sinh lý 0/6
Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ với ánh sáng và âm thanh tốt.
19
Kết quả trên cho thấy, sau khi uống cao chiết ethanol từ cây An xoa chuột ở các nhóm thuộc các lơ 1, 2, 3 và 4 đều có biểu hiện tốt, ăn uống bình thường khơng có sự khác biệt so với nhóm đối chứng sinh lý ở lơ 5. Trong q trình khảo sát khơng ghi nhận dấu hiệu chuột bị chết hay ngộ độc.
Từ kết quả khảo sát độc tính cấp cho thấy cao chiết ethanol từ cây An xoa an toàn cho chuột ở các nồng độ thực nghiệm, chưa xác định được độc tính cấp và chưa xác định được giá trị nồng độ gây chết LD50 của cao chiết.
Dựa vào kết quả trên, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa của cao chiết ethanol từ cây An xoa.
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết etanol từ cây An xoa
Để khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết etanol từ cây An xoa chúng tôi sử dụng mơ hình gây tổn thương gan bằng Paracetamol với liều 400mg/kgP, paracetamol được pha trong dung dịch sinh lý với nồng độ 50mg/ml. Kết quả thu được trong mơ hình nghiên cứu này cho phép đánh giá sơ bộ hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết etanol từ cây An xoa.
3.3.1. Kết quả quan sát trực quan gan chuột ở các nhóm thực nghiệm
Kết quả quan sát trực quan gan chuột các nhóm thực nghiệm được trình bày ở bảng 3.3 và các hình 3.1
Bảng 3.3. Quan sát mô bệnh học đại thể của gan chuột
Nhóm Quan sát hình thái trực quan gan
Chứng sinh lý Gan bình thường như mơ gan đồng nhất, màu hồng Chứng bệnh lý Gan nhạt màu, nhu mô gan to nổi rõ
Chứng tham khảo Gan hơi nhạt màu, nhu mô gan hơi to Cao chiết
125mg/kgP
Gan hơi nhạt màu, nhu mô gan hơi to Cao chiết
250mg/kgP
Gan hơi nhạt màu, nhu mô gan hơi to Cao chiết
500mg/kgP
Gan hơi nhạt màu, nhu mơ gan hơi to
20
b. Nhóm chứng bệnh lý
c. Nhóm chứng tham khảo (uống Silymarin)
21
e. Nhóm uống Cao chiết ethanol từ cây An xoa (250mg/kgP)
f. Nhóm uống Cao chiết ethanol từ cây An xoa (500mg/kgP)
Hình 3.1. Đại thể và nhu mơ chuột
Kết quả quan sát mô bệnh học đại thể gan chuột ở bảng 3.2 và các hình 3.1 cho thấy ở nhóm chứng bệnh lý gan có màu nhạt, nhu mơ gan nổi rõ. Thuốc Paracetamol được xem là an toàn ở liều điều trị nhưng khi dùng quá liều sẽ dẫn đến tổn thương gan. Khi thuốc theo máu đến gan, tại đây xảy ra q trình chuyển hóa thuốc. Các enzym có ở trong gan sẽ tham gia chuyển hóa Paracetamol thành những chất chuyển hóa phân cực. Một trong những sản phẩm của q trình chuyển hóa này là chất hóa học trung gian như N- acetyl -p- benzoquiononimin (NAPQI), đây là chất có thể tấn công các đại phân tử dẫn đến tổn thương tế bào gan. Khi bị tổn thương, tế bào gan và ống mật sẽ dẫn đến tình trạng tích tụ axit mật ở trong gan, đây là nguyên nhân làm cho ti thể và mạng lưới nội sinh chất của tế bào bị stress dẫn đến gia tăng quá trình tổn thương gan cũng như tăng nguy cơ gan bị tổn thương bởi các cơ chế khác[6].
Ở các nhóm uống cao chiết với các nồng độ khác nhau và nhóm uống sylimarin thì gan hơi nhạt màu hơn so với nhóm sinh lý nhưng lại sáng màu hơn so với nhóm chứng bệnh lý và nhu mô gan hơi to. Điều này chứng tỏ mức độ tổn thương gan ở các nhóm này giảm .
Như vậy, qua việc quan sát mô bệnh học, các nhóm uống cao chiết cây An xoa đã có tác dụng bảo vệ gan, giảm tổn thương gan dưới tác động của Paracetamol liều cao.
3.3.2. Kết quả ảnh hưởng của cao chiết đến các chỉ số GOT, GPT
Để tiếp tục chứng minh hoạt tính bảo vệ của cao chiết ethanol từ cây An xoa, sự thay nồng độ 2 enzym trao đổi amin (transaminase) là GOT (Serum glutamic oxaloacetic
22
transamina) và GPT (Serum glutamic pyruvic transamina) trong huyết thanh của các nhóm chuột nghiên cứu được khảo sát. Kết quả được trình bày quá bảng 3.4.
Kết quả ảnh hưởng của cao chiết đến các chỉ số GOT, GPT được trình bày qua bảng 3.4 và biểu đồ 3.1
Bảng 3.4. Nồng độ enzyme GOT, GPT trong huyết thanh của chuột gây tổn thương
gan bằng Paracetamol
Nhóm GOT (U/L) GPT (U/L)
Chứng sinh lý 2,08±0,18 2±0,12 Chứng bệnh lý 7,66±0,95 13,92±2,42 Chứng tham khảo 2,17±0,35 (98,38) 3,17±0,35 (90,18) Cao chiết 125mg/kgP 3,08±0,18 (82,08) 5,08±0,64 (74,16) Cao chiết 250mg/kgP 3,67±0,24 (71,51) 5,33±0,83 (72,06) Cao chiết 500mg/kgP 4,67±0,47 (53,58) 7,17±0,71 (56,63)
* Hiệu quả bảo vệ được tính bằng 100 x (giá trị kiểm soát parcetamol –giá trị mẫu nghiên cứu)/ giá trị kiểm sốt paracetamol – giá trị bình thường)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Sinh lý Bệnh lý Tham khảo Cao 125mg/kgP Cao 250mg/kgP Cao 500mg/kgP GOT GPT
23
Biểu đồ 3.1. Nồng độ enzyme GOT, GPT trong huyết thanh của chuột gây tổn
thương gan bằng Paracetamol Qua bảng 3.4 và biểu đồ 3.1 cho thấy:
Nhóm uống cao chiết etanol từ cây An xoa với ba mức liều 125mg/kgP, 250mg/kgP và 500mg/kgP có nồng độ GOT, GPT giảm so với nhóm đối chứng bệnh lý và nhóm uống cao chiết liều 125mg/kgP có nồng độ GOT, GPT giảm thấp nhất so với nhóm đối chứng bệnh lý. Cụ thể
- Nhóm chuột uống cao chiết etanol từ cây An xoa ở mức liều 125mg/kgP có nồng độ GOT giảm 2,49 lần và GPT giảm 2,74 lần so với nhóm đối chứng bệnh lý.
- Nhóm chuột uống cao chiết entanol từ cây An xoa ở mức liều 250mg/kgP có nồng độ GOT giảm 2,09 lần và GPT giảm 2,61 lần so với nhóm đối chứng bệnh lý.
- Nhóm chuột uống cao chiết etanol từ cây An xoa ở mức liều 500mg/kgP có nồng độ GOT giảm 1,64 lần và GPT giảm 1,94 lần so với nhóm đối chứng bệnh lý.
Đánh giá hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết entanol từ cây An xoa ở các mức liều 125mg/kgP, 250mg/kgP và 500mg/kgP cho thấy: Cao chiết etanol từ cây An xoa ở mức liều 125mg/kgP có hiệu quả bảo vệ gan cao nhất (GOT giảm 82,08% và GPT giảm 74,16% so với nhóm bệnh lý), tiếp sau là cao chiết etanol ở mức liều 250mg/kgP ( GOT giảm 71,51% và GPT giảm 72,06% so với nhóm bệnh lý) và thấp nhất là cao chiết etanol từ cây An xoa ở mức liều 500mg/kgP (GOT giảm 53,58% và GPT giảm 56,63% so với nhóm bệnh lý).
Hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết etanol từ cây An xoa ở cả ba mức liều 125mg/kgP, 250mg/kgP và 500mg/kgP đều thấp hơn so với hiệu quả bảo vệ gan của silymarin ( GOT giảm 98,38% và GPT giảm 90,18% so với nhóm bệnh lý).
GOT, GPT là các enzyme xúc tác các phản ứng hóa học trong cơ thể. GOT là enzyme ở trong bào tương và ty thể, thường tìm thấy trong các mơ gan, tim, thận và não, GPT có mặt chủ yếu ở tế bào gan, vì vậy sự tăng GPT đặc hiệu cho tổn thương gan hơn GOT.
Ở nhóm bệnh lý, nồng độ enzyme GOT tăng 3,68 lần và GPT tăng 6,96 lần so với chứng sinh lí. Điều này chứng tỏ khi chuột được uống Paracetamol, số lượng tế bào gan bị phá hủy tăng lên dẫn đến việc giải phóng enzyme GOT vào trong máu.
Như vậy, cao chiết cây An xoa Việt Nam có tác dụng làm giảm hàm lượng enzyme GOT, GPT trong máu chuột nhắt trắng. Điều này chứng tỏ cao chiết cây An xoa có hoạt tính bảo vệ gan, chống lại sự phá hủy tế bào do Paracetamol.
Theo các cơng trình nghiên cứu đã cơng bố của một số tác giả về thành phần và hoạt tính của cây An xoa, trong thành phần của cây An xoa có chứa các hợp chất thuộc các lớp chất như flavonoid, lignans, pinoresinol, stigmasterol,..có hoạt tính bảo vệ gan với vai trị giảm q trình oxy hóa và chống lại sự hoại tử tế bào. Trong đó, hợp chất thuộc lớp chất flavonoid được đánh giá cao về tác dụng chống độc, làm giảm tổn thương gan, bảo vệ chức năng gan khi chất độc được đưa vào cơ thể như: apigenin là một hợp chất có nhiều hoạt tính dược lý khác nhau trong đó có hoạt tính bảo vệ nhưng ít gây độc tính cho động vật thực nghiệm [1]. Tiliroside có khả năng ức chế quá trình sản xuất TNF- α, giảm độ nhạy của tế bài gan với tác động của TNF-α do đó ngăn cản q trình tăng lên của GOT và GPT[8]. Stigmasterol có tác dụng làm giảm q trình peroxi hóa lipid ở gan
24
và tăng hoạt động của catalase, superoxide dismutase và glutathione do đó có hoạt tính bảo vệ gan[12].
Với vai trị bảo vệ gan của các hợp chất thuộc các lớp chất như flavonoid, lignans, pinoresinol, stigmasterol, ... những hoạt chất này có khả năng làm giảm số lượng tế bào gan bị phá hủy dẫn đến hàm lượng GPT trong máu cũng sẽ giảm. Dưới tác dụng của flavonoid ngưỡng ascobic được ổn định, đồng thời lượng glycogen trong gan tăng, sự tích lũy glycogen đóng vai trị quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan.
3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết etanol từ cây An xoa
Hoạt động chống oxy hóa cũng là một trong những con đường bảo vệ gan của các hợp chất, cao chiết. Do đó khảo sát hoạt tính chống oxy hóa nhằm khẳng định tác dụng bảo vệ gan của các chất là cần thiết.
Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trong não chuột nhắt trắng được thể hiện ở bảng 3.5 và biểu đồ 3.2
Bảng 3.5. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa trong não chuột nhắt trắng
Nồng độ Hàm lượng MDA HTCO% HTCO%(Trolox)
Cao chiết 0,8µg/ml 2,97± 0,03 13,47 13,86 Cao chiết 4µg/ml 2,49 ± 0,005 27,66 30,33 Cao chiết 20µg/ml 1,35 ± 0,005 60,69 64,30 Cao chiết 100µg/ml 1,09 ± 0,003 68,37 85,43 Cao chiết 200µg/ml 0,94 ± 0,002 72,56 94,17 IC50 = 19,26 IC50 = 10,49 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.8 4 20 100 200 Cao chiết Trolox
25
Biểu đồ 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
Qua bảng 3.5. và biểu đồ 3.2 cho thấy hiệu suất chống oxy hóa của cao chiết cây An xoa tỉ lệ thuận với nồng độ cao và thấp hơn so với đối chứng Trolox (VitaminE) cụ thể:
- Ở nồng độ 0,8µl/ml hiệu suất chống oxy hóa của chiết etanol từ cây An xoa thấp hơn 0,39% so với đối chứng Trolox.
- Ở nồng độ 4 µl/ml hiệu suất chống oxy hóa của cao chiết etanol từ cây An xoa thấp hơn 2,67% so với đối chứng Trolox.
- Ở nồng độ 20 µl/ml hiệu suất chống oxy hóa của cao chiết etanol từ cây an thấp hơn 3,61% so với đối chứng Trolox.
- Ở nồng độ 100 µl/ml hiệu suất chống oxy hóa của cao chiết etanol từ cây An xoa thấp hơn 17,06% so với đối chứng Trolox.
- Ở nồng độ 200 µl/ml hiệu suất chống oxy hóa của cao chiết etanol từ cây An xoa 21,61% so với đối chứng Trolox.
So sánh hiệu suất chống oxy hóa của cao chiết etanol từ cây An xoa ở tất cả các mức nồng độ 0,8; 4; 20; 100; 200 µl/ml cho thấy hiệu suất chống oxy hóa ở nồng độ 200 µl/ml là cao nhất nhưng vẫn thấp hơn so với đối chứng Trolox.
Hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết ethanol từ cây An xoa có thể là do tác dụng của các hợp có trong cao chiết như hợp chất apigenin, stigmasterol là những hợp chất có tác dụng ngăn sự gia tăng nồng độ MDA do paracetamol gây ra.
Kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hoạt động ức chế q trình peroxy hóa lipid của cao chiết enthanol từ cây An xoa tương đồng với hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết. Như vậy, cao chiết có thể bảo vệ gan thơng qua hoạt động ức chế