CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
3.1. Hoàn thiện quy trình bào chế liposome DOX PEG hóa quy mô 100 lọ/mẻ
Theo như các nghiên cứu trước đây [4], bào chế liposome DOX ở quy mô phòng thí nghiệm (tối đa 5 lọ 10ml/mẻ) gồm có các bước chính như sau:
- Bước 1: Hòa tan các thành phần trên vào chloroform, cho vào bình cầu cất quay tạo màng film lipid mỏng.
- Bước 2: Hydrat hóa bằng 50 ml đệm citrat pH 4 tạo hỗn dịch liposome.
- Bước 3: Giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp đùn qua màng sử dụng thiết bị mini extruder, thể tích mỗi lần đùn là 1 ml. Đùn lặp lại nhiều lần qua các màng polycarbonat có kích thước lỗ lọc giảm dần đến khi đạt yêu cầu về KTTP và độ đồng nhất.
- Bước 4: Đổi đệm qua cột lọc tiếp tuyến.
- Bước 5: Nạp dược chất.
Với quy trình bào chế trên, ta có thể thấy bước quyết định thể tích sản phẩm cuối là bước giảm kích thước tiểu phân. Do thể tích mỗi lần đùn bị giới hạn 1 ml/lần, đồng thời phải đùn lặp lại nhiều lần 15 – 20 chu kỳ/màng lọc, qua nhiều lớp màng lọc khác nhau có kích thước giảm dần (400 – 200 – 100 – 50 nm), hiệu suất đùn không cao, thể tích liposome bị mất trong giai đoạn này là lớn nhất nên thời gian giảm kích thước tiểu phân kéo dài, thể tích liposome đồng nhất hóa hạn chế trong khoảng 50 ml.
Vì vậy, để nâng cấp quy mô bào chế, cần thay đổi phương pháp giảm KTTP để tăng thể tích liposome được đồng nhất hóa. Tiến hành khảo sát giảm kích thước tiểu phân bằng máy nén áp suất cao, sử dụng khí nén itơ.
Hỗn dịch liposome sau khi bào chế xong cho vào bình chứa của máy nén, cố định nhiệt độ hỗn dịch ở 60°C, thay đổi áp suất của máy nén áp suất cao. Hỗn dịch liposome được nén ép qua nhiều chu kỳ, kiểm tra KTTP và PDI, nén ép đến khi đạt
được kết quả mong muốn. Hình 3.1 thể hiện sự thay đổi KTTP và PDI của liposome sau khi được nén ép qua nhiều chu kì và dưới áp suất khác nhau.
Hình 3.1. Sự thay đổi KTTP và PDI của liposome sau khi nén ép dưới áp suất và chu kì khác nhau.
Khi so sánh khả năng làm giảm và đồng nhất kích thước liposome ở hai áp suất khác nhau, chúng ta có thể thấy ở cả hai áp suất liposome giảm nhanh cả về kích thước và đồng nhất hơn so với khi mới bào chế. Liposome mới tạo ra có kích thước rất lớn (1000 nm), và không đồng đều (PDI gần 1). Sau 15 chu kì nén, kích thước và PDI giảm rõ rệt: PDI ~ 1 giảm xuống 0,108; KTTP từ gần 1000 nm giảm xuống dưới 100 nm. Ở áp suất 10.000 psi, kích thước và PDI giảm nhanh hơn so với 5000 psi. Tuy nhiên từ chu kì thứ 10 trở đi, khi tiếp tục nén kích thước vào PDI của liposome giảm không đáng kể. Do đó, nghiên cứu lựa chọn thông số áp suất 10000 psi và 10 chu kì nén cho quá trình giảm KTTP để tiết kiệm khí nitơ và thời gian nén.
Song song tiến hành đùn tay giảm KTTP bằng mini extruder để so sánh, tiến hành đùn qua các cỡ màng kích thước giảm dần từ 400 – 50 nm, kết quả được thể hiện ở hình 3.2.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0 50 100 150 200 250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
PDI
KTTP (nm)
Số chu kỳ nén ép
KTTP 5000 PSI KTTP 10000 PSI PDI 5000 PSI PDI 10000 PSI
Hình 3.2. So sánh hai phương pháp đùn tay và nén áp suất cao qua 15 chu kì Như vậy, phương pháp nén áp suất cao tuy không đạt được độ đồng nhất cao như đùn tay qua mini extruder nhưng PDI vẫn nằm trong giới hạn cho phép đối với thuốc tiêm, và kích thước tiểu phân thu được sau khi nén qua 10 chu kì ở áp suất 10.000 psi nhỏ hơn nhiều so với đùn tay (<100 nm).
Hình 3.3. Ảnh chụp TEM liposome
Kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (hình 3.3) cho thấy liposome sau khi nén ép có kích thước khá đồng đều, kích thước các tiểu phân cỡ 80 – 130 nm,
0 0.05 0.1 0.15 0.2
0 20 40 60 80 100 120 140 160
5000 psi 10.000 psi Mini extruder
PDI
KTTP (nm)
KTTP PDI
các tiểu phân liposome có lớp vỏ mỏng. Liposome sau khi nạp dược chất có kích thước và độ đồng nhất thay đổi không nhiều so với trước khi nạp.
Từ những kết quả thu được, kết hợp tham khảo các nghiên cứu trước đây [5], nghiên cứu đưa ra quy trình bào chế thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa với quy mô 100 lọ 10 ml/mẻ như sau:
Bước 1: Chuẩn bị
- Các dụng cụ pha chế và chai, lọ thủy tinh đựng mẫu được rửa sạch, tráng nước cất và sấy ở 180°C trong 2h.
- Pha 1L dung dịch đệm citrat pH 4, lọc qua màng cellulose nitrat 0,2 àm.
Đóng vào chai thủy tinh. Pha 10L dung dịch đệm HEPES pH 7,4, lọc qua màng cellulose nitrat 0,2 àm. Đúng vào chai thủy tinh.
- Hấp tiệt khuẩn cột lọc tiếp tuyến cùng các đường ống dẫn, chai đựng dung dịch đệm citrat, chai đựng dung dịch đệm HEPES ở 121°C, 15 phút.
- Buồng chứa của máy nén áp suất được rửa sạch với cồn và nước cất 2 lần.
- Phòng vô khuẩn được lau sạch trần, tường, sàn, bàn và các thiết bị bên trong bằng nước, sau đó lau lại bằng cồn 70°.
- Chuyển toàn bộ các thiết bị, dụng cụ đã sấy và hấp tiệt khuẩn vào phòng vô khuẩn. Tiệt khuẩn lại các thiết bị, dụng cụ không hấp tiệt khuẩn với tia UV trong tủ an toàn sinh học trong 1h trước khi bắt đầu tiến hành giai đoạn tiếp theo.
Bước 2: Bào chế liposome doxorubicin PEG hóa
Các bước bào chế được tiến hành theo sơ đồ hình 3.4. Cất quay xong, tất cả cả các khâu tiếp theo được thực hiện trong phòng vô khuẩn.
Hình 3.4. Sơ đồ bào chế thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa quy mô 100 lọ/mẻ Bốc hơi dung môi 12h
trên thiết bị cất quay với bình cầu dung tích
2 lít
HSPC: 9,58 g Cholesterol: 3,19 g DSPE – PEG: 3,19 g
Nhiệt độ: 50°C Tốc độ: 50 vòng/phút Hút chân không
Hòa tan trong chloroform. Lọc qua
màng PTFE 0,2 àm
Hydrat hóa trong 2h Nhiệt độ: 60°C
Tốc độ: 80 vòng/phút Hút chân không
1000 ml dung dịch đệm citrat pH 4
Đồng nhất hóa bằng phương pháp nén dưới áp suất cao
Nhiệt độ: 60°C Áp suất : 10.000 psi Số chu kì nén : 10 chu kì
Lọc qua màng cellulose nitrat 0,2 àm Lọc tiếp tuyến
10 lít dung dịch đệm HEPES pH = 7,4.
Thiết bị: MicroKros Màng PS 50 kD pH = 7,4
Khuấy từ liên tục ở nhiệt độ 55°C trong 15 phút
DOX hydroclorid
Bảo quản ở 2-8°C Tránh ánh sáng
Để hỗn dịch trở về nhiệt độ phòng, lọc qua màng 0,2 àm đúng lọ, vít nắp nhôm
Chai lọ, nút cao su, nút nhôm
Bào chế 3 mẻ thuốc tiêm theo quy trình trên rồi đánh giá các chỉ tiêu của thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa đã nêu ở mục 2.3.3. Kết quả đánh giá thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Chất lượng thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa 2 mg/ml
STT Chỉ tiêu Kết quả đánh giá
1 Hình thức Hỗn dịch màu đỏ cam
2 pH 7,1
3 Thể tích (ml) 10,1
4 KTTB (d.nm) 95 ± 10
5 Chỉ số đa phân tán – PDI 0,138 ± 0,02 6 Hàm lượng DOX toàn phần 2,053 ± 0,009 7 Tỉ lệ DOX liposome hóa (%) 93,5 ± 2,3 8 Tỉ lệ dược chất/lipid (àg/àmol) 138,41 ± 0,023