Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u động vật của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa

ĐẶT VẤN ĐỀ Với nhiều ưu điểm và khả năng mang được nhiều loại dược chất, liposome nhanh chóng trở thành hệ mang thuốc được nghiên cứu và phát triển rộng rãi trên thế giới. Ứng dụng lớn nhất của liposome là làm chất mang thuốc điều trị ung thư và đã có nhiều chế phẩm thương mại được bán trên thị trường như với các dược chất như doxorubicin (Doxil); amphotericin B (Ambisome)… Ở Việt Nam, việc nghiên cứu bào chế liposome với chất mang là thuốc điều trị ung thư doxorubicin đã được tiến hành, tuy nhiên mới chỉ bào chế được ở thể tích nhỏ (vài chục ml) do những khó khăn về thiết bị. Đồng thời, phần lớn các nghiên cứu đều tiến hành với liposome doxorubicin quy ước, chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa. Với mong muốn tăng quy mô bào chế và đánh giá được tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u động vật của thuốc tiêm liposome Doxorubicin PEG hóa.” Đề tài gồm có hai mục tiêu chính: 1. Bào chế được liposome doxorubicin PEG hóa ở quy mô 100 lọmẻ và xây dựng TCCS cho thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa. 2. Đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa trên các dòng tế bào ung thư và so sánh hiệu quả điều trị của các dạng bào chế doxorubicin khác nhau trên khối u động vật thực nghiệm.

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U ĐỘNG VẬT

CỦA THUỐC TIÊM LIPOSOME

DOXORUBICIN PEG HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2015

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ

CỦA THUỐC TIÊM LIPOSOME

DOXORUBICIN PEG HÓAKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ

DS Lê Phương Linh

Nơi thực hiện:

Bộ môn Bào chế - Đại học Dược Hà Nội

Bộ môn Y học cơ sở - Học viện Quân y

HÀ NỘI – 2015

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới:

ThS Nguyễn Văn Lâm

DS Lê Phương Linh

Là người thầy, người chị đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Đồng thời em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ người

đã trực tiếp giao đề tài và chỉ bảo, định hướng cho em thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội, bộ môn Y học cơ sở Học viện Quân y đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người

đã luôn cổ vũ, quan tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành đề tài

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Nguyễn Thị Phương Thảo

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 17

2.3.3 Phương pháp đánh giá thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 21 2.3.4 Phương pháp đánh giá độc tính của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa

2.3.5 Phương pháp đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome dox PEG hóa trên

3.2.1 Thẩm định phương pháp định lượng DOX toàn phần 29 3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng doxorubicin tự do 32 3.2.3 Thẩm định phương pháp định lượng phospholipid 34

3.4 Đánh giá độc tính của thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa trên dòng tế bào ung

chuột cấy dòng tế bào HT29 40

3.6.1 Về quy trình bào chế liposome DOX PEG hóa ở quy mô 100 lọ/mẻ 41 3.6.2 Về độc tính của liposome DOX PEG hóa trên tế bào 43 3.6.3 Về đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome dox PEG trên khối u chuột 44

2 DĐVN Dược điển Việt Nam

dùng cho nhiều dòng tế bào khác nhau

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]

hiệu năng cao)

đối tượng thử

qua

Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường 3

Bảng 3.1 Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml 29

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 29

Hình 1.2 Cấu trúc liposome 4

Hình 1.4 Hiện tượng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ 7

Hình 3.1 Sự thay đổi KTTP của liposome sau khi nén ép dưới áp suất và số

Hình 3.8 Khả năng gây độc trên dòng tế bào A549 38

Hình 3.9 Khả năng gây độc trên dòng tế bào HT29 39

Hình 3.10 Kích thước khối u ở chuột cấy dòng tế bào A549 40

Hình 3.11 Kích thước khối u ở chuột cấy dòng tế bào HT29 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Với nhiều ưu điểm và khả năng mang được nhiều loại dược chất, liposome nhanh chóng trở thành hệ mang thuốc được nghiên cứu và phát triển rộng rãi trên thế giới Ứng dụng lớn nhất của liposome là làm chất mang thuốc điều trị ung thư

và đã có nhiều chế phẩm thương mại được bán trên thị trường như với các dược chất như doxorubicin (Doxil); amphotericin B (Ambisome)…

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu bào chế liposome với chất mang là thuốc điều trị ung thư doxorubicin đã được tiến hành, tuy nhiên mới chỉ bào chế được ở thể tích nhỏ (vài chục ml) do những khó khăn về thiết bị Đồng thời, phần lớn các nghiên cứu đều tiến hành với liposome doxorubicin quy ước, chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa Với mong muốn tăng quy mô bào chế và đánh giá được tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa,

chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối

u động vật của thuốc tiêm liposome Doxorubicin PEG hóa.”

Đề tài gồm có hai mục tiêu chính:

1 Bào chế được liposome doxorubicin PEG hóa ở quy mô 100 lọ/mẻ và xây dựng TCCS cho thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa

2 Đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa trên các dòng tế bào ung thư và so sánh hiệu quả điều trị của các dạng bào chế doxorubicin khác nhau trên khối u động vật thực nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Doxorubicin

1.1.1 Đại cương về doxorubicin

- Dung dịch 0,5% trong nước có pH = 4,0 - 5,5 [27]

- Doxorubicin bền trong dung dịch có pH gần 4 [7]

1.1.3 Dược động học

Phân bố: sau khi tiêm tĩnh mạch, nồng độ doxorubicin giảm nhanh do phân

bố đến các mô phổi, gan, tim, thận, lách Khoảng 50-85% doxorubicin liên kết với protein huyết tương [10], 15-50% tồn tại ở dạng tự do Doxorubicin không đi qua hàng rào máu não [8] nên không có tác dụng trên khối u trong hệ thống thần kinh trung ương [12]

Chuyển hóa: doxorubicin qua gan chuyển hóa thành doxorubicinol thân

nước, là một aglycones tan kém trong nước, doxorubicinone và 7 – deoxydoxorubicinone [36]

- Tên khoa học: (8S,

10S)-10-((3-amino-2, 3, lyxo-hexopyranosyl) oxy) -7, 8,

6-trideoxy-α-L-9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)- 1-methoxy-5, 12-

Thải trừ: 40 – 50% doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày, 5% bị đào

thải qua nước tiểu trong 5 ngày [20]

1.1.4 Chỉ định

Ung thư vú, u xương ác tính và u xương Ewing, u mô mềm, u khí phế quản,

u lympho ác tính cả 2 dạng: Hodgkin và không Hodgkin, ung thư biểu mô tuyến giáp Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn Khối u đặc của trẻ em: Sarcom cơ vân, u nguyên tế bào thần kinh, u Wilm [1]

1.1.5 Tác dụng không mong muốn

Doxorubicin là hoạt chất có độc tính cao, phụ thuộc đường dùng, liều dùng

và số lần dùng thuốc trong ngày Các tác dụng không mong muốn thường gặp: rụng tóc, buồn nôn Theo Muggia cũng cộng sự, 2 – 3% bệnh nhân gặp phải những triệu chứng như: rụng tóc, buồn nôn và ói mửa khi được điều trị với liều 40 mg/m2 da mỗi 2 tuần [13] Suy giảm chức năng tủy xương là phản ứng có hại rất nhạy với giới hạn liều dùng nhưng có thể hồi phục Độc tính với tim là một tác dụng không mong muốn cần phải hết sức chú ý khi điều trị lâu dài, tổng liều tích lũy không nên vượt

rối loạn tiêu hóa,… Dùng theo đường bàng quang còn có thể gây rối loạn tiếu, nóng rát bàng quang và niệu đạo [1]

1.1.6 Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường

Bảng 1.1 Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường

Ebewe Pharma

Doxorubicina servycal lọ 10 mg, 50 mg Laboratorios IMA

Liposome là một hệ mang thuốc gồm một hoặc nhiều lớp lipid kép bao

quanh một khoang chứa nước (Hình 1.2), được hình thành một cách tự nhiên khi

phân tán các phân tử phospholipid trong môi trường nước, khi đó đầu thân nước tự sắp xếp hướng về phía khoang chứa nước, trong khi đuôi dài kị bị đẩy về hướng ngược lại tạo thành các hạt có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [23]

Hình 1.2 Cấu trúc liposome [28]

1.2.2 Phân loại

Đặc điểm nổi bật của liposome là rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, do đó

có rất nhiều cách phân loại liposome Cách phân loại phổ biến nhất là dựa trên thành phần cấu tạo và ứng dụng lâm sàng, gồm có các loại sau [30]:

- Liposome dạng quy ước (conventional liposome)

Thành phần chỉ gồm phospholipid và (hoặc) cholesterol, thích hợp để mang các dạng thuốc tác dụng trên hệ thống đại thực bào như các thuốc kháng vi sinh vật, thuốc điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị ung thư và ngăn chặn khối u phát triển Nguyên nhân chính là do liposome dạng này thường nhanh chóng bị bắt giữ bởi hệ thống đại thực bào đơn nhân và hệ thống lưới nội mô trong cơ thể

- Liposome tuần hoàn dài (long-circulating liposome)

Bề mặt của liposome thường được gắn thêm các nhóm phân tử thân nước có kích thước lớn như polyethylenglycol (PEG), ganglioside (GM1), poly [N-(2-hydroxypropyl)] methacrylamid, poly-N-vinylpyrrolidon, polyvinyl alcol,…[18]

Các nhóm cồng kềnh ở bề mặt này (hình 1.3) có nhiệm vụ ngăn chặn quá trình

tương tác với opsonin huyết tương, ức chế tương tác kỵ nước và tĩnh điện của một loạt các thành phần trong máu trên bề mặt của liposome làm chậm quá trình nhận dạng liposome của hệ thống đại thực bào Một mặt giúp cho liposome tránh được quá trình bắt giữ của hệ thống đại thực bào, một mặt tạo ra cấu trúc không gian ổn định, do đó kéo dài được thời gian tồn tại của liposome trong cơ thể [18], [15]

Hình 1.3 Mô hình liposome đã PEG hóa [16]

- Liposome hướng đích chủ động (targeted liposomes)

Để tăng tích lũy thuốc dạng liposome tại các đích điều trị mong muốn, cho hoạt tính điều trị cao hơn và chọn lọc hơn, người ta đã gắn thêm các phối tử (ligand) có tác dụng hướng đích như các polymer, receptor hoặc kháng thể… vào lớp màng liposome Các phối từ này có khả năng nhận biết, hướng đến tế bào đích, hòa màng

và giải phóng dược chất tại đó

- Liposome cảm ứng (sensitive liposome)

Là các liposome trong thành phần cấu tạo vỏ của có chứa một tỉ lệ nhất định các chất cảm ứng, đó có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polime có khả năng

bị phân giải cấu trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu kích thích tại mô đích Tác nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô bị bệnh như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường mô bệnh (tác nhân nội) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm, điện từ trường, nhiệt độ (tác nhân ngoại) [31],[29]

1.3 Liposome PEG hóa

1.3.1 Dược động học của liposome truyền thống

Liposome sau khi tiêm sẽ tương tác với các thành phần trong máu dẫn đến sự mất ổn định lớp màng kép làm giải phóng các phân tử bên trong liposome vào máu Tương tác đầu tiên là với các protein huyết tương Các protein khi hấp phụ lên bề mặt liposome có thể làm tăng tính thấm của màng, làm giảm khả năng lưu giữ thuốc bên trong Các protein này được gọi là opsonin và quá trình chúng hấp phụ lên bề mặt liposome gọi là quá trình opsonin hóa [19] Quá trình này tạo điều kiện cho các

tế bào của hệ thống lưới nội mô (RES) nhận biết và khởi động quá trình thực bào liposome nhờ tạo ra các vị trí gắn cho receptor của RES [39] RES là một phần của

hệ thống miễn dịch có chức năng chính là loại bỏ các tác nhân lạ khỏi cơ thể RES bao gồm các tế bào như bạch cầu đơn nhân và đại thực bào, chủ yếu được tìm thấy trong các tế bào Kruffer ở gan, phổi và lách Do đó, phần lớn các liposome sau khi tiêm sẽ được vận chuyển về gan và lách Các liposome vượt qua được hàng rào trên

sẽ được tích lũy ở đích theo cơ chế chủ động hoặc bị động Với cơ chế chủ động, liposome được gắn thêm các yếu tố hướng đích và tích lũy nhờ ái lực với đích

Liposome cũng có thể tích lũy thụ động ở các khối u hoặc các vị trí viêm nhờ hiện tượng thoát mạch qua các kẽ hở của thành mạch và được giữ lại do giảm sự dẫn lưu của hệ bạch huyết tại các vị trí này Hiện tượng này được gọi là hiệu ứng tăng tính

thấm và khả năng lưu giữ (EPR) (Hình 1.4) [30] Tuy nhiên sự tích lũy thụ động của

liposome tại khối u là quá trình diễn ra tương đối chậm, trong khi các liposome quy ước nhanh chóng bị thải trừ khỏi hệ tuần hoàn, do đó việc tăng thời gian tuần hoàn

là yêu cầu cần thiết để phát triển hệ mang thuốc dạng liposome

Hình 1.4 Hiện tượng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ [30]

1.3.2 Liposome gắn PEG và cơ chế tác dụng

Để tăng thời gian tuần hoàn, rất nhiều dẫn chất đã được nghiên cứu để thêm vào thành phần màng liposome Trong đó, PEG là một trong các dẫn chất polymer được chứng minh là có hiệu quả kéo dài thời gian tuần hoàn vượt trội so với các dẫn chất khác [16] PEG là một polyme thân nước có khối lượng phân tử từ 750 – 50.000 Da, có những đặc tính tuyệt vời như tan tốt trong nước và nhiều dung môi hữu cơ, không phân hủy, không tạo thành bất kỳ sản phẩm chuyển hóa nào, độc tính thấp PEG gắn vào liposome tạo ra lớp áo thân nước, làm giảm lực hút thân dầu với các protein, đồng thời các chuỗi dài polyme có vai trò như một rào cản không gian, vừa ngăn cản sự tương tác với các opsonin và đại thực bào, vừa tạo ra lực đẩy không gian giữa các liposome, hạn chế được cả sự tương tác giữa các liposome với

nhau [30] Nhờ vậy, lớp bao PEG trên bề mặt liposome có tác dụng kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu của liposome, tăng khả năng đưa thuốc đến mô đích Đồng thời, khi thời gian lưu thông trong hệ thống tuần hoàn tăng còn tăng khả năng tích lũy thụ động của liposome và thuốc tại mô ung thư và các mô bệnh khác, giúp tăng nồng độ thuốc tại vị trí khối u so với liposome truyền thống, từ đó tăng hiệu quả điều trị

1.3.3 Các phương pháp bào chế liposome PEG hóa

Có 2 phương pháp thường được sử dụng để gắn PEG vào liposome [26]

1.3.3.1.Gắn PEG trong quá trình tạo liposome (pre – insertion)

Dẫn chất lipid có gắn PEG sẽ được hòa tan cùng với các thành phần màng vào pha dung môi hữu cơ, sau đó tiến hành hydrat hóa tạo màng film tương tự như với liposome không PEG hóa Phương pháp này tiến hành tương đối dễ dàng, tuy nhiên

nhược điểm của nó là PEG sẽ phân bố ở cả hai phía của lớp màng kép (hình 1.5a)

PEG phân bố cả phía trong khoang nước sẽ chiếm không gian của dược chất, làm giảm lượng dược chất được nạp vào chất mang, đồng thời PEG ở khoang nước sẽ

dễ bị thủy phân bởi môi trường acid (khi cần tạo chênh lệch pH để đưa dược chất vào liposome trống) Kích thước liposome càng nhỏ, ảnh hưởng của PEG ở khoang nước đến độ ổn định của liposome càng lớn, đặc biệt đối với liposome đa lớp thì thể tích dược chất mang được giảm xuống rất nhiều

1.3.3.2 Gắn PEG lên bề mặt các liposome đã tạo thành từ trước

Phương pháp này gồm 2 kỹ thuật:

- Gắn vật lý (post – insertion): nguyên tắc của phương pháp này dựa vào khả

năng di chuyển của phân tử lipid từ pha lipid này sang pha lipid khác (hình 1.5b)

Trong phương pháp này, các PEG lipid được thêm từ từ vào hỗn dịch liposome đã tạo ra từ trước ở nhiệt độ gần với nhiệt độ chuyển pha của lipid màng Để ngăn cản quá trình tự hình thành các micel của PEG lipid khi thêm vào pha nước, nồng độ của chúng được duy trì ở dưới nồng độ micel tới hạn, do đó năng lượng nhiệt động cần đề tạo micel sẽ thấp hơn so với gắn vào lớp màng của liposome PEG – lipid sẽ dần dần chuyển sang gắn với màng liposome, kết quả thu được liposome PEG hóa

Ưu điểm của phương pháp này là PEG chỉ gắn ở mặt ngoài của liposome, không

làm giảm không gian bên trong khoang nước của dược chất Tuy nhiên phương

pháp này có nhược điểm là khả năng chèn PEG – lipid vào bề mặt liposome phụ

thuộc vào chiều dài chuỗi PEG, chuỗi càng dài càng khó gắn

- Gắn hóa học (post – modification): nguyên tắc của phương pháp là dựa vào

phản ứng hóa học để tạo liên kết đồng hóa trị giữa PEG đã hoạt hóa với nhóm phản

ứng trên bề mặt liposome Phương pháp này có nhược điểm là dung môi và điều

kiện phản ứng dễ phá vỡ cấu trúc liposome, khó khăn trong việc tách các chất phản

ứng và sản phẩm phụ,… do đó ít được sử dụng hơn

Hình 1.5 Các phương pháp gắn PEG [26]

1.4 Những nghiên cứu gần đây

Wan-Liang Lu và cộng sự (2004) [24] đã nghiên cứu dược động học, dược

lực học, và độc tính của liposome PEG hóa trên tế bào hepatocarcinoma (Bel7402)

và tế bào hepatocarcinoma chuột (H22) trên mô hình khối u rắn ở chuột xenograft

Kết quả dược động học ở chuột cho thấy liposome doxorubicin PEG hóa kéo dài rõ

rệt thời gian lưu thông trong máu của doxorubicin Thời gian bán thải của liposome

doxorubicin dạng PEG hóa, dạng liposome thông thường và dạng tự do tương ứng

là 46,09 ± 14,44, 26,04 ± 3,34, and 23,72 ± 5,13 h Diện tích dưới đường cong nồng

độ - thời gian (AUC0 - ∞) (h.µg/g) của doxorubicin dạng liposome PEG hóa và

dạng liposome thông thường cao gấp 6,8 và 2,6 lần so với dạng tự do Khả năng gây

độc và hoạt động kháng u in vivo chỉ ra rằng hoạt tính của doxorubicin dạng

liposome PEG hóa là cao hơn so với dạng liposome thông thường hoặc tự do Sau hai tuần tiêm tĩnh mạch đuôi với một liều duy nhất 10 mg/kg liposome doxorubicin PEG hóa, không quan sát thấy tác dụng có hại trong dạ dày, niêm mạc ruột, và cơ tim, nhưng lại quan sát được trong các nhóm dùng thuốc doxorubicin dạng tự do

Do cơ chế tích tụ tại khối u của các liposome gắn PEG chủ yếu nhờ sự thoát mạch qua các mạch máu rò rỉ tại khối u, nên sự tuần hoàn kéo dài có thể sẽ làm tăng tích

tụ tại khối u bằng cách gia tăng sự luân chuyển của liposome PEG hóa qua hệ thống mao mạch khối u Các kết quả cho thấy dạng liposome PEG hóa cải thiện hiệu quả của thuốc và làm giảm độc tính, do đó cung cấp bằng chứng thuận lợi cho việc xây dựng công thức thuốc dạng liposome PEG hóa

Aryal và cộng sự (2013) [6] đã nghiên cứu việc kết hợp sóng siêu âm làm gián đoạn hàng rào máu não và hàng rào máu khối u cùng với liposome doxorubicin trên chuột có u thần kinh đệm Việc đưa thuốc vào hệ thống tuần hoàn máu não phải vượt qua rất nhiều rào cản khác nhau, vì thế liệu pháp chống ung thư não cũng gặp nhiều khó khăn Nhóm tác giả đã đánh giá tác động của 3 tuần điều trị bằng sóng siêu âm và liposome doxorubicin lên chuột có u thần kinh đệm Tế bào u đệm thần kinh được nuôi trồng trong muối earle, bổ sung huyết thanh nhau thai bò, 1% glutamin 1% MEM amino acid và 0.1% gentamicin trong 1 bình chứa 5% CO2 tại 37°C Sau khi làm sạch da sọ, rạch 1 đường dài 5 mm và tạo 1 lỗ sâu 1 mm vào sọ Chuột mẫu được tiêm 4 µl hỗn dịch tế bào ung thư Mẫu tế bào được tiêm trong 5 phút Sau 2 phút thì rút ra, và khâu da lại Ngày thứ 5 bỏ lớp vá da và bắt đầu điều trị vào ngày thứ 7 hoặc 8 Kết quả nghiên cứu cho thấy những động vật nhận được

cả sóng siêu âm và DOX có thời gian sống trung bình tăng đáng kể so với mẫu động vật chỉ nhận được 1 trong 2 phương pháp siêu âm hay DOX, hay không nhận được phương pháp điều trị nào Thời gian sống trung bình của động vật mẫu điều trị bằng

cả 2 (siêu âm và DOX) tăng 100% so với động vật không được điều trị, trong khi động vật được điều trị bằng DOX chỉ tăng 16% Động vật chỉ được điều trị bởi siêu

âm không cho thấy sự tiến triển nào Không 1 khối u nào được phát hiện trong 4/8

nhóm động vật thuộc nhóm điều trị siêu âm + DOX, và trong 2 nhóm động vật còn lại, chỉ phát hiện rất ít tế bào ung thư Tóm lại, nghiên cứu chứng minh rằng sử dụng kết hợp sóng siêu âm và liposome doxorubicin tăng cường khả năng cung cấp thuốc và có ảnh hưởng tốt tới quá trình điều trị bệnh u thần kinh đệm

Kenji Yokoi và cộng sự (2014) [40] đã nghiên cứu phương pháp sử dụng liposome doxorubicin PEG hóa để tăng tích lũy thuốc tại khối u và nâng cao hiệu quả điều trị Mặc dù doxorubicin dạng liposome PEG hóa (PEGylated liposomal doxorubicin – PLD) có thể tốt hơn doxorubicin dạng tự do vì sự tích lũy của PLD tại khối u nhờ hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ (EPR), tuy nhiên việc tăng tỉ lệ sống sót ở những bệnh nhân được điều trị tổng thể với PLD khá khiêm tốn Khi các tế bào nội mô khối u bị tổn thương do PLD, tính thấm thành mạch đối với các đại phân tử có thể được gia tăng lên do sự hình thành các lỗ lớn và sự gián đoạn của các lớp tế bào nội mô Sự tổn thương tế bào nội mô và sự gia tăng tính thấm thành mạch sẽ được dần dần khôi phục bằng các phản ứng tạo mạch của các mạch máu Do đó, tác giả đưa ra giả thuyết rằng PLD được tiêm ngay trong khoảng thời gian khi tính thấm thành mạch tăng do liều điều trị ban đầu, sẽ thoát mạch và tích lũy nhiều hơn vào khối u so với PLD được tiêm sau khi các mạch khối u đã hồi phục Chuột sau khi cấy tế bào ung thư vú 4T1 được tiêm tĩnh mạch với PLD Để đánh giá hiệu quả của PLD trên hiệu ứng EPR, FITC-liposome PEG hóa (PFL) được tiêm trước 1, 2, 3, 5, 7, hoặc 10 ngày sau khi tiêm PLD Chuột tại mỗi sáu giờ sau khi tiêm PFL bị giết, số lượng PFL thoát mạch và tích tụ trong khối u cũng như các cơ quan được đánh giá bằng hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của các mô Lượng PFL trong khối u tăng từ ngày 1 so với những con chuột không tiêm PLD Lượng đạt tối đa 2 ngày sau khi tiêm và trở về ban đầu ở ngày thứ 7 Các dữ liệu cho thấy hiệu ứng EPR thay đổi theo thời gian sau khi tiêm PLD Những hiệu ứng này chỉ được tìm thấy trong các khối u, không thấy trong các cơ quan bình thường

Năm 2015, Chastagner cùng cộng sự [11] đã nghiên cứu khả năng làm tăng tính nhạy cảm bức xạ của khối u đối với hai dạng bào chế liposome chứa doxorubicin: liposome không PEG hóa và liposome PEG hóa DOX không được sử

dụng để điều trị cho các khối u trong não do không qua được hàng rào máu não, đặc biệt khi kết hợp với liệu pháp xạ trị có thể gây nên độc tính gây nguy hiểm tính mạng Tuy nhiên khi DOX được nạp vào liposome lại có thể vượt qua các rào cản

đó Nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC để định lượng lượng DOX tập trung tại khối u trong thời gian điều trị nhất định Hiệu quả điều trị được đánh giá bằng cách xác định tỷ lệ động vật thí nghiệm sống sót sau quá trình điều trị Kết quả, sau

1 tuần điều trị bằng liposome DOX và liệu pháp xạ trị, nồng độ DOX có mặt dịch não tủy có khối u cao hơn vượt trội so với dịch não tủy không có khối u (gấp 5 lần), đối với cả liposom không PEG và liposome PEG hóa Đồng thời, so sánh trực tiếp giữa liposome PEG hóa và liposome không PEG hóa, kết quả cho thầy sự khác biệt

rõ ràng Lipsome không PEG hóa ít chịu ảnh hưởng của lịch tiêm thuốc và có xu hướng giảm mạnh vào ngày 6 và 7, trong khi liposome có mặt PEG giữ được nồng

độ dược chất khá cao và ổn định tại khối u

Nguyễn Văn Lâm và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome DOX 2 mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm và đánh giá tác dụng của chế phẩm trên khối u động vật Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film có thành phần tạo màng SPC: CHL (10:2), dược chất đưa vào liposome bằng phương pháp chủ động thông qua sự chênh lệch pH giữa hai bên màng bằng thay đệm amoni sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến ở môi trường bên ngoài liposome Giảm KTTP bằng quá trình siêu âm Liposome thu được có KTTP < 200

nm, hiệu suất liposome hóa > 80% TCCS cho thuốc tiêm liposome DOX đã được

đề xuất và thẩm định tại Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương Đánh giá tác dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ưu thế vượt trội của thuốc tiêm dạng liposome so với dạng dung dịch đặc biệt trên khối u dưới da [5]

1.5 Sơ lược mô hình đánh giá độc tính của thuốc

1.5.1 Các dòng tế bào

Các tế bào ung thư trong một khối u (bao gồm cả tế bào đã di căn) đều xuất phát từ một tế bào duy nhất phân chia mà thành Do đó ung thư có thể được phân loại theo loại tế bào khởi phát và theo vị trí của tế bào đó Tuy nhiên, trong nhiều

trường hợp, người ta không xác định được khối u nguyên phát Các tế bào thử được chia thành 4 nhóm chính: Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu

mô (ví dụ như ở ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hoá); Bệnh lý huyết học ác tính (hematological malignancy), xuất phát từ máu và tủy xương; ung thư mô liên kết (sarcoma) là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết, xương hay cơ; ung thư hắc tố (melanoma) do rối loạn của tế bào sắc tố

1.5.2 Phương pháp đánh giá độc tính trên tế bào

Với các tác nhân chống ung thư, chỉ số điều trị được đánh giá dựa vào hiệu quả điều trị và độc tính Liposome doxorubicin PEG hóa là một dạng thuốc cải tiến với mục tiêu tăng hoạt động diệt tế bào ung thư, giảm độc tính, tăng thời gian lưu thông trong hệ thống tuần hoàn Để đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư, cần tiến hành đánh giá độc tính trên tế bào Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường, nhiệt độ, thời gian thích hợp Sau đó mang đánh giá độc tính của thuốc bằng các

phương pháp khác nhau Có rất nhiều phương pháp đánh giá độc tính tế bào khác nhau, một số phương pháp thường dùng:

- Thứ nghiệm SRB (sulforhodamine B) : Phép thử tiến hành xác định tổng hàm

lượng protein tế bào dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) SRB là một thuốc nhuộm màu hồng sáng với hai nhóm sulfonic tích điện âm, hai nhóm này sẽ liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [32]

- Phương pháp nghiên cứu sàng lọc MTT: Phương pháp này dựa trên hoạt

động của enzyme dehydrogenase của ty thể trong các tế bào sống có khả năng chuyển hóa chất MTT (3 - (4,5 - Dimethylthiazol – 2 – yl) – 2,5 – diphenyltetrazolium bromide) thành một sản phẩm có màu không tan trong nước nhưng tan trong các dung dịch hòa tan MTT Khi các tế bào chết thì ty thể không còn khả năng chuyển hóa MTT thành chất màu Sản phẩm tạo ra từ phản ứng MTT

có màu đặc trưng và có thể định lượng bằng cách đo mật độ quang với bước sóng

hấp thụ đặc trưng bằng máy đọc ELISA Mật độ quang tạo ra từ phản ứng MTT cho phép xác định sự tương quan về số lượng tế bào sống/chết có mặt trong các giếng nuôi cấy [14],[3]

- Phương pháp đếm tế bào với xanh Trypan: Phương pháp này sử dụng xanh

trypan nhuộm màu tế bào để xác định trực tiếp số lượng tế bào sống hay chết trong buồng đếm Xanh trypan là loại thuốc nhuộm chỉ có thể đi qua màng tế bào chết Do

đó khi trộn dịch tế bào với thuốc nhuộm các tế bào chết sẽ phồng to lên và có màu xanh đen [35]

1.6 Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm

1.6.1 Động vật thực nghiệm

Động vật thí nghiệm dùng để đánh giá tác dụng rất đa dạng, chủ yếu tiến hành trên các chủng chuột như: BALB/c C3H/HeJ, Swiss, SCID nude, NMRI, SLC Wistar/ST [5] Chuột có thể bị cắt bỏ tuyến ức, dẫn đến giảm số lượng tế bào miễn dịch lympho T, làm giảm khả năng đào thải khối u và các mảnh ghép [17]

1.6.2 Phương pháp đánh giá tác dụng

Động vật thực nghiệm là chuột thường chọn những con từ 6 – 8 tuần tuổi, nặng từ 20 – 26g với chuột nhắt và 250 – 300g với chuột cống Các tế bào sau khi nuôi cấy sẽ được đem cấy truyền vào cơ thể động vật thực nghiệm, vị trí cấy khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào ung thư Với sự cấy truyền u vào cơ thể chuột có thể tiến hành bằng cách ghép khối u hoặc tiêm hỗn dịch của tế bào u từ cơ thể chuột đã mang u sẵn sang cơ thể chuột thực nghiệm Số lượng tế bào mang cấy khoảng 105 –

107/động vật Sau đó, chuột được chia thành các nhóm để tiến hành điều trị bằng các công thức khác nhau Liều tiêm tùy thuộc từng thí nghiệm Thời điểm bắt đầu tiến hành cũng rất khác nhau tùy từng thí nghiệm, có thể điều trị ngay sau khi cấy truyền tế bào thành công, cũng có thể để khối u phát triển một cách chắc chắn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Liposome DOX PEG hóa

2.1.2 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu được sử dụng

chuẩn

7

HEPES

(N-2-hydroxy ethyl piperazin – N –

2 – ethan sulfonic acid)

(ethylen glycolether) Amresco Ohio-Mỹ TKHH

15 Natri laurylsufat Trung Quốc BP

19

MTT [3 - (4,5 - Dimethylthiazol – 2

– yl) – 2,5 – diphenyltetrazolium

bromide]

ATCC, Hoa Kỳ

- Chuột thiếu hụt miễn dịch BALB/c, không có tế bào lympho T (nude mice,

Foxn1nu) được nhập khẩu từ Công ty Charly-River

Medium, (công ty ATCC, Hoa Kỳ) được bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh

penicillin và streptomycine

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu

cỡ lỗ 50kD, diện tích lọc 20cm2 (Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich-Đức)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin PEG hóa

Dựa theo kết quả của các nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin đã đạt được [2], kết hợp với các nghiên cứu trên thế giới [33], liposome doxorubicin PEG hóa được bào chế qua các giai đoạn sau:

2.3.1.1 Chế tạo liposome chưa mang dược chất

Tạo lớp film lipid: hòa tan HSPC, cholesterol, DSPE-PEG 2000 (với tỉ lệ về

khối lượng là 3 : 3 : 1) trong cloroform rồi bốc hơi hết dung môi trên thiết bị cất quay với các thông số: tốc độ 50 vòng/phút, nhiệt độ 50°C, thời gian bốc hơi dung môi là 12h

Hydrat hóa: Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/phút và tăng nhiệt độ lên 60°C,

cho đệm citrat pH 4 vào bình cất quay Sau 2h hydrat hóa sẽ thu được hỗn dịch liposome có màu trắng, đục

2.3.1.2 Làm giảm kích thước tiểu phân

Sử dụng thiết bị nén áp suất cao, với khí nén là ni-tơ Nén lặp lại nhiều chu

kỳ ở điều kiện nhiệt độ vào áp suất thích hợp đến khi đạt kích thước và phân bố kích thước mong muốn Sau cùng lọc hỗn dịch qua màng 0,2 µm để loại các tiểu phân kích thước to

2.3.1.3 Tiến hành đổi hệ đệm

Sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến Liposome được lọc qua cột lọc tiếp tuyến, đổi môi trường bên ngoài từ dung dịch đệm citrat pH 4 thành đệm HEPES/NaCl pH 7,4

2.3.1.4 Nạp dược chất doxorubicin vào liposome

Hòa tan doxorubicin vào hỗn dịch liposome đã đổi hệ đệm để đạt hàm lượng

2 mg/ml Ủ ở 50°C trong thời gian thích hợp Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 2 - 8°C

2.3.2 Phương pháp đánh giá liposome tạo ra

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hình thái và cấu trúc liposome

Sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản xác định hình thái và cấu trúc của liposome

2.3.2.2 Phương pháp đánh giá kích thước và phân bố kích thước

Pha loãng mẫu liposome 100 lần ( hoặc pha loãng bằng lượng nước cất vừa

đủ sao cho count rate nằm trong khoảng 200 – 400 kcps) bằng dung dịch NaCl

0,9% rồi đo kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân bằng kỹ thuật tán

xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Zetasizer ZS90 Đánh giá KTTP và phân bố KTTP dựa vào giá trị đường kính trung bình (Z average), bảng và đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, chỉ số đa phân tán (PDI)

2.3.2.3 Phương pháp định lượng

- Định lượng doxorubicin toàn phần

Dựa theo tham khảo USP34-NF30 [38], định lượng doxorubicin bằng phương pháp HPLC (điều chỉnh điều kiện sắc ký cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm) Hệ sắc ký gồm:

Pha động: Hòa tan 1g natri lauryl sulfat vào 1000 ml hỗn hợp gồm nước -

acetonitril – methanol - acid phosphoric theo tỷ lệ (400:450:150:2), điều chỉnh đến

pH 3,6 ±0,1 bằng dung dịch natri hydroxyd 2 N

Dung dịch phân giải: Hòa tan 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn trong 5 ml

nước, thêm 5 ml acid phosphoric, để yên 30 phút Điều chỉnh bằng dung dịch natri hydroxyd 2M đến pH 2,6 ± 0,1 Thêm 15 ml acetonitril và 10 ml methanol, lắc kỹ, lọc qua màng lọc milipore 0,45µm

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 10 mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa

tan trong pha động để đạt nồng độ 40 µg/ml, lọc qua màng lọc milipore 0,45µm Tiêm lần lượt dung dịch phân giải, dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký

Detector: UV –VIS, 254 nm

Tốc độ dòng: 1,2 ml/ phút

Thể tích tiêm: 20 µl

Yêu cầu của hệ sắc ký: Số đĩa lý thuyết không được nhỏ hơn 2000, hệ số bất đối

xứng của pic chính không được quá 1,5; hệ số phân giải của 2 pic doxorubicin và doxorubicinon không được nhỏ hơn 5,5 (thời gian lưu tương đối pic doxorubicinon

là 0,4 và của doxorubicin là 1,0 Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic doxorubicin hydroclorid với 6 lần tiêm không được lớn hơn 2%

Dung dịch thử: Lấy 1 ml chế phẩm tương ứng 2 mg doxorubicin Thêm 1ml

dung dịch Triton X100 10% Lắc kỹ rồi pha loãng với pha động để đạt hàm lượng khoảng 40 µg/ml Để yên 2h Ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút Lấy phần dịch trong Chạy sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử, dựa vào diện tích pic của mẫu chuẩn và thử để tính ra hàm lượng DOX toàn phần

- Định lượng doxorubicin tự do – Hiệu suất liposome hóa (hàm lượng DOX gắn vào liposome)

Sử dụng phương pháp thẩm tích

Điều kiện sắc ký và pha động: tương tự phần định lượng doxorubicin

hydroclorid nhưng thể tích tiêm mẫu là 100 µl

Dung dịch thử: Lấy chính xác 1,0 ml chế phẩm cho vào túi thẩm tích, kẹp kín

túi, nhúng túi thẩm tích sao cho phần chứa thuốc ngập sâu trong chai thủy tinh chứa 100ml dung dịch đệm pH 4,0 Để yên 24h ở nhiệt độ từ 5 - 100C Sau 24 h dừng thẩm tích Lấy dung dịch ngoài túi thẩm tích lọc qua màng lọc 0,45 µm Dịch lọc được sử dụng để chạy sắc ký

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa

tan trong pha động để có nồng độ khoảng 2 µg/ml

Tiến hành định lượng Doxorubicin hydrocl orid trong môi trường ngoài túi thẩm tích bằng phương pháp HPLC

Tính kết quả dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic, thể tích dung dịch thử, hàm lượng các chất chuẩn, độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn tính ra hàm lượng doxorubicin hydroclorid tự do đã thẩm tích vào môi trường đệm phosphat pH = 4 Hàm lượng doxorubicin liposome hóa tính theo công thức:

- Định lượng lipid - tỷ lệ dược chất/lipid

Phospholipid là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp màng liposome, các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh tỉ lệ dược chất/lipid có ảnh hưởng trực tiếp tới độ ổn định và khả năng giải phóng dược chất của dạng bào chế liposome nói chung [41],[21] Chính vì vậy, định lượng lipid là một trong những tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lượng của liposome doxorubicin

Tham khảo các nghiên cứu của Stewart và cộng sự [34] định lượng phospholipid bằng phương pháp đo quang, kết hợp điều chỉnh các điều kiện thí nghiệm cho phù hợp đã xây dựng được phương pháp định lượng phospholipid như sau:

Nguyên tắc: phospholipid có khả năng tạo phức màu với sắt amoni thiocyanat,

dựa vào phương pháp đo quang để xác định nồng độ phospholipid

Mẫu chuẩn: : Cân chính xác khoảng 10 mg HSPC cho vào bình định mức 100

ml, hòa tan bằng cloroform Thêm tiếp cloroform tới vạch thu được dung dịch chuẩn có nồng độ phospholipid khoảng 0,1 mg/ml tương ứng 0,13 µmol/ml Lần lượt hút 0, 1, 2, 4, 6, 8 và 10 ml dung dịch chuẩn vào bình định mức 20 ml Thêm vừa đủ bằng cloroform tới vạch, lắc đều, thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ phospholipid lần lượt là: 0; 0,006; 0,013; 0,025; 0,038; 0,051; 0,063 µmol/ml Lần lượt cho vào các ống ly tâm mỗi ống 5 ml dãy dung dịch chuẩn, 5 ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat Lắc xoáy mỗi ống trong 20 giây Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, gạn lấy pha cloroform

Mẫu thử: Hút 1 ml chế phẩm ( nồng độ phospholipid toàn phần khoảng 13,36

µmol/ml) Thêm ethanol và cloroform vào với tỉ lệ thể tích lần lượt là chế phẩm: ethanol : cloroform = 2 : 1 : 2, lắc nhẹ nhàng tạo dung dịch đồng nhất Bốc hơi trong tủ sấy chân không ở 60°C cho tới khi thu được cắn (8-12h) Thêm chính xác

100 ml cloroform để hoà tan cắn đạt nồng độ khoảng 0,13 µmol/ml Hút 6 ml dung dịch pha loãng vào bình định mức 20 ml Thêm vừa đủ cloroform tới vạch, lắc đều, thu được dung dịch thử có nồng độ phospholipid khoảng 0,04 µmol/ml Cho vào

ống ly tâm 5 ml dung dịch mẫu thử, 5 ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat Lắc xoáy mỗi ống trong 20 giây Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, gạn lấy pha cloroform Tiến hành lặp lại 3 lần

Mẫu trắng: cho 5 ml chloroform và 5 ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat vào

ống ly tâm Lắc xoáy mỗi ống trong 20 giây Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, gạn lấy pha cloroform

Đo độ hấp thụ của mẫu trắng, dãy chuẩn, mẫu thử trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến tại bước sóng 475 nm Dựa vào độ hấp thụ của dãy chuẩn xây dựng đường thẳng sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ phospholipid Tính toán nồng độ phospholipid toàn phần (µmol/ml) trong dung dịch thử dựa vào độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử và phương trình đường chuẩn Tỉ lệ mol dược chất/phospholipid được tính dựa vào kết quả định lượng phospholipid và định lượng doxorubicin toàn phần

2.3.3 Phương pháp đánh giá thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa

Với thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa đánh giá tất cả các chỉ tiêu như với liposome doxorubicin PEG hóa nhưng có đánh giá thêm các chỉ tiêu sau:

- Dãy 1: Môi trường nuôi cấy bình thường (nhóm chứng, 6 – 8 giếng)

- Dãy 2: Môi trường nuôi cấy có Doxorubicin 1 µg/ml

- Dãy 3: Môi trường nuôi cấy có Doxorubicin 10 µg/ml

- Dãy 4: Môi trường nuôi cấy có Doxorubicin 100 µg/ml

Căn cứ kết quả thử nghiệm MTT, tính tỷ lệ phần trăm tế bào sống trong các giếng sử dụng hóa chất so với nhóm chứng không bổ sung mẫu nghiên cứu Dựa trên tỷ lệ tế bào sống trong các nhóm nghiên cứu và nồng độ hóa chất sử dụng tính liều ức chế 50% tế bào (IC50) của thuốc ở các thời điểm 24, 48 và 72 giờ trên các dòng tế bào ung thư theo công thức [37]:

IC 50 = (50%-Low Inh% )/(High Inh% -Low Inh% )x(High Conc -Low Conc ) + Low Conc

Trong đó:

Low Inh (low inhibition): % ức chế trực tiếp < 50% tế bào

High Inh (high inhibition): % ức chế trực tiếp > 50% tế bào

Low conc: nồng độ tương ứng của chất có Low Inh (ức chế < 50% tế bào) High conc: nồng độ tương ứng của chất có High Inh (ức chế > 50% tế bào)

2.3.5 Phương pháp đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome dox PEG hóa trên khối u chuột

Chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn dịch, không có tế bào lympho T (nude mice, Foxn1nu) được nhập khẩu từ Công ty Charly-River Chuột được nuôi trong điều kiện phòng sạch, không khí được lọc và có áp lực dương tính Nhiệt độ phòng được duy trì ở 28 ± 0,50C, độ ẩm 55 ± 5%, ánh sáng được tự động điều khiển bật lúc 7h00, tắt lúc 19h00 Thức ăn (Zeigler, Hoa Kỳ) và nước uống được tiệt trùng trước khi sử dụng Chuột được nuôi thành nhóm 5 con mỗi lồng Lồng chuột được

để trên hệ thống giá có thông khí độc lập và lọc qua màng bảo đảm khả năng cách

ly tốt với mầm bệnh Dung dịch tế bào ung thư đã chuẩn bị được hút vào bơm tiêm 1ml với số lượng 107/ml Nude mice được cố định và tiêm 0,1 ml vào dưới da đùi phải (106 tế bào/chuột) Quá trình thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối Sau khi khối u phát triển với kích thước khoảng trên 10mm đường kính (sau khi ghép tế bào khoảng 3 tuần), chuột ở mỗi nhóm cấy tế bào A549 và HT29 được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm, mỗi nhóm 5 con:

- Nhóm đối chứng (1): tiêm dung dịch nước muối sinh lý vào tĩnh mạch với thể tích 0,5 ml/g

nghiên cứu với liều 5 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột

lượng cơ thể chuột

lượng cơ thể chuột

Các thuốc được pha loãng với dung dịch natri clorid 0,9% để đạt nồng độ 0,1 ml/10g thể trọng Thuốc được điều trị 1 lần/tuần x 3 lần

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm làm 3 lần và lấy kết quả theo giá trị trung bình ± SD

Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel

2.3.7 Điều kiện thí nghiệm

DOX là một chất có độc tính, không dễ khuếch tán hay bay hơi nhưng có khả năng lây nhiễm qua dụng cụ, môi trường thí nghiệm và tiếp xúc trực tiếp Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện:

thí nghiệm Có thiết bị bảo hộ cho người làm nghiên cứu

ngâm với dung dịch sulfocromat để oxy hóa hết DOX