Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)
Trang 1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HOC VIEN QUAN Y
KHANH THI NHI
NGHIEN CUU BAO CHE VA DANH GIA
Trang 2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BO QUOC PHONG
HOC VIEN QUAN Y
KHANH THI NHI
NGHIEN CUU BAO CHE VA DANH GIA
TAC DUNG TREN KHOI U THUC NGHIEM THUOC TIEM
LIPOSOME DOXORUBICIN
Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc
Mã số : 62 72 04 02
LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ
2.PGS.TS.Nguyễn Minh Chính HÀ NỘI - NĂM 2017
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bat kỳ công trình nào khác
Tác giả
Trang 4LỜI CÁM ƠN
Trong quả trình hoc tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được
sự giúp đỡ tận tình của các Thây cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp và những người thân trong gia đình
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng đặc biệt và biết ơn sâu sắc tới: PGS TS Pham Thị Minh Huệ
PGS TS Nguyén Minh Chinh
Những người Thấy đã tận tình trang bị cho tôi kiến thức quý báu trong chuyên môn, ngh nghiệp cũng như trong nghiên cứu khoa học Các Thấy đã luôn bên tôi, động viên tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cám ơn chân thành tới: Ban Giám đốc, phòng Sau đại học, các Thây Cô Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược, Bộ môn Sinh Lý Bệnh, Bộ môn Dược Lÿ - Học viện Quân Y da tao mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trinh học tập và nghiên cứu
Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Bào chế Trường đại học Dược Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện vệ sinh dịch tễ Trung
ương đã tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành luận án
Tôi xin được gửi lời cám ơn chân thành tới Trung tâm Y Tế Hoài Đức Hà Nội, sở Y tế Hà Nội, các anh/chị đồng nghiệp, người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để tơi hồn thành luận án
Ngày tháng năm 2017
Trang 5MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Ký hiệu viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐÈ Chương1.TỎNG QUAN
1.1.Đại cương về doxorubicin -2-s¿©s22++2+++2Ex++rx+eExzvrrxezrxerrseeee 3
1.1.1 Đặc điểm hóa lý: 22- 5s 2s E2 E271 2112112111111 1e 3 1.1.2 Độ ồn định 2222+vcctEE1111 tr 4 1.1.3 Cơ chế tác dụng . ¿¿2++222++22E++t22EEtEEEErEEEErrrkrrrrkrrrrkrree 6 1.1.4 Các đạng bào chế của doxorubicin -¿- + ©s2csz+cxzsczsez 6 1„1;5 Dược động HOGisaassssessraioitosogtttoivii21183463105959014414105XXã480659005883.81033 8 1;1:6: ChỈ/đIHđaessszseenniiitsiiintittg0STTASE0T1803XGXEGGSDNISUSISSSIGt4 1A 56g88 9 II? 5 4354 10 1.1.8 Liều lượng -2¿2¿©2++©+++2EESEEEEEEEEEEEEEE2E22E2EEErkrrrkrrrred 11 1.2 Dai curong Vé liposome .sscecssesssssecsssecssssecsssecssseccsseccsssccssseeesseccsseeesses 12 II Niên 0O 4 12
Trang 61.2.5 Phương pháp bào chế liposome -2- 2-22 ©++++++zxzz+zsd 18 1.2.6 Dannh 00009 vcaiaiadđầida - 21 1.3 Các nghiên cứu về liposome doxorubicin -z©z+c5s2 26 1.3.1 Nghiên cứu bào ChẾ 2° ©22c22222EE22221227122713121122112711211221ec xe 26
1.3.2; Danh giá tác dụng H7 VŨVO tacgaatititttitictit84118811111591205165G8011418388545888 33
Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU,THIẾT BỊ, ĐÓI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . -ccccccvceeeesassee 38
2;1:.Nguyên :vật HIẾN: sxescasaxxesgiixii0215400111044558511311804485145555043158631538454X558 38 2.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu - 2 +¿++++x++2zx++zxzzrxzezzx 39 2.3 Đối tượng nghiên cứu -¿-©z+2Ex2E+z+EEEtEEEEEEESEEErrrkerrkrrree 40 2.4 Phương pháp nghiên CỨU 5 55+ £+*£+E++EE+EEseeseereeeeeereree 41 2.4.1 Phuong phap ba0 Ch6 ccccccscsesssesssessssesssessssessseessessseesssecssecesecenes 41 2.4.2 Phuong phap danh gia cac dac tinh liposome doxorubicin 45 2.4.3 Phuong phap danh gia chat lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin 2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng cua liposome doxorubicin trên khối QC ORB Vũ vcssssscnssseersensas meses amma 52 2.5 Phương pháp xử lý số liệu -¿+++2+++2v+++cvve+trxrerres 55 P.fïiỂuLkiềh thímphiỜitasssesseginssrntrettottitinh/S0G0S0I20000180100009/0000005809300080 56 2.7 Địa điểm nghiên cứu -¿- + ©2s+Ex2 E121 2112112121121 re 56
Chương 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU
3.1 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin
Trang 7
3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của tý lệ các thành phần đến đặc tính của liposorme dOXOTUDIGIT sx:sxcsz:i252663073565565030336151956E55E5SSS5ASEXHEXEESHSXSESRSHSA3E91855815XE 66 3.3 Kết quả xây dựng qui trình bào chế liposome đoxorubicin 76 3.3.1 Bào chế liposome chưa mang được chất . -2- 2s 76 3.3.2 Quá trình đưa được chất vào liposome -2-c-¿©2cz+c+ 84 3.4 Kết quả bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 92 3.5 Kết quả đề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ôn định của thuốc tiêm
Tiposome dOXOLUDTGÌHzzxszzixssc2i2215511511843663058963351515518SSESEISSSRSSSSSSSESESESIEEETSESE 96 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn ¿- 2+©+s+2+z+EE+EEESEEEEEEEEEEEEkrrkrrrerrrrrex 96 3.5.2 Đánh giá độ ơn định 2-2¿©++++++2Ext2Ex+erxxerrxrsrxerrxerrrs 98 3.6 Kết quả đánh giá tác dụng của thuốc tiém liposome doxorubicin trên
khối u 191110 118101049311340119117 5T `“ cốc 103
3.6.1 Đánh giá trên chuột nhắt mang tế bào ung thư Sacoma TG 180 103 3.6.2 Đánh giá tác dụng trên khối u chuột thiếu hụt miễn dịch mang tế bảo ung thư tiền liệt tuyến -2- 2+ ©22£+2E++2EE+EEEtEEEEvEEErrrkrrrkeree 109 Chương 4: BÀN LUẬN s °-s<cscesvsscssevseersersserseessersserssre 112 4.1 Phương pháp bào chế liposome -.2- 2 22©2+£x2zz+cxzcrseee 112 4.1.1 Bào chế liposome chưa mang được chất -2- +: 112 4.1.2 Giảm và đồng nhất kích thước liposome 2-2 +: 113 4.1.3 Đưa dược chất vào liposome -.2- 2+ s+xz+£sztxesrxerrseee 116 4.2 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin
422.1: Tỷ lệ CÁC HĐÍ-cssnssssniiisisesEEL1958515000335561683955856593155538551514384855E
Trang 8
4.3.3 Phương pháp đánh giá hình thái cấu trúc . - 125 4.3.4 Đánh giá giải phóng dược chất từ liposome - 126 4.3.5 Độ ổn định liposome .ccecsesssesseessesssessesssessseeseessecssessesesecseeeseesses 127 4.3.6 Về đánh giá tác dụng trên khối u ¿¿+z+z+z2cszze- 128 KẾT LUẬN . - 22: ©22-22S2ES222212221227112111211127112112111111 211.11 xe 132 HẾ XUẤT gunnggnnrndttinorneidiidiititgtiiT0810206100100053180050230001060160800000050831580030088đ 133
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNHĐÃCƠNG BĨ KET QUA NGHIEN
CỨU CỦAĐÈ TÀI LUẬN ÁN . -e-s<escssccsecsseessessersserssse 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 9DANH MUC CAC TU VIET TAT
TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ
1 ADN Acid Deoxyribonucleic 2 ARN Acid ribonucleic
3 BP Bristish Pharmacopoeia ( Dugc dién Anh) 4 CHF Congestive heart failure (Suy tim sung huyét )
5 CHL Cholesterol
6 CS Cong su
7 DC Dược chất
8 DCSH Đối chứng sinh học
9 DCUT Đối chứng ung thư
10 |DĐVN Dược điển Việt Nam
11 DOPE Dioleoylphosphatidyl ethanolamin 12 DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromid 13 DOX Doxorubicin hydroclorid 14 DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin 15 DPPE 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin 16 DPPS 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin 17 DSPA 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acid 18 DSPC Distearoyl phosphatidylcholin
19 DSPE Distearoyl phosphatidylethanolamin
20 DSPE-PEG | Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol 21 DSPG Distearoyl Phosphatidyl glycerol
22 EPC Egg-derived phosphatidylcholin 23 EPG Egg-derived phosphatidylglycerol
24 EurPh European Pharmacopoeia ( Duge dién Chau Au)
Trang 10
TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ
25 FDA Food and Drug Administration ( Cục Quản Lý Thực Phẩm và Dược Pham Hoa Kỳ)
26 HEPES N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid 27 HER2/neu | Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
(Thu thé cua yếu tố tăng trưởng thượng bi) 28 HPC Hydrogenated phosphatidylcholin
29 HPI Hydrogenated phosphatidylinositol
30 HPLC High-performance liquid chromatography (Sac kí lỏng hiệu năng cao)
31 |KHV Kính hiển vi
32_ |KTTP Kích thước tiểu phân
33 LUV Large unilamellar vesicle ( Liposome đơn lớp lớn) 34 LVEF Left ventricular ejection fraction (Thé tich tống máu that trai) 35 MLV Multilamellar vesicle (Liposome nhiều lớp đồng trục ) 36 MVV Multivesicular (Liposome kép ) 37 |ND Nông độ 38 | NST Nhiém sac thé 39 PC Phosphatidyl cholin 40 PDI polydispersity index (Chỉ số đa phân tán) 4I PEG Polyethylenglycol 42 PI Phosphatidy] inositol
43 PTFE Polytetrafluoroethylene Teflon
44 RSD Relative Standard deviation ( Độ lệch chuẩn tương đối) 45 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn )
Trang 11TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 46 SPC Soy phospatidyl cholin (Phosphatidyl cholin dâu đậu tương ) 47 SUV Small unilamellar vesicle (Liposome don lớp nhỏ) 48 TB Trung binh
49 |TBUT Tế bào ung thư
50 |TCCS Tiêu chuẩn cơ sở
51 TEM Transmission electron microscopy (Kinh hién vi điện tir truyén qua)
52 | TKHH Tinh khiết hóa học
53 Tf Nhiét chay hoan toan
54 Tm melting temperature (Nhiét chay long)
55 USP United State Pharmacopoeia (Dugc dién MF ) 56 H Cường độ Ion
Trang 12DANH MUC CAC BANG
Bang Tén bang Trang
1.1 | Một số phương pháp định lượng doxorubicin 4 1.2 | Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường 7 1.3 | Phan loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp 14 1.4 | Mốt số đặc tinh của phospholipid dùng bảo chế liposome 17 1.5 | Tổng hợp một số nghiên cứu về liposome tuần hoàn lâu trong |_ 29
máu và hướng đích
2.1 | Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu 38 3.1 | Mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở bước sóng | 58
482 nm có và không có tá dược
3.2 | Mối tương quan giữa mật độ quang ở các bước sóng và các | 59 pH khác nhau với nông độ doxorubicin
3.3 | Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng |_ 60 đo quang pho hap thu UV-VIS
3.4 | Méi tương quan gitra dién tich pic va nong d6 doxorubicin 61 3.5 | Độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng HPLC 62 3.6 | Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ky 62
3.7 | Kết quả khảo sát độ đúng 63
3.8 | Các công thức bào chế liposome doxorubicin 65 3.9 | Hàm lượng và hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome 66 3.10 | Tỷ lệ giải phóng dược chất từ các mẫu liposome DOX (pH| 1) 67
Trang 13Bảng Tên bảng Trang 3.11 | Tỷ lệ giải phóng dược chất của các mẫu liposome DOX (pH| 68 5,5)
3.12 | Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân của các mẫu 69 3.13 | Kết quả đánh giá kích thước tiêu phân của các mẫu sau 4 tuần |_ 72
bảo quản
3.14 | Hiệu suất liposome hóa của các mẫu sau 4 tuần và mới bào chê i 73
3.15 | Tỷ lệ giải phóng được chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần |_ 74 bảo quản tại pH 7.4
3.16 | Tỷ lệ giải phóng dược chat ( %) liposome DOX sau 4 tuan| 75 bao quan tai pH 5,5
3.17 | Phân bố kích thước hé liposome ở các điều kiện siêu âm khác | 78
nhau
3.18 | Phân bố kích thước hệ liposome khi siêu âm thể tích nhỏ (10|_ 79
ml)
3.19 | Cac qui trinh nén /day qua mang 82 3.20 | Sự phân bố KTTP phu thuéc vao qui trinh nén/dayqua mang 83
3.21 | Hiệu suất liposome héa cia doxorubicin t 6 50°C 85
3.22 | Hiéu suat liposome héa cia doxorubicin ủ trong 30 phút 87 3.23 | Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp thâm |_ 88
tích 3 lân đệm HEPES
3.24 | Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo số lần đổi đệm tiếp | 89 tuyên
Trang 14
Bảng Tên bảng Trang
3.25 | Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp đổi| 90
đệm băng lọc tiêp tuyên
3.26 | KTTP liposome trước và sau khi gắn doxorubicin 91 3.27 | Thời gian hòa tan DOX và hiệu xuất liposome hóa khi sử | 94
dụng dược chât đông khô
3.28 | So sánh các chỉ tiêu chất lượng giữa liposome dox bảo chế | 96 với chê phâm Lipodox
3.29 | Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm | 99
liposome doxorubicin ở điêu kiện dài hạn
3.30 | Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm | 101
liposome doxorubicin ở điêu kiện phòng thí nghiệm
3.31 | Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày 103 3.32 | Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày 104 3.33 | Khối lượng u dưới đa của chuột sau 30 ngày 105 3.34 | Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày 106 3.35 | Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày 107 3.36 | Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày 108 3.37 | Kích thước khối u UTTTL người ở các nhóm 110 4.1 | Các hệ đệm được sử dụng để bào chế hỗn dịch liposome| DOX 123
Trang 15DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang
1.1 | Sự phân hủy doxorubicm trong môi trường acid 5
1.2 | Cấu tạo vỏ liposome 13
1.3 | Các loại liposome 14
2.1 | Cơ chế đổi đệm của hệ lọc tiếp tuyến 43
2.2 | Cơ chế đôi đệm của phương pháp thẩm tích 43 2.3 | Mô tả quá trình thâm tích đề tách doxorubicin tự do trong 49
mau liposome
3.1 | Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang ở các |_ 59 bước sóng và các pH khác nhau với nông độ doxorubicin
3.2 | Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin 61 3.3 |Đồ thị biểu diễn các chỉ số PDI và Z-average hệ liposome của |_ 70
các mầu
3.4 | Hình ảnh chụp TEM cua liposome doxorubicin bao chế theo 71 công thức A3.2
3.5 | Đồ thị so sánh các chỉ số PDI và Z-average của các mau| 73 liposome sau 4 tuân và mới bào chê
3.6 | Hình ảnh chụp bề mặt soi âm bản của mẫu liposome sau siêu | 81 âm
3.7 | Hình ảnh chụp cắt ngang của mẫu liposome sau siêu âm 82 3.8 | Hình ảnh chụp TEM của liposome khi sử dụng các phương | 84
pháp giảm KT'TP khác nhau
Trang 16Hình Tên hình Trang 3.10 | Sơ đỗ tóm tắt các giai đoạn của qui trình bào chế thuốc tiêm | 95 liposome doxorubicin
3.11 | Tỷ lệ chuột mang khối u dưới da sống sót sau 30 ngày 103 3.12 | Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày 104 3.13 | Khối lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày 105 3.14 | Thẻ tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày 106 3.15 | Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày 107 3.16 | Thẻ tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày 108
3.17 | Diễn biến kích thước khối u trên chuột 110
3.18 | Trọng lượng chuột ở các nhóm điều trị 111
4.1 | Cơ chế tăng thấm thuốc từ tuần hoàn vào vùng u 114 4.2 | Co ché dua doxorubicin hydroclorid vao trong liposome bang | 117 pH-gradient
Trang 17DAT VAN DE
Từ những năm 50 của thế kỷ XX, doxorubicin (DOX) đã được phát hiện, phan lap tir chung vi khudn Streptomyces peucetius var caesius va duge tng dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh ung thư Hiện nay, doxorubicin có thể được bán tông hợp từ daunorubicin và được sử dụng khá phô biến Tuy nhiên, cũng giống như các thuốc điều trị ung thư thuộc nhóm kháng chuyển hóa khác, doxorubicin có rất nhiều tác dụng không mong muốn, đặc biệt là độc tính gây suy tủy, làm thiếu bạch cầu, giảm tiểu cầu, làm rối loạn nhịp tim và có thê dẫn đến tử vong Do đó, hiện nay, thuốc tác dụng tại đích đề điều trị
bệnh ung thư là sự lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại
các khối u và giảm độc tính ở các tế bào lành
Một trong những hệ đưa thuốc tại đích đang được chú trọng phát triển trong bào chế hiện đại là dang thuốc liposome Day là dạng thuốc có nhiều ưu điểm trong quá trình vận chuyền, phân bó, kiểm soát giải phóng và tăng sinh khả dụng của dạng thuốc Ưu điểm đặc biệt của liposome sử dụng trong điều trị ung thư là các phân tử thuốc sẽ đi nhiều vào khối u, giải phóng thuốc và hạn chế thuốc đến các mô lành Nhờ sự phát triển của công nghệ nano, trên thế giới đã có một vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin và được ứng dụng trong lâm sàng như các biệt dược: DoxIl, Caelyx, LipoDox, [41] với nhiều cải tiến về mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính
Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất Hiện nay, dạng bào chế liposome đang được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai Vì vậy
nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết nhằm phát triển một thế
Trang 18Với lý do trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiễn hành với 2 mục tiêu:
1 Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá được độ ổn định
của chế phẩm
2 Đánh giá được tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trén khối u chuột thực nghiệm
Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu Sau:
1 Nghiên cứu xây dựng công thức và qui trình bào chế liposome doxorubicin bằng phương pháp hydrat hóa film
2 Đánh giá được các đặc tính của liposome doxorubicin để tiêu chuẩn hóa liposome doxorubicin và thuốc tiêm liposome doxorubicin
Trang 19Chương 1 TONG QUAN
1.1 Dai cwong vé doxorubicin Công thức cầu tạo: O OH - Công thức phân tử: C;H›NO¡¡HCI- Khối lượng phân tử: 579,99
Tên khoa hoc: (8S,10S)-10-{(3-Amino-2,3,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexo pyranosyl) oxy}-7,8,9, 10-tetrahydro-6,8, | 1-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl) -
1-methoxy-5,12-naphthacen-dion[133] 1.1.1 Dac diém hoa lý
Trang 20Bảng 1.1 Một số phương pháp định lượng doxorubicin
Phương pháp Áp dụng Tài liệu
định lượng tham khảo
Đo quang ở bước sóng | Đánh giá giải phóng dược chất từ | [15],[79],[133]
234, 282, 285 các hệ mang thuốc
HPLC, detector tử Định lượng dược chât trong một sô | [14],[22], [131]
ngoại dạng bào chế: thuốc tiêm dung dịch,
bột đông khô, liposome HPLC, detector huỳnh | Định lượng dược chất tại khôi u, tại | [16].[144] quang các tô chức 1.1.2 Độ 6n định Ảnh hưởng của pH:
Doxorubicin có khả năng biến đổi thành các dẫn chất: doxorubicinon; 9- carboxydoxorubicin; 7,8 ,10,9 ,dehydrodoxorubicinon; 7,8- dehydro-desacetyl - đaunorubicinon đo các tác nhân: acid mạnh, ion kim loại, kiềm
Ở pH 9,0 và 10,0 DOX bị phân hủy nhanh chóng Sự phân hủy có thê quan sát trực tiếp bằng mắt thường thông qua sự thay đổi màu sắc dung dịch từ màu đỏ đến màu xanh-tím và cuối cùng là phân hủy hoàn toàn [34] Công thức của doxorubicin có nhóm NH; có khả năng bị proton hóa và 2 nhóm OH có khả năng tách proton Do đó trong dung dịch, doxorubicin có thê tồn tại ở các dạng: phân tử trung hòa, Ion lưỡng cực, anion và cation
So sánh với các glycoside khác, ví dụ ginsenosid, trong công thức thiếu
một nhóm chức amin so với doxorubicin, cho thay rang doxorubicin 6n dinh hơn trong dung dịch acid Dược chất tương đối ồn định trong môi trường pH
< 4 Doxorubicin hydrochlorid bền trong dung dịch có pH gần 4,0 Trong
Trang 219 ọ 0H I q 0H I ủ C—CHOH ye C—CH,0H SXXXðX«- OU HO 0 0H ¡ HƠO Ô ỦH Ôn doxorubicinone o » + Wen, Hi HH, H "i ici 0H ; doxorubicin H daunosamine AH,
Hình 1.1 Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid
*Nguon: Theo Dominique M.M (1986)[34]
Các chế phẩm dung dịch đậm đặc dé pha dung dịch tiêm truyền trên thi trường đều có pH 3,0-4,0; sử dụng acid hydrocloric để điều chỉnh pH
Ảnh hưởng của nông độ ion:
Sự ảnh hưởng của nồng độ ion tới tốc độ phân hủy DOX đã được nghiên cứu Dung dịch dược chất được điều chỉnh ở pH không đổi (1,25) và thay đôi nồng độ ion bằng cách thêm natri clorid Độ ổn định của dược chất tỷ lệ căn bậc hai của cường độ ion (0) trong khang 0,14 <(u)'”<0,75 Tại (u)'”> 0,75 tốc độ phản ứng phân hủy dược chất tăng cùng với tỷ lệ trao đổi ion doxorubicin va proton H*[21],[23]
Anh huong cua nhiét do:
Doxorubicin không bền dưới tác động của nhiệt độ Chế phẩm thông thường được bảo quản tại nhiệt độ 4°C Các nghiên cứu đánh giá sự ổn định của DOX trong huyết tương cũng cho thấy tại nhiệt độ 39°C, DOX nhanh chóng bị phân hủy thành các hợp chất không phân cực (DOX-ONE và DOX- OL); quá trình diễn ra chậm hơn tại nhiệt độ 23°C và tương đối ổn định tại
4°C [34]
Bao quan:
Trang 22phẩm như dung dịch, hỗn dịch liposome được bảo quản tránh ánh sáng, dé ở nhiệt độ khoảng từ 2- 8°C, bột đông khô pha dung dịch tiêm bảo quản không quá 30°C, tránh ánh sáng [3], [133]
1.1.3 Cơ chế tác dụng
Cơ chế tác dụng chính xác của doxorubicin còn chưa được biết rõ hoàn toàn, tuy nhiên người ta cho rằng nó có khả năng chen vào giữa các cặp ADN, do đó làm ngăn cản quá trình tổng hợp ADN và loại ARN phụ thuộc ADN
làm rối loạn và phá vỡ cấu trúc Viêc chen vào giữa chuỗi có thê làm đứt
mạch đơn hoặc mạch đôi cũng như làm thay đổi chromatid chị em Sự chia cắt của ADN bằng thuốc qua tác dụng của topoisomerase II hoặc bởi sự phát sinh ion xúc tác của các gốc tự do, cả hydrogen peroxyd và hydroxyl, là những tác nhân phá hủy tế bào Doxorubicin cũng gây ra sự tạo phức topoisomerase- ADN cùng hóa trị do đó ngăn cản phần hàn kín mạch của phản ứng cắt hở- hàn kín mạch trong quá trình sao chép ADN Mặc dù tác dụng của nó qua chu trình tế bào, nhưng độc tính cao nhất xảy ra trong pha tổng hợp ADN (pha S) Với nồng độ dược chất thấp, các tế bào qua được pha
S nhưng sẽ chết ở pha G›[17], [44], [45] [62], [112]
1.1.4 Các dạng bào chế của doxorubicin
về mat bao ché, có thể chia thành 2 dạng thuốc chứa doxorubicin để pha dung dịch tiêm truyền trên thị trường Một là dạng chứa doxorubicin hydroclorid tự do, hai là hỗn dịch liposome Với dạng chứa dược chất tự do,
phô biến là dạng dung dịch đậm đặc để pha dung dịch tiêm truyền, thường với hàm lượng 2 mg/ml, đóng lọ với thể tích khác nhau Một số nhà sản xuất lại bào chế bột đông khô để pha dung dịch tiêm truyền nhằm tăng tuổi thọ cho chế phẩm
Trang 23Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường
Phân loại | Dạng bào chế | Biệt dược Hàm lượng Nước sản xuất Adorucin 10mg/5ml Korea United
50mg/25ml Pharma (Hàn Quốc)
Dung dich dam 10me¢/S5ml
ÿ : 8 Z
đặc để pha Adriamycin 50mg/25ml Pfizer (Uc) uyên “ Adriblastina | 10mg, 50mg Pharmacia (Italia)
mac = : Adrim 50mg/25ml Dabur (An D6)
X Doxorubicin | 10mg/5ml, Ebewe Pharma
Dang bao chế chứa Eb ewe 50mg/25ml me Ph ( ° Á -
DOX tw do Doxorubicin | 10mg, 50mg amacnenme (Ha Lan)
c2 | Doxorubicin | 10mg/Sml David Bull Lab
` m ayne Pharm (Úc
Boi dong tho DBL |50mg/25ml | Mayne Pharmm (Úc)
P ha dj ch truyền Doxorubicin I0me 50m Laboratorios IMA
tinh mach Servycal Es 8 (Achentina)
Bioprofarma
Doxt ox’ 1 Omg, 50 mg (Achentina)
Zodox 10mg, 50mg Intas (Ấn Độ)
Lọ bột đô
li of ons Cephalon (Anh, Tay
khô pha hôn
dịch tiê Myocet 50m Ban Nha): EE ¥ 5 Sopherion (M¥) liposome qui ước 20mg/10ml Schering Plough Caelyx -
Lapakorie Hén dich tiém ee (My)
chứa Doxil 5 ie /30ml Sequus pharm.(Mỹ)
PEGylated ms
liposome Biopharm
doxorubicin THEGHBE 20mg/10ml (Đài Loan)
Hồn dịch : 15ml Celsion
liposome nhay | ThermoDox 30mg/15m Corporation,
cam voi nhiét Lawrenceville, NJ
Trang 241.1.5 Dược động học
Doxorubicin hydroclorid không ôn định trong dạ dày và các nghiên cứu trên động vật cho thấy thuốc hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa Ngoài ra, thuốc rất khó được phân bồ tới các mô qua đường uống, do đó thuốc được bào
chế dạng tiêm truyền tĩnh mạch Doxorubicin được chuyên hóa bởi enzym
aldoketoreductasesẨ-NADPH thành chất chuyển hóa ưa nước doxorubicinol 13-hydroxyl có tác dụng chống ung thư và là chất chuyên hóa chính Những reductases có mặt trong hầu hết các tế bào, đặc biệt là trong hồng cầu, gan và thận Chất chuyển hóa khác không có tác dụng điều trị bao gồm các aglycon ít tan trong nước, như doxorubicInon (adriamycinon) và 7-deoxy-doxorubicinon (17-deoxy-adriamycinon) Các enzyme reductase chuyển doxorubicin thành 7-deoxyaglycon làm tăng tác dụng gây độc tế bào của thuốc vì nó tạo ra các gốc hydroxyl gây tồn thương tế bào [133]
Do sự khác biệt về mặt bào chế, các chế phẩm chứa doxorubicin khác nhau khi sử dụng cho các thông số dược động học khác nhau [141]
Với dung dịch truyền tĩnh mạch, đồ thị nồng độ trong huyết tương không xuất hiện ở 3 pha tương ứng với thời gian bán thải là 12 phút; 3,3 giờ và 33 giờ Thời gian bán thải tương đối dài của doxorubicin phản ánh việc phân bố vào các mô của dược chất Chỉ khoảng 33-50% dạng chuyền hóa tìm thấy trong nước tiêu, mật và phân sau 5 ngày truyền tĩnh mạch Phần còn lại của dược chất và các sản phẩm chuyển hóa vẫn còn nằm lại trong các mô tại các tổ chức của cơ thể Với bệnh nhân ung thư, doxorubicin làm giảm adriamycinol, một chất có độc tính Quá trình này được xúc tác bởi enzym aldoketoreductases-NADPH, được tìm thấy trong tất cả các mô và đóng vai trò quan trọng để xác định dược động học của doxorubicin [28] Thể tích phân
Trang 25Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự do Sự phân bố của dạng liposome bị giới hạn bởi lòng mạch, liên kết protein không đáng kể, thời gian phân bố dược chất tới các mô là 5 phút cho thấy sự hấp thu nhanh chóng của doxorubicin Trong khi thời gian bán thải của thuốc gắn với liposome thường là dài (ví dụ Doxil có tịạ= 20-48 giò) Khác với dạng dung dịch, liposome chuyên hóa theo hai giai đoạn: giai đoạn đầu tương đối ngắn (5 giờ) và giai đoạn thứ hai kéo dài (55 h)[134]
Gabizon và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu với chế phẩm Caelyx cho thấy thời gian bán thải khoảng 50-55 giờ với liều lượng từ 10-20 mg/m” trong điều tri các bệnh nhân sarcoma Kaposi liên quan đến AIDS, 60-80 giờ với mức liều 35-70 mg/m” ở bệnh nhân mang khối u rắn; 36 giờ với liều 40- 70mg/ni trên các bệnh nhân khoa nhi
Độ thanh thải huyết thanh của Doxil 0,041 1⁄h/m2 với liều 20 mg/m” Do thanh thải chậm, nên sinh khả dụng của Doxil gấp 2-3 lần so với doxorubicin tự do [105]
Các chế phẩm liposome gan PEG va khéng gan PEG cũng có sự khác biệt Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn Dạng liposome doxorubicin khéng PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh trong huyết tương của tổng lượng doxorubicin sử dụng cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng tự do [134]
1.1.6 Chỉ định
Doxorubicin có khả năng tiêu diệt nhiều loại tế bào ung thư và thường được sử dụng cùng các hóa trị liệu khác đề điều tri: u lympho dang Hodgkin va khong Hodgkin, sarcoma xương và mô mềm, bạch cầu cấp, u nguyên bào thần kinh, ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư buông trứng [3].[46]
Trang 2610
máu ác tính, và thường được sử dụng trong điều trị các khối u sau đây: ung thư vú, ung thư phổi, ung thưbiểu mô buồng trứng, ung thư bàng quang, u nguyên bào thần kinh, khối u Wilm, u liên kết mô mềm, u xương ác tính, bệnh bạch cầu cấp tính Iymphocytic — lymphoblastic, bệnh bạch cầu nguyên bào tuỷ cấp tinh, ung thu khéng Hodgkin, bénh Hodgkin (lién quan mach bach huyét)
Doxorubicin cũng đã thê hiện hoạt tính chống ung thư, các khối u ác tính ở người lớn và nhi khoa sau đây: ung thư biểu mô tuyến giáp, ung thư biểu mô nội mạc tử cung, ung thư đầu và cổ, ung thư dạ dày, ung thư biểu mô tế bào gan chính, ung thư tỉnh hoàn, ung thư biểu mô tuyến tiền liệt, Ewing sarcoma, Rhabdomyosarcoma, đa u tủy, ung thư bạch cầu mạn tính
Trong khi đó dạng bào chế thuốc gắn trong PEGylated liposome (Doxil, Caelyx) có những chỉ định hẹp hơn, cụ thể hơn như:
*Diéu tri ung thư vú và buồng trứng, nó được sử dụng đề giếtcác tế bào ung thư, thu nhỏ kích thước và trì hoãn sự tăng trưởng của khối u
*Sử dụng trong kết hợp với thuốc khác là bortezomib để điều trị nhiều u tủy, là một ung thư huyết tương tế bào Tế bào huyết tương được sản xuất trong tủy xương và là một thành phần của hệ thống miễn dịch
*Sử dụng để điều trị bướu thịt Kaposi, một dạng khác của ung thư, cải thiện làm phẳng, làm sáng và co rút bướu thịt Kaposi của bệnh ung thư [105],
[134]
Đối với dạng bào chế liposome chứa doxorubicin hydroclorid nhung không gắn PEG đại diện là Myocet chỉ định chính được đưa ra trong điều trị ung thư vú nhằm mục đích giảm chi phí cho người bệnh tuy nhiên vẫn đảm bảo tập trung dược chất
1.1.7 Độc tính
Trang 2711
suy tìm sung huyết (CHF) đe dọa tính mạng người bệnh Ngoài ra các độc tính trên da, hệ tiêu hóa, thần kinh, cũng đã được ghi nhận [3],[32],[1341 Một trong các mục đích của bào chế liposome doxorubicin là để giảm độc tính do khả năng hướng đích
1.1.8 Liều lượng
*Liéu dùng: được tính trên cơ sở diện tích da
+ Các chế phẩm dung dịch tiêm và bột pha tiém doxorubicin hydroclorid: Điều trị các khối u rắn: Khi một tác nhân duy nhất được sử dụng là doxorubicin, liều được đề nghị là 60-75mg/m” cho mỗi chu kỳ ba tuần Nếu doxorubicin được sử dụng kết hợp với các tác nhân chống ung thư khác có khả năng chồng chéo độc tính, liều khuyến cáo cho mỗi chu kỳ là 30- 60mg/m’
Điều trị ung thư bạch cầu cấp tính: liều khuyến cáo của doxorubicin là 2,4 mg/kg trọng lượng cơ thé (tương ứng 75-90 mg/m”), được dùng trong ba ngày liên tiếp (một chu kỳ) Thời gian và liều của chu kỳ thứ hai được quyết định dựa vào tình trạng tủy xương và các tế bào máu ngoại vi, thời gian giữa chu kỳ ít nhất là 10 ngày [3]
Doxorubicin có thể nhỏ trực tiếp vào bảng quang trong điều trị ung thư ác tính Nhỏ 50ml dung dịch doxorubicin Img/ml trong 1h cách nhau 1 tuần hoặc 1 thang [3]
+Các chế phẩm liposome:
Sau khi được gắn vào liposome, doxorubicin được lưu giữ lâu hơn trong tế bao ung thư, do đó liều lượng của dạng bào chế này ít hơn và khoảng cách xa hơn so với dùng dạng dược chất tự đo
- Ung thu budng trimg: 50 mg/m’ trong 4 tuần điều trị, dùng tối thiểu 4 đợt - AIDS liên quan đến Kaposi bướu thịt: 20 mg/m” trong 3 tuần điều trị
Trang 2812
Dạng liposome không PEG hóa được sử dụng trong ung thư vú di căn với liều tương tự như dang doxorubicin tự do[133]
*Cách sử dụng:
Với dung dịch tiêm cũng như bột pha dung dịch tiêm doxorubicin:
Dung dịch doxorubicin được cho từ từ vào ống truyền tĩnh mạch có sẵn dung dịch tiêm truyền natri clorua, hoặc dextrose 5% tiêm [3]
Voi hon dich tiém liposome doxorubicin:
Việc pha loãng hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin phụ thuộc vào công thức bào chế Với liposome không gắn PEG (ví dụ như Myocet) quá trình hydrat hóa dùng đệm citrat, do đó nhà sản xuất thường khuyên pha loãng với dung dịch natri clorid đẳng trương Đối với liposome gắn PEG như Lipodox, Caclyx, quá trình đưa dược chất vào liposome sử dụng chênh lệch đệm amoni, mơi trường bên ngồi liposome được đẳng trương bằng sucrose do đó nên pha loãng với dung dich glucose 5% [72], [118]
1.2 Dai cwong vé liposome doxorubcin
1.2.1 Khai niém
Liposome thuộc hệ đưa thuốc tới đích, là dạng phát triển ở mức cao hơn thuốc tác dụng kéo dài Nó là một dạng đặc biệt của microcapsule và nanocapsule, cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích thước thay đổi từ
hàng chục đến hàng nghìn nanomet [1], [2], [9]
Đặc tính của mang phospholipid cua liposome 1a mang kép lipid gém hai lớp Trong quá trình hình thành liposome, các phân tử lipid hòa tan bao gồm một đầu ưa nước và một đuôi ky nước, các lưỡng phân tử lipid tự kết tụ, sắp xếp liền nhau thành phiến mỏng khi độ hòa tan của chúng giảm dần ở môi trường nước
Trang 2913
Kích thước tiểu phân của liposome tùy từng loại mà có kích thước khác nhau Loại một lớp nhỏ kích thước từ 20-50 nm Loại to từ 200-1000 nm
Loại nhiều lớp từ 400-3500 nm [1], [2].[47].[74I TITTTTTTTTtTfmrrrrTrtmT trong môt ' trường nước phospholipid «ĩ Liposome
Hình 1.2 Cấu tạo vỏ liposome 1.2.2 Phân loại liposome
Phân loại về mặt cấu trúc:
Tùy theo phương pháp bào chế và quy trình làm giảm kích thước tiểu phân (KTTP), các liposome có kích thước, số lớp vỏ khác nhau Qua đó, có thể phân thành các loại liposome như trong bảng 1.3[1]
Phân loại theo cau tao lop vo cua liposome: / ; Theo thành phân phospholipid cũng như theo sự thay đôi trên bê mặt phospholipid ta có thể phân chia thành: liposome quy ước, liposome nhạy cảm pH hoặc nhiệt độ, liposome tích điện dương bề mặt, liposome gắn các yếu tố 6n định, liposome gắn kháng thể (Hình 1.3)
Tuy nhiên cách phân chia này chỉ là tương đối dựa trên từng nghiên cứu
Trang 3014 Bảng 1.3 Phân loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp Loai liposome Đường | Số lớp | Đối xứng Hình ảnh theo cầu trúc kính vo
Cac liposome da lop 0,4 -3,5 Be as
(Multilamellar - MLV) oem | | số | THAI XEHg
Các liposome đa túi 4-10 - Không đối (Multivesicular - MVV) um xứng Các liposome đơn lớp lớn | 0,2-— I
(Large unilamellar - LUV) um I Đôi xứng
Cac liposome đơn lớp nhỏ | 0,02- ko
(Small unilamellar - SUV) | 0,1 um Ị Đơi xứng ©
*Nguon theo Jesorka A (2008) [74]
ol?
— S*
Hinh 1.3 Cac loai liposome
*Nguon theo Torchilin V P (2005)[138]
Trang 3115
1.2.3 Ưu, nhược điểm của liposome
*Ưu điểm:
- Dạng thuốc liposome có thê vận chuyền được nhiều dược chất tan trong nước cũng như các dược chất tan trong dầu
- Liposome có thể thay đổi hoàn hoàn các đặc điểm dược động học của hoạt chất, cải thiện sinh khả dụng của dược chất hơn hắn so với việc dùng thuốc dạng tự do phải qua các quá trình dược động học thông thường
- Cau trúc màng phospholipid cua liposome tuong tự cau tric mang sinh học của cơ thể sống, do vậy liposome sẽ là chế phẩm y học có tính an toàn
Cao
- Liposome có tác dụng bảo vệ và giải phóng một cách có kiểm soát các dược chất
- Trong điều trị ung thư, liposome đưa thuốc tới đích là tế bào ung thư, hạn chế thuốc tới tế bào lành Ưu điểm đáng kể của liposome trong điều trị
ung thư là các tiểu phân liposome mang dược chất có đường kính nhỏ hơn các
lỗ rò ở các mạch máu nuôi khối u nên sẽ vượt qua được những khe hở này đi vào khối u, giải phóng thuốc Còn kích thước các khe hở ở những mạch máu của các mô bình thường có đường kính nhỏ hơn, không cho các tiểu phân
liposome đi qua, vì vậy giảm thuốc đến các mô lành và gây độc Trong công
nghệ mới người ta bào chế các liposome có gắn trên bề mặt các ligand (phối tử hay khớp nối) ví dụ kháng thể bề mặt, folat, vv , các khớp nối này sẽ hướng liposome tập trung nhiều ở mô ung thư giải phóng được chất Với vai trò là một chất mang, liposome phát huy tốt khả năng chứa và vận chuyên những vật chất như gen, hemoglobin, vv mà dạng thuốc khác không làm được hoặc không hiệu quả bằng [9], [20], [138]
*Nhuoc diém:
Trang 3216
định Mặt khác nguyên liệu để làm lớp vỏ liposome là các lipid rất dé bị ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, vi sinh của môi trường
- Tính đồng nhất giữa các lô mẻ sản xuất không cao Các thông số bào chế, điều kiện bào chế ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành liposome
- Cần nhiều thiết bị chuyên dụng và đồng bộ để bào chế và kiểm soát trong quá trình bào chế làm cho việc nghiên cứu và đặc biệt là triển khai ở quy mô lớn gặp nhiều khó khăn
- Nguyên liệu tinh khiết, đắt tiền nên giá thành chế phẩm cao [1], [138] 1.2.4 Nguyén liéu bao ché liposome
Phospholipid là thành phần chính của liposome, do có cấu tạo gồm một đầu thân dầu và một đầu thân nước nên nó có khả năng tự kết hợp để tạo thành lớp màng kép trong môi trường nước với những hình dạng khác nhau tùy thuộc nồng độ lipid Cac phospholipid ding dé bao ché liposome rat da
dang, co thể xuất tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên (đậu nành, lòng đỏ trứng) hoặc tổng hợp Các phospholipid có thể kế tên các nhóm chính sau: - Phosphatidylcholin (PC) - Acid phosphatydic (PA) - Phosphatidylethanolamin (PE-cephalin) - Phosphatidylglycerol (PG) - Phosphatidylserine (PS) - Phosphatidylinositol (PI) - Cardiolipin - Ether lipid - Plasmalogen
Trang 3317
tính Các đặc tính này ảnh hưởng trực tiếp đến các thông số trong quá trình bào chế liposome, độ ôn định và tác dụng sinh học của liposome [63], [147]
Bảng 1.4 Một số đặc tính của phospholipid dùng bào chế liposome Loại lipid
ee (số mạch Nhiệt độ chuyển | Dién tích
carbon: sô dang (°C) (pH 7,4)
dây nối đôi) PC đậu tương 18:2 - 0 DLPC 12:0 -1 0 DSPC 18:0 a5 0 DMPE 14:0 50 0 DPPA.Na 16:0 67 -1,3 DMPA.Na 14:0 50 -1,3 DOPE-Glutaryl.(Na); 18:1 -10 -2 DPPE-mPEG-2000.Na 16:0 N/A -1
*Nguon Volkmar Weissig(2010)[147]
Cholesterol và dẫn chất được thêm vào phospholipid trong bào chế
liposome, thường phối hợp ở tỷ lệ phù hợp trong thành phần của màng
liposome Cholesterol có tác dụng làm giảm độ cứng và tính thấm của vỏ liposome Tỷ lệ giữa các phospholipid và cholesterol là rất quan trọng, quyết định đặc điểm của màng, sự ồn định của màng Trong cấu trúc màng kép của liposome, phospholipid và cholesterol tương tác liên kết nhau qua các cầu nối acyl [99]
Trong quá trình bào chế lớp vỏ liposome, người ta còn dùng các chất khác:
Trang 3418
chất thân nước vào liposome Chất làm cho liposome tích điện âm như acid phosphatidic, dicetyl phosphat ; chat tich điện dương như stearylamin
- Các ligand (Phối tử - nhóm hướng đích) cũng được đưa vào lớp vỏ lipid trong quá trình bảo chế để đạt được mục đích mong muốn Ví dụ: folat, kháng thể, để hướng đích Các chất này thường được gắn vào bề mặt liposome sau khi bào chế liposome, cũng có trường hợp chúng được gắn trực tiếp vào lipid trước khi bao ché liposome
- Chất cảm biến pH, cảm biến từ tính, [1], [15], [29],[33],[1 141
Ở phương pháp đông khô còn dùng thêm các tá dược tạo khung cho quá trình đông khô, hay sử dụng các loại duong nhu sucrose, mannitol, lactose
[24],[139],[114],[135]
1.2.5 Phương pháp bào chế liposome
Hiện nay có rất nhiều phương pháp bào chế liposome, một trong các phương pháp hay được dùng nhất, ứng dụng hiệu quả nhất và dé bé sung, cai tiễn là phương pháp Bangham hay còn gọi là phương pháp hydrat hóa màng mỏng lipid
Nguyên tắc của phương pháp: Hoà tan phospholipid và các thành phần cấu tạo vỏ liposome vào dung môi hữu cơ (cloroform, methanol, ), bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay, phospholipid sẽ tạo thành màng film mỏng bám lên thành bình cất Nhiệt độ tiến hành xấp xỉ nhiệt độ chuyên pha của lipid Có thể sục khí nitrogen để bay hơi hoàn toàn dung môi hữu cơ Trên quy mô lớn người ta tiến hành tạo film mỏng bằng phương pháp phun sấy Hydrat màng film đã tráng: thêm dung dịch nước có hệ đệm (như đệm phosphat, đệm citrat, ), vừa cho vừa lắc để phospholipid hydrat hoá tạo thành liposome [9], [98]
Hạn chế của phương pháp hydrat hóa film là các liposome tạo thành có kích thước lớn không đồng nhất và lớp vỏ có thể có nhiều lớp
Trang 3519
-Lọc ép bậc thang nhiều lần qua màng lọc (hay dùng màng poly-
carbonat) có kích thước xác định nhỏ dần, mỗi cỡ lỗ lọc khoảng 10 lần Các
liposome tạo ra với kích thước nhỏ hơn, phân bố kích thước đều hơn [60],
[741.193]
- Có thể siêu âm ở tần số phù hợp dé cho các liposome phân tán đều, các
liposome to vỡ ra tái tạo các liposome nhỏ hơn hoặc sắc ký tách đoạn liposome (hay dùng sắc ký cột lọc gel) [116]
- Kết hợp công đoạn đông lạnh- rã đông tuần hoàn: liposome sau khi bảo chế đem đông lạnh ở nhiệt độ rất thấp sau đó rã đông ở nhiệt độ cao trên nhiệt độ chảy của lipid, làm tuần hoàn như vậy khoảng 5-10 vòng Trong các thao tác này, các liposome cỡ lớn, nhiều lớp bị vỡ ra và tái tạo các liposome cỡ nhỏ, vỏ lipid ít lớp hơn từ các mảng lipid kép Liposome thu được có kích thước nhỏ và phân bố kích thước đều hơn [47], [98]
Dược chất có thể được đưa vào trong liposome theo hai cách:
- Với cách thứ nhất: Phối hợp ngay trong quá trình bào chế hình thành
liposome Dược chất thân nước thì hoà vào dung dịch nước, dược chất thân dầu hoà vào dung dịch phospholipid trong dung môi hữu cơ Trong quá trình bào chế bản thân dược chất đã được đưa vào bên trong liposome
- Với cách thứ hai: Dược chất có thể được đưa vào liposome bằng cách: sau khi chế tạo xong liposome chưa chứa dược chất, pha dược chất trong dung dịch, phối hợp liposome rồi ủ với điều kiện nhiệt độ, thời gian nhất định để được chất đi qua màng gắn vào bên trong liposome theo các cơ chế khác nhau
Trang 3620
Trong thực tế người ta có thể kết hợp cả hai cách thức trên để đưa được chất vào trong liposome nhằm rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất của quá trình này
Trong quá trình đưa dược chất vào trong liposome, dé tang hiệu suất đưa dược chất gắn vào trong liposome có thể dùng các phương pháp:
- Dựa vào chênh lệch pH: dạng tồn tại của dược chất phụ thuộc nhiều vào pH, sau khi hydrat hóa xong, người ta thay đồi pH môi trường bên ngoài tạo ra sự chênh lệch pH, khi dược chất vào bên trong do pH môi trường thay đôi dạng tồn tại của được chất có thể thay đổi ví dụ: ít tan hơn, tạo phức, tạo gel, quá trình này tạo điều kiện cho dược chất được kéo vào bên trong liposome nhiều hơn Hoặc pH mơi trường bên ngồi liposome thay đổi làm dược chất thay đổi dạng dễ tiếp cận lớp vỏ lipid dé vao bén trong liposome
nhiều hơn [91]
- Dựa vào chênh lệch áp suất thẩm thấu hoặc chênh lệch nồng do ion: sau khi hydrat hóa người ta tạo ra su thay déi néng d6 ion hay ap suat tham thấu ở mơi trường bên ngồi liposome làm cho dược chất vào bên trong liposome nhiều hơn Cơ chế chủ yếu là sự trao đổi ion của các phân tử [91],
[98]
- Dựa vào sự thay đối môi trường chứa dược chất ở bên trong liposome khác với bên ngoài làm thay đổi dạng tồn tại của dược chất dẫn đến tăng quá trình được chất đi vào bên trong liposome
Trang 3721
sulfat (SO¿”) tạo thành phân tử dạng gel gần như kết tủa Kết quả là doxorubicin đi qua lớp màng nhiều hơn vào bên trong do thay đổi quá trình cân bằng doxorubicin giữa bên trong và bên ngoài màng [26]
Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác để bào chế liposome như: - Phuong pháp Batzri và Korn (phương pháp hòa tan ethanol) [98] - Phuong phap Deamer va Bangham [38], [98]
- _ Phương pháp bốc hơi pha đảo [74] - _ Phương pháp pha loãng polyol [100]
- Phuong phap hoa tan và thâm tách chất diện hoat [100] - Phuong pháp đông khô [24], [8Š]
- _ Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn [56] - _ Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới han [126]
1.2.6 Danh gia liposome *Hinh thai liposome:
Các thông số về hình thái bên ngoài và cấu trúc của liposome nhu hình dáng, đặc điểm bề mặt, cấu trúc lớp vỏ lipid vv ảnh hưởng nhiều đến đặc tính và tác dụng của hệ liposome
Các thông số hình thái bên ngoài được đánh giá bằng cách quan sát, chụp bởi kính hiển vi điện tử quét (SEM) có khả năng phóng đại đến 300.000 lần và chụp được các tiêu phân liposome tới kích thước trên 10 nm Qua đánh giá này thu được hình ảnh bề mặt cua liposome [3],[74]
Trang 3822
Ngoài ra hiện nay người ta còn dùng một số phương pháp đánh giá như chụp bằng kính hiển vi cộng hưởng từ hạt nhân (ARS) cho hình ảnh 3 chiều của tiêu phân, hiển vi nhiệt quét (STM), hiển vi lực nguyên tử
*Kích thước tiểu phân của liposome và phân bố kích thước tiểu phân:
KTTP của liposome liên quan nhiều đến hiệu quả đưa thuốc đến đích
(mô bệnh) của liposome và hiệu quả lâm sàng, thời gian bán thải của thuốc KTTP càng nhỏ, gần 100nm sé dem lại hiệu quả điều tri cao hon [74], [110] Các tiểu phân liposome được bào chế ra có các kích thước dao động trong một khoảng xác định Khoảng dao động này càng hẹp, kích thước các tiêu phân liposome càng đều đặn thì độ ôn định cua liposome cang cao [153] Do vậy trong bào chế liposome mang dược chất, ngoài việc làm nhỏ các tiểu phân, nhà bào chế còn phải dùng các kỹ thuật đề làm đồng đều hóa các tiểu phan liposome [20], [105]
Để xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân có thé đo trực tiếp bằng các phương pháp chụp hình ánh trên hoặc các phương pháp đánh giá như phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động hay dùng các thiết bị laser Kết quả thu được là kích thước của các tiểu phân trong hệ phân bố ở các khoảng nào với tỷ lệ bao nhiêu Liên quan đến sự phân bồ kích thước tiêu phân của hệ liposome 1a chỉ số đa phân tán PDI (polydiversity index) Chỉ số này càng nhỏ phản ánh kích thước các tiểu phân trong hệ liposome càng đồng đều PDI của hệ liposome dưới 0,25 được coi là phân bố hẹp, PDI trên 0,5 là phân bồ rộng[79]
Trang 3923
cộng trong cả hệ và lượng dược chất chỉ gắn với liposome sẽ cho biết tỷ lệ dược chất gắn vào liposome trong hệ
Sinh kha dung in vitro cua liposome được đánh giá thông qua đánh giá khả năng giải phóng dược chất trong các môi trường xác định sau các khoảng thời gian xác định Trong đánh giá này thường sử dụng các hệ thống thẩm tích đặt trong môi trường đệm, định lượng dược chất khuếch tán ra môi trường bằng phương pháp định lượng có hiệu lực để đánh giá khả năng dược chất giải phóng ra môi trường [19],[79]
*Ð6 ổn định của liposome:
Một trong những lí do làm cho liposome chưa được đưa vào sản xuất hàng loạt là vấn đề độ ổn định của chế phẩm Trong quá trình bảo quản liposome không bền về cả mặt hoá học và vật lý:
+ Về hoá học: phospholipid, thành phần chính của vỏ liposome là hợp chất dễ bị oxy hoá Quá trình oxy hoá tăng nhanh do tác động của các yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, 1on kim loại, pH môi trường vv [1], [2]
+Vê vật lý: Có hiện tượng thay đổi tính thấm của lớp lipid trong quá trình bảo quản gây rò rỉ dược chất và sự kết vón liposome làm giảm hiệu suất dược chất được gắn vào liposome, thay đổi quá trình giải phóng dược chất
[1], [2]
Đề đánh giá độ ôn định của liposome, người ta đánh giá các chỉ tiêu chất
lượng của liposome (hính thái cảm quan, kích thước, phân bố kích thước, hàm lượng dược chất, khả năng giải phóng dược chất, vv ) sau các khoảng thời gian xác định mà liposome được bảo quản ở các điều kiện nhất định
*Sinh khả dụng của liposome:
Sinh kha dung in vivo cua liposome được đánh giá thông qua các thử nghiệm trên động vật Có nhiều loài động vật được sử dụng để xây dựng mô
Trang 4024
rộng rãi hơn cả do sự tương đồng về mặt di truyền với con người cũng như sự tiện lợi khi nuôi và chăm sóc trong phòng thí nghiệm
M6 hinh in vivo c6 ưu điểm nỗi bật là đánh giá được chính xác tác động của thuốc lên khối u cũng như lên cơ thể do sự tương tác của cả ba yếu tố: hệ miễn dịch, khối u và thuốc quyết định Tuy nhiên, quá trình sàng lọc trên mô hình này tốn nhiều thời gian hơn so với các mô hình khác và cần có sự theo dõi chặt chẽ, thường xuyên của người làm thí nghiệm
Sau khi động vật thử nghiệm được tiêm liposome, các thông số dược động học của liposome và dược chất được xác định tại các cơ quan đích cần đánh giá như: gan, lách, khối u, bằng các biện pháp khác nhau như bóc tách mô, chiết được chất, định lượng hoặc chụp ảnh huỳnh quang (kết hợp đánh dấu huỳnh quang trước đó) Qua đánh giá ở các thời điểm khác nhau sẽ cho kết quả đặc điểm dược động học và đặc tính hướng đích của mẫu liposome Các thông số này thường được so sánh với chế phẩm đối chiếu như dạng bào chế thường quy hay chế phẩm dang liposome co san [40], [41], [46], [66],
[94]
*Tinh an todn cua chế phẩm:
Chế phẩm liposome cần được đánh giá độc tính ở nhiều khía cạnh
+ Độc tính với té bao in vitro: chọn tế bào cho ủ với liposome trong môi trường thích hợp rồi xác định tỷ lệ tế bào sống sót, so sánh với chế phẩm đối chiếu để đánh giá độc tinh in vitro cua mau liposome nghién cứu [61], [49]
Do cấu trúc đặc biệt của hệ mang thuốc liposome là lớp vỏ phospholipid kép, do vậy nghiên cứu trên tế bào ¿zviro phải chứng minh được khả năng xâm nhập vào tế bào của liposome cao hơn so với dạng dược chất tự do Ví dụ, ưu thế của doxorubicin là phát huỳnh quang, nên dễ dàng quan sát bằng thiết bị phù hợp