ĐẶT VẤN ĐỀ Với nhiều ưu điểm và khả năng mang được nhiều loại dược chất, liposome nhanh chóng trở thành hệ mang thuốc được nghiên cứu và phát triển rộng rãi trên thế giới. Ứng dụng lớn nhất của liposome là làm chất mang thuốc điều trị ung thư và đã có nhiều chế phẩm thương mại được bán trên thị trường như với các dược chất như doxorubicin (Doxil); amphotericin B (Ambisome)… Ở Việt Nam, việc nghiên cứu bào chế liposome với chất mang là thuốc điều trị ung thư doxorubicin đã được tiến hành, tuy nhiên mới chỉ bào chế được ở thể tích nhỏ (vài chục ml) do những khó khăn về thiết bị. Đồng thời, phần lớn các nghiên cứu đều tiến hành với liposome doxorubicin quy ước, chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa. Với mong muốn tăng quy mô bào chế và đánh giá được tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u động vật của thuốc tiêm liposome Doxorubicin PEG hóa.” Đề tài gồm có hai mục tiêu chính: 1. Bào chế được liposome doxorubicin PEG hóa ở quy mô 100 lọmẻ và xây dựng TCCS cho thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa. 2. Đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa trên các dòng tế bào ung thư và so sánh hiệu quả điều trị của các dạng bào chế doxorubicin khác nhau trên khối u động vật thực nghiệm.
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U ĐỘNG VẬT CỦA THUỐC TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN PEG HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U ĐỘNG VẬT CỦA THUỐC TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN PEG HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ DS Lê Phương Linh Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế - Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Y học sở - Học viện Quân y HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới: ThS Nguyễn Văn Lâm DS Lê Phương Linh Là người thầy, người chị tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đồng thời em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ người trực tiếp giao đề tài bảo, định hướng cho em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội, môn Y học sở Học viện Quân y giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người cổ vũ, quan tâm động viên, khích lệ giúp em hồn thành đề tài Hà Nội, tháng năm 2015 Nguyễn Thị Phương Thảo LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 10 ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Doxorubicin 1.1.1 Đại cương doxorubicin 1.1.2 Tính chất 1.1.3 Dược động học 1.1.4 Chỉ định 1.1.5 Tác dụng không mong muốn 1.1.6 Một số chế phẩm doxorubicin thị trường 1.2 Tổng quan liposome 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại 1.3 Liposome PEG hóa 1.3.1 Dược động học liposome truyền thống 1.3.2 Liposome gắn PEG chế tác dụng 1.3.3 Các phương pháp bào chế liposome PEG hóa 1.4 Những nghiên cứu gần 1.5 Sơ lược mơ hình đánh giá độc tính thuốc 12 1.5.1 Các dòng tế bào 12 1.5.2 Phương pháp đánh giá độc tính tế bào 13 1.6 Sơ lược mơ hình đánh giá tác dụng khối u động vật thực nghiệm 14 1.6.1 Động vật thực nghiệm 14 1.6.2 Phương pháp đánh giá tác dụng 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu phương tiện nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Nguyên vật liệu 15 2.1.3 Phương tiện nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 17 2.3.2 Phương pháp đánh giá liposome tạo 18 2.3.3 Phương pháp đánh giá thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 21 2.3.4 Phương pháp đánh giá độc tính thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa tế bào ung thư 21 2.3.5 Phương pháp đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome dox PEG hóa khối u chuột 22 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 23 2.3.7 Điều kiện thí nghiệm 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Hoàn thiện quy trình bào chế liposome DOX PEG hóa quy mơ 100 lọ/mẻ 24 3.2 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng lipome DOX PEG hóa 29 3.2.1 Thẩm định phương pháp định lượng DOX toàn phần 29 3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng doxorubicin tự 32 3.2.3 Thẩm định phương pháp định lượng phospholipid 34 3.3 Đề xuất tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa 37 3.4 Đánh giá độc tính thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa dịng tế bào ung thư 38 3.4.1 Kết đánh giá độc tính thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa dịng tế bào A549 38 3.4.2 Kết đánh giá độc tính thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa dịng tế bào HT29 39 3.5 Sơ đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa khối u động vật thực nghiệm 40 3.5.1 Đánh giá tác dụng liposome DOX PEG hóa kích thước khối u chuột cấy dòng tế bào A549 40 3.5.2 Đánh giá tác dụng liposome DOX PEG hóa kích thước khối u chuột cấy dòng tế bào HT29 40 3.6 Bàn luận 41 3.6.1 Về quy trình bào chế liposome DOX PEG hóa quy mơ 100 lọ/mẻ 41 3.6.2 Về độc tính liposome DOX PEG hóa tế bào 43 3.6.3 Về đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome dox PEG khối u chuột 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Tên đầy đủ Từ viết tắt Chol Cholesterol DĐVN Dược điển Việt Nam DLS Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động DOX Doxorubicin DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium - Môi trường dùng cho nhiều dòng tế bào khác DMSO Dimethyl sulfoxide DMPE Dimyristoyl phosphatidylethanolamine DPPE Dipalmitoyl phosphatidylethanolamine DSPC 1,2-Distearoyl – sn – Glycero – – Phosphocholin 10 DSPE – PEG 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N[amino(polyethylene glycol)-2000] 11 FBS Fetal bovine serum – Huyết thai bò 12 GM1 Monosialoganglioside 13 HEPES N-2- hydroxy ethyl piperazin-N’-2-ethan sulfonic acid 14 HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) 15 IC50 50% Inhibitory concentrations – Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử 16 KTTP Kích thước tiểu phân 17 KTTB Kích thước trung bình 18 MPS Mononuclear Phagocytic System (hệ thực bào đơn nhân) 19 PEG Polyethylen glycol 20 PDI Polydispersity Index - Chỉ số đa phân tán 21 RSD Relative standard deviation – độ lệch chuẩn tương đối 22 SPC Soy phosphatidylcholin 23 SRB Sulforhodamine B 24 TCCS Tiêu chuẩn sở 25 TEM Transmission Electron Microscopy – Hiển vi điện tử truyền qua 26 TKHH Tinh khiết hóa học 27 USP United state Pharmacopoiea (Dược điển Mỹ) 28 UV Tử ngoại DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số chế phẩm doxorubicin thị trường Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu sử dụng 15 Bảng 3.1 Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa mg/ml 29 Bảng 3.2 Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống sắc ký 29 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ xác 31 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ 31 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ 33 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại hệ thống đo quang 34 Bảng 3.7 Kết khảo sát tính xác 36 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ 36 Bảng 3.9 Tiêu chuẩn sở đề xuất thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 37 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1.1 Cơng thức hóa học doxorubicin hydroclorid Hình 1.2 Cấu trúc liposome Hình 1.3 Mơ hình liposome PEG hóa Hình 1.4 Hiện tượng tăng tính thấm khả lưu giữ Hình 1.5 Các phương pháp gắn PEG vào liposome Hình 3.1 Sự thay đổi KTTP liposome sau nén ép áp suất số chu kì khác 25 Hình 3.2 So sánh phương pháp đùn tay nén áp suất cao 26 Hình 3.3 Ảnh chụp TEM liposome 26 Hình 3.4 Sơ đồ bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa quy mơ 100 lọ/mẻ Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ phospholipid độ hấp thụ quang 28 30 33 35 Hình 3.8 Khả gây độc dịng tế bào A549 38 Hình 3.9 Khả gây độc dòng tế bào HT29 39 Hình 3.10 Kích thước khối u chuột cấy dịng tế bào A549 40 Hình 3.11 Kích thước khối u chuột cấy dòng tế bào HT29 40 43 3.6.2 Về độc tính liposome DOX PEG hóa tế bào Theo chuyên luận MTT, mẫu có IC50 < 20 μg/ml coi có tác dụng [25] Như vậy, dòng tế bào A549 sau 48 liposome DOX PEG hóa bắt đầu phát huy tác dụng gây độc tế bào (IC50 = 9,97) có tác dụng mạnh sau 72 (IC50 = 0,7) Thời gian tiếp xúc với tế bào lâu nồng độ thuốc cao hơn, thuốc có nhiều hội để vào tế bào, gây độc tính mạnh Kết cho thấy liposome DOX PEG hóa giải phóng kéo dài máu, tăng thời gian tác dụng Với dòng tế bào HT29, sau 24 liposome DOX PEG hóa khơng có tác dụng gây độc tế bào Sau 48 giờ, liposome gây độc tế bào yếu sau 72 đạt hiệu tốt với IC50 0,86 μg/ml Chế phẩm có IC50 sau 48 cao, khoảng 99,9 µg/ml, chứng tỏ thuốc giải phóng chậm môi trường nuôi cấy gây chết tế bào muộn Khi tăng nồng độ DOX, kết thu dòng tế bào HT29 tương tự với dòng tế bào A549 Tại thời điểm, với nồng độ thuốc cao hơn, lượng thuốc giải phóng mơi trường ni cấy tăng lên gây chết tỉ lệ tế bào cao Nồng độ tăng, tỉ lệ tế bào sống sót HT29 giảm mạnh so với A549 Kết thu chứng minh phụ thuộc độc tính liposome DOX PEG hóa tế bào vào nồng độ thời gian Khi tăng thời gian tiếp xúc với tế bào, tăng nồng độ thuốc IC50 giảm Tuy nhiên độc tính phụ thuộc vào thời gian dịng tế bào A549 mạnh so với HT29, ngược lại, độc tính phụ thuộc vào nồng độ dòng tế bào HT29 mạnh so với A549 Kết hợp tăng nồng độ thời gian, với nồng độ dược chất 100 µmol/ml sau 72h tiếp xúc với tế bào, IC50 hai dòng tế bào nhỏ, chứng tỏ khả ức chế tế bào liposome doxcorubicin PEG hóa hiệu hai dịng tế bào Việc đánh giá sơ độc tính tế bào cho phép dò liều IC50 liposome DOX PEG hóa, đồng thời cho thấy tiềm lớn liposome DOX PEG hóa ức chế tế bào ung thư, đạt tác dụng giải phóng kéo dài 44 3.6.3 Về đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome dox PEG khối u chuột Dựa vào tốc độ tăng kích thước khối u hai nhóm ung thư đưa số so sánh sơ tác dụng nhóm điều trị Trong hai dạng ung thư, nhóm chứng khơng điều trị ln có tốc độ tăng kích thước khối u mạnh nhất, sau đến nhóm điều trị với dung dịch tiêm dox Hai nhóm điều trị với lipodox liposome dox PEG nghiên cứu có tốc độ tăng kích thước chậm so với nhóm kia, đặc biệt nhóm chuột cấy dịng tế bào HT29, Lipodox thể kết tốt so với nhóm thuốc cịn lại Lipo-dox chế phẩm liposome PEG hóa bề mặt, hiệu suất liposme hóa Lipo-dox cao so với liposome dox PEG nghiên cứu nên mặt lý thuyết, Lipo-dox có tác dụng tốt so với liposome dox PEG nghiên cứu Với thuốc tiêm dung dịch dox dược chất khơng có khả tập trung mơ đích mà bị phân tán nhiều mơ khác, thời gian bán thải ngắn hiệu điều trị so với dạng liposome dạng ung thư Lipo-dox có hiệu suất liposome hóa cao có l mức độ chênh lệch so với liposome dox PEG nghiên cứu không nhiều nên tế bào ung thư nhạy cảm với dox khả điều trị chế phẩm không khác nhiều so với chế phẩm nghiên cứu Kích thước khối u sau điều trị với nhóm thuốc tiếp tục tăng, nguyên nhân liều sử dụng chưa đủ để gây tác dụng diệt tế bào ung thư, liều dò nhờ đánh giá tác dụng dòng tế bào trước đánh giá khối u động vật thực nghiệm Như vậy, khả điều trị khối u phụ thuộc vào mức độ nhạy cảm tế bào ung thư với dược chất mà phụ thuộc vào khả tập trung thuốc mô ung thư hệ mang thuốc Liều sử dụng có tác dụng diệt tế bào ung thư tốt đưa vào đánh giá khối u chưa thể rõ tác dụng ức chế phát triển khối u Mặc dù vậy, qua đánh giá sơ tác dụng điều trị khối u nhận thấy tác dụng điều trị tương đương chế phẩm nghiên cứu so với chế phẩm lipodox thị trường 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Nghiên cứu đạt kết quả: Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubucin PEG hóa quy mơ 1000 ml/ mẻ (100 lọ/mẻ) Khảo sát ảnh hưởng áp suất số chu kì nén đến trình giảm KTTP, lựa chọn thơng số cho q trình giảm KTTP Đồng thời đưa TCCS đánh giá số tiêu chất lượng thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa mg/ml Sơ đánh giá độc tính liposome DOX PEG hóa hai dịng tế bào ung thư phổi A549 ung thư đại tràng HT29 Xác định liều IC50 liposome DOX PEG hóa đồng thời chứng minh phụ thuộc độc tính vào nồng độ dược chất thời gian tiếp xúc dược chất với tế bào Sơ đánh giá tác dụng liposome dox PEG khối u chuột, từ so sánh tác dụng với chế phẩm lipodox thị trường Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu quy trình bào chế liposome dox PEG hóa quy mơ pilot - Đánh giá độ ổn định thuốc tiêm liposome dox PEG hóa TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế (2009), "Dược thư quốc gia Việt Nam", NXB Y học, pp 1225-1234 Đào Thanh Tùng (2012), "Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin", Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học, Trường đại học Dược Hà Nội, tr 15-45 Đỗ Thị Hồng Liên (2012), "Nghiên cứu đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư giải phóng dược chất invitro chế phẩm liposom doxorubicink", Khóa luận tốt nghiệp, tr 8-15 Lê Phương Linh (2013), "Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng liposome doxorubicin", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường đại học Dược Hà Nội, tr 6-14 Nguyễn Văn Lâm (2012), "Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin đánh giá tác dụng động vật", Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học, Trường đại học Dược Hà Nội Tiếng Anh 10 11 12 13 Aryal M., Vykhodtseva N., Zhang Y Z., Park J., McDannold N (2013), "Multiple treatments with liposomal doxorubicin and ultrasound-induced disruption of blood-tumor and blood-brain barriers improve outcomes in a rat glioma model", J Control Release, 169(1-2), pp 103-11 Beijnen J H Wiese G., Underberg W J M (1985), "Aspect of the chemical stability of doxorubicin and seven other anthracydines in acidic solution", Pharmaceutisch Weekblad, 7(3), pp 109-116 Bigotte L., Olsson Y (1982), "Cytofluorescence localization of adriamycin in the nervous system", Acta Neuropathologica, 58(3), pp 193-202 C Sweetman S (2009), "Martindale the complete drug reference Pharmaceutical press London", pp 712-714 Celio L A., DiGregorio G J., Ruch E., Pace J., Piraino A J (1983), "Doxorubicin and 5-fluorouracil plasma concentrations and detectability in parotid saliva", European Journal of Clinical Pharmacology, 24(2), pp 261266 Chastagner Pascal, Sudour Hélène, Mriouah Jihane, Barberi-Heyob Muriel, Bernier-Chastagner Valérie, Pinel Sophie (2015), "Preclinical Studies of Pegylated-and Non-Pegylated Liposomal Forms of Doxorubicin as Radiosensitizer on Orthotopic High-Grade Glioma Xenografts", Pharmaceutical research, 32(1), pp 158-166 Di Fronzo G., Lenaz L., Bonadonna G (1973), "Distribution and excretion of adriamycin in man", Biomedicine / [publiee pour l'A.A.I.C.I.G.], 19(4), pp 169-171 Drummond Daryl C., Meyer Olivier, Hong Keelung, Kirpotin Dmitri B., Papahadjopoulos Demetrios (1999), "Optimizing Liposomes for Delivery of 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Chemotherapeutic Agents to Solid Tumors", Pharmacological Reviews, 51(4), pp 691-744 Ferrari Mario, Fornasiero Maria Chiara, Isetta Anna Maria (1990), "MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity in vitro", Journal of Immunological Methods, 131(2), pp 165-172 Gabizon Alberto, Goren Dorit, Horowitz Aviva T., Tzemach Dinah, Lossos Alexander, Siegal Tali (1997), "Long-circulating liposomes for drug delivery in cancer therapy: a review of biodistribution studies in tumor-bearing animals", Advanced Drug Delivery Reviews, 24(2–3), pp 337-344 Gabizon Alberto, Shmeeda Hilary, Barenholz Yechezkel (2003), "Pharmacokinetics of Pegylated Liposomal Doxorubicin", Clinical Pharmacokinetics, 42(5), pp 419-436 Hantel Constanze, Lewrick Felicitas, Reincke Martin, Süss Regine, Beuschlein Felix (2012), "Liposomal doxorubicin-based treatment in a preclinical model of adrenocortical carcinoma", Journal of Endocrinology, 213(2), pp 155-161 Immordino Maria Laura, Dosio Franco, Cattel Luigi (2006), "Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential", International Journal of Nanomedicine, 1(3), pp 297-315 Ishida Tatsuhiro, Harashima Hideyoshi, Kiwada Hiroshi (2002), "Liposome clearance", Bioscience reports, 22, pp 197-224 J Speth P A., van Hoesel Q G C M., Haanen C (1988), "Clinical Pharmacokinetics of Doxorubicin", Clinical Pharmacokinetics, 15(1), pp 15-31 Johnston M J., Edwards K., Karlsson G., Cullis P R (2008), "Influence of drug-to-lipid ratio on drug release properties and liposome integrity in liposomal doxorubicin formulations", J Liposome Res, 18(2), pp 145-57 Kalyanaraman B., Joseph J., Kalivendi S., Wang S., Konorev E., Kotamraju S (2002), "Doxorubicin-induced apoptosis: implications in cardiotoxicity", Mol Cell Biochem, 234-235(1-2), pp 119-24 Lopes Sávia Caldeira de Araújo, Giuberti Cristiane dos Santos, Rocha Talita Guieiro Ribeiro, Ferreira Diêgo dos Santos, Leite Elaine Amaral, Oliveira Mônica Cristina (2013), Liposomes as Carriers of Anticancer Drugs, pp Lu Wan-Liang, Qi Xian-Rong, Zhang Qiang, Li Rong-Yu, Wang Gui-Lin, Zhang Rui-Juan, Wei Shu-Li (2004), "A Pegylated Liposomal Platform: Pharmacokinetics, Pharmacodynamics, and Toxicity in Mice Using Doxorubicin as a Model Drug", Journal of Pharmacological Sciences, 95(3), pp 381-389 Minh Hue Pham Thi, Le Phương Linh, Van Lam Nguyen, Thanh Hai Nguyen, Ho Son, Anh Toan Nguyen Linh, Thanh Tung Bui (2015), "Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2015, (3): 2239-2243", Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 7(3), pp 2239-2243 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Nag Okhil K, Awasthi Vibhudutta (2013), "Surface engineering of liposomes for stealth behavior", Pharmaceutics, 5(4), pp 542-569 pharmacopoiea British (2009), pp Roy Christopher von (2014), "The Liposomal Approach: Delivering the Goods", HealthPost pp Sawant Rupa R, Torchilin Vladimir P (2010), "Liposomes as ‘smart’pharmaceutical nanocarriers", Soft Matter, 6(17), pp 4026-4044 Scholtz J.C., Campus North-West University Potchefstroom (2010), Preparation, Stability and in Vitro Evaluation of Liposomes Containing Amodiaquine, North-West University, Potchefstroom Campus, pp Schroeder Avi, Kost Joseph, Barenholz Yechezkel (2009), "Ultrasound, liposomes, and drug delivery: principles for using ultrasound to control the release of drugs from liposomes", Chemistry and physics of lipids, 162(1), pp 1-16 Skehan Philip, Storeng Ritsa, Scudiero Dominic, Monks Anne, McMahon James, Vistica David, Warren Jonathan T, Bokesch Heidi, Kenney Susan, Boyd Michael R (1990), "New colorimetric cytotoxicity assay for anticancerdrug screening", Journal of the National Cancer Institute, 82(13), pp 11071112 Soundararajan Anuradha, Bao Ande, Phillips William T, Perez Ricardo, Goins Beth A (2009), "[186 Re] Liposomal doxorubicin (Doxil): in vitro stability, pharmacokinetics, imaging and biodistribution in a head and neck squamous cell carcinoma xenograft model", Nuclear medicine and biology, 36(5), pp 515-524 Stewart John Charles Marshall (1980), "Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate", Analytical biochemistry, 104(1), pp 10-14 Strober Warren (2001), "Trypan blue exclusion test of cell viability", Current protocols in immunology/edited by John E Coligan [et al.], (Appendix 3), pp Appendix 3B Takanashi S, Bachur N R (1976), "Adriamycin metabolism in man Evidence from urinary metabolites", Drug Metabolism and Disposition, 4(1), pp 7987 Téletchéa Stộphane, Stresing Verena, Hervouet Soizic, Baud'huin Marc, Heymann MarieFranỗoise, Bertho Gildas, Charrier Céline, Ando Kosei, Heymann Dominique (2014), "Novel RANK antagonists for the treatment of bone‐resorptive disease: theoretical predictions and experimental validation", Journal of Bone and Mineral Research, 29(6), pp 1466-1477 USP34-NF30, pp Vonarbourg Arnaud, Passirani Catherine, Saulnier Patrick, Benoit JeanPierre (2006), "Parameters influencing the stealthiness of colloidal drug delivery systems", Biomaterials, 27(24), pp 4356-4373 40 41 Yokoi Kenji, Tanei Tomonori, Saito Yuki, Ferrari Mauro (2014), "Novel vascular targeting strategy using pegylated liposomal doxorubicin to increase drug accumulation to tumor site and therapeutic efficacy", Cancer Research, 74(19 Supplement), pp 2986 Zucker Daniel, Marcus David, Barenholz Yechezkel, Goldblum Amiram (2009), "Liposome drugs' loading efficiency: a working model based on loading conditions and drug's physicochemical properties", Journal of Controlled Release, 139(1), pp 73-80 PHỤ LỤC Phụ lục Sắc ký đồ mẫu trắng định lượng doxorubicin Phụ lục Sắc ký đồ doxorubicin 40 µg/ml Phụ lục Sắc ký đồ định lượng doxorubicin toàn phần liposome doxorubicin PEG hóa Phụ lục Sắc ký đồ doxorubicin µg/ml Phụ lục Sắc ký đồ định lượng doxorubicin tự liposome doxorubicin PEG hóa Phụ lục Sắc ký đồ định lượng doxorubicin µg/ml thêm chuẩn Phụ lục Kết kháo sát độ tuyến tính thẩm định định lượng DOX tồn phần STT Nồng độ dung dịch doxorubicin (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) 20 777,18 30 1165,55 40 1576,59 50 1942,49 60 2290,55 Phụ lục Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký thẩm định phương pháp định lượng dox tự STT ̅ 𝑋 RSD (%) Thời gian lưu (phút) 5,128 5,131 5,112 5,123 5,134 5,074 5,11 0,47 Diện tích pic (mAU.s) 483,16 455,48 434,48 485,12 487,06 484,08 483,61 0,88 Hệ số bất đối xứng (AF) 0,67 0,7 0,69 0,67 0,67 0,67 0,68 Số đĩa lý thuyết 3640 3650 3391 3640 3531 3233 3515 Phụ lục Kết khảo sát độ tuyến tính thẩm định dox tự STT Nồng độ dung dịch doxorubicin (µg/ml) 0,1 0,4 Diện tích pic (mAU.s) 37,47 109,58 483,81 729,66 938,67 Phụ lục 10 Kết khảo sát độ xác thẩm định dox tự STT ̅ 𝑋 RSD (%) Diện tích pic (mAU.s) 52,29 50,19 50,61 52,38 51,63 51,75 51,48 1,73 Phụ lục 11 Nồng độ phospholipid độ hấp thụ quang STT Nồng độ phospholipid (µmol/ml) 0,006 0,013 0,025 0,038 0,051 0,063 Độ hấp thụ trung bình 0,062 0,142 0,256 0,405 0,525 0,651 Phụ lục 12 Phổ hấp thụ phospholipid mẫu trắng, mẫu thử mẫu chuẩn Phụ lục 13 Đồ thị phân bố kích thước liposome sau 10 chu kì nén áp suất 5000 psi Phụ lục 14 Đồ thị phân bố kích thước liposome sau 10 chu kì nén áp suất 10.000 psi Phụ lục 15: Độc tính thuốc dịng tế bào A549 Nồng độ (µg/ml) Tỉ lệ tế bào sống sót (%) Sau 24h Sau 48h Sau 72h 92,45 ± 18,04 53,4 ± 11,06 29,47 ± 7,47 10 81,62 ± 6,25 49,15 ± 3,33 29,09 ± 8,73 100 74,93 ± 13,02 25,04 ± 12,38 13,96 ± 5,07 IC50 (µg/ml) > 100 9,97 0,7 Phụ lục 16: Độc tính thuốc dịng tế bào HT29 Nồng độ (µg/ml) Tỉ lệ tế bào sống sót (%) Sau 24h Sau 48h Sau 72h 103,9 ± 14,69 88,52 ± 11,03 41,52 ± 3,44 10 75,91 ± 10,94 61,17 ± 4,48 39,85 ± 5,97 100 71,13 ± 11,48 49,7 ± 6,04 19,75 ± 2,69 IC50 (µg/ml) > 100 99,9 0,86 Phụ lục 17 Kích thước khối u sau cấy dòng tế bào A549 Ngày đo 11 Dung dịch thuốc tiêm dox 619,875 970,06 1339,81 1821,92 Nhóm chứng 668,53 1117,6 1643,4 2088,725 Lipodox 406,43 611,26 882,15 1437,25 503 517,65 1196,86 1478,4 Liposome dox PEG Phụ lục 18 Kích thước khối u sau cấy dòng tế bào HT29 Ngày đo Dung dịch thuốc tiêm dox 566,4 1802,91 3 10 14 17 2440,2 4461,27 6635,1 9136,4 530 2116,86 3039,73 5625,64 7244,15 9754,1 Lipodox 538,28 1126,58 2086,7 2924,47 4834,15 6140,63 Liposome dox PEG 462,8 873,6 1661,7 2805,7 5784,15 7867,9 Nhóm chứng ... nghiên c? ?u đánh giá tác dụng liposome doxorubicin PEG hóa Với mong muốn tăng quy mơ bào chế đánh giá tác dụng liposome doxorubicin PEG hóa, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Nghiên c? ?u bào chế đánh giá tác. .. pháp đánh giá thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa Với thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa đánh giá tất ti? ?u với liposome doxorubicin PEG hóa có đánh giá thêm ti? ?u sau: Hình thức: đánh giá. .. 3.5 Sơ đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa khối u động vật thực nghiệm Thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa đánh giá khối u chuột, so sánh với thuốc đối chi? ?u Lipo-DOX dung dịch tiêm theo