2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp đánh giá liposome tạo ra
2.3.2.1. Phương pháp đánh giá hình thái và cấu trúc liposome
Sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản xác định hình thái và cấu trúc của liposome.
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá kích thước và phân bố kích thước
Pha loãng mẫu liposome 100 lần ( hoặc pha loãng bằng lượng nước cất vừa đủ sao cho count rate nằm trong khoảng 200 – 400 kcps) bằng dung dịch NaCl 0,9% rồi đo kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Zetasizer ZS90. Đánh giá KTTP và phân bố KTTP dựa vào giá trị đường kính trung bình (Z average), bảng và đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, chỉ số đa phân tán (PDI).
2.3.2.3. Phương pháp định lượng
- Định lượng doxorubicin toàn phần
Dựa theo tham khảo USP34-NF30 [38], định lượng doxorubicin bằng phương pháp HPLC (điều chỉnh điều kiện sắc ký cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm). Hệ sắc ký gồm:
Pha động: Hòa tan 1g natri lauryl sulfat vào 1000 ml hỗn hợp gồm nước - acetonitril – methanol - acid phosphoric theo tỷ lệ (400:450:150:2), điều chỉnh đến pH 3,6 ±0,1 bằng dung dịch natri hydroxyd 2 N.
Dung dịch phân giải: Hòa tan 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn trong 5 ml nước, thêm 5 ml acid phosphoric, để yên 30 phút. Điều chỉnh bằng dung dịch natri hydroxyd 2M đến pH 2,6 ± 0,1. Thêm 15 ml acetonitril và 10 ml methanol, lắc kỹ, lọc qua màng lọc milipore 0,45àm.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 10 mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa tan trong pha động để đạt nồng độ 40 àg/ml, lọc qua màng lọc milipore 0,45àm.
Tiêm lần lượt dung dịch phân giải, dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký.
Detector: UV –VIS, 254 nm.
Tốc độ dòng: 1,2 ml/ phút.
Thể tớch tiờm: 20 àl.
Yêu cầu của hệ sắc ký: Số đĩa lý thuyết không được nhỏ hơn 2000, hệ số bất đối xứng của pic chính không được quá 1,5; hệ số phân giải của 2 pic doxorubicin và doxorubicinon không được nhỏ hơn 5,5 (thời gian lưu tương đối pic doxorubicinon là 0,4 và của doxorubicin là 1,0. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic doxorubicin hydroclorid với 6 lần tiêm không được lớn hơn 2%.
Dung dịch thử: Lấy 1 ml chế phẩm tương ứng 2 mg doxorubicin. Thêm 1ml dung dịch Triton X100 10%. Lắc kỹ rồi pha loãng với pha động để đạt hàm lượng khoảng 40 àg/ml. Để yờn 2h. Ly tõm 6000 vũng/phỳt trong 15 phỳt. Lấy phần dịch trong. Chạy sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử, dựa vào diện tích pic của mẫu chuẩn và thử để tính ra hàm lượng DOX toàn phần.
- Định lượng doxorubicin tự do – Hiệu suất liposome hóa (hàm lượng DOX gắn vào liposome)
Sử dụng phương pháp thẩm tích.
Điều kiện sắc ký và pha động: tương tự phần định lượng doxorubicin hydroclorid nhưng thể tớch tiờm mẫu là 100 àl.
Dung dịch thử: Lấy chính xác 1,0 ml chế phẩm cho vào túi thẩm tích, kẹp kín túi, nhúng túi thẩm tích sao cho phần chứa thuốc ngập sâu trong chai thủy tinh chứa 100ml dung dịch đệm pH 4,0. Để yên 24h ở nhiệt độ từ 5 - 100C. Sau 24 h dừng thẩm tớch. Lấy dung dịch ngoài tỳi thẩm tớch lọc qua màng lọc 0,45 àm. Dịch lọc được sử dụng để chạy sắc ký.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa tan trong pha động để cú nồng độ khoảng 2 àg/ml.
Tiến hành định lượng Doxorubicin hydrocl orid trong môi trường ngoài túi thẩm tích bằng phương pháp HPLC.
Tính kết quả dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic, thể tích dung dịch thử, hàm lượng các chất chuẩn, độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn tính ra hàm lượng doxorubicin hydroclorid tự do đã thẩm tích vào môi trường đệm phosphat pH = 4.
Hàm lượng doxorubicin liposome hóa tính theo công thức:
- Định lượng lipid - tỷ lệ dược chất/lipid
Phospholipid là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp màng liposome, các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh tỉ lệ dược chất/lipid có ảnh hưởng trực tiếp tới độ ổn định và khả năng giải phóng dược chất của dạng bào chế liposome nói chung [41],[21]. Chính vì vậy, định lượng lipid là một trong những tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lượng của liposome doxorubicin.
Tham khảo các nghiên cứu của Stewart và cộng sự [34] định lượng phospholipid bằng phương pháp đo quang, kết hợp điều chỉnh các điều kiện thí nghiệm cho phù hợp đã xây dựng được phương pháp định lượng phospholipid như sau:
Nguyên tắc: phospholipid có khả năng tạo phức màu với sắt amoni thiocyanat, dựa vào phương pháp đo quang để xác định nồng độ phospholipid.
Mẫu chuẩn: : Cân chính xác khoảng 10 mg HSPC cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan bằng cloroform. Thêm tiếp cloroform tới vạch thu được dung dịch chuẩn cú nồng độ phospholipid khoảng 0,1 mg/ml tương ứng 0,13 àmol/ml. Lần lượt hút 0, 1, 2, 4, 6, 8 và 10 ml dung dịch chuẩn vào bình định mức 20 ml. Thêm vừa đủ bằng cloroform tới vạch, lắc đều, thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ phospholipid lần lượt là: 0; 0,006; 0,013; 0,025; 0,038; 0,051; 0,063 àmol/ml. Lần lượt cho vào các ống ly tâm mỗi ống 5 ml dãy dung dịch chuẩn, 5 ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat. Lắc xoáy mỗi ống trong 20 giây. Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, gạn lấy pha cloroform.
Mẫu thử: Hút 1 ml chế phẩm ( nồng độ phospholipid toàn phần khoảng 13,36 àmol/ml). Thờm ethanol và cloroform vào với tỉ lệ thể tớch lần lượt là chế phẩm:
ethanol : cloroform = 2 : 1 : 2, lắc nhẹ nhàng tạo dung dịch đồng nhất. Bốc hơi trong tủ sấy chân không ở 60°C cho tới khi thu được cắn (8-12h). Thêm chính xác 100 ml cloroform để hoà tan cắn đạt nồng độ khoảng 0,13 àmol/ml. Hỳt 6 ml dung dịch pha loãng vào bình định mức 20 ml. Thêm vừa đủ cloroform tới vạch, lắc đều, thu được dung dịch thử cú nồng độ phospholipid khoảng 0,04 àmol/ml. Cho vào
ống ly tâm 5 ml dung dịch mẫu thử, 5 ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat. Lắc xoáy mỗi ống trong 20 giây. Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, gạn lấy pha cloroform. Tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu trắng: cho 5 ml chloroform và 5 ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat vào ống ly tâm. Lắc xoáy mỗi ống trong 20 giây. Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, gạn lấy pha cloroform.
Đo độ hấp thụ của mẫu trắng, dãy chuẩn, mẫu thử trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến tại bước sóng 475 nm. Dựa vào độ hấp thụ của dãy chuẩn xây dựng đường thẳng sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ phospholipid. Tính toán nồng độ phospholipid toàn phần (àmol/ml) trong dung dịch thử dựa vào độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử và phương trình đường chuẩn. Tỉ lệ mol dược chất/phospholipid được tính dựa vào kết quả định lượng phospholipid và định lượng doxorubicin toàn phần.