Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran. (LA tiến sĩ)
Trang 1
HQC VIEN QUAN Y
NGUYEN TRONG DIEP
NGHIEN CUU BAO CHE VA DANH GIA TAC
DUNG SINH HQC CUA VIEN NANG CUNG
KAVIRAN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
Trang 2
NGUYEN TRONG DIEP
NGHIEN CUU BAO CHE VA DANH GIA TAC
DUNG SINH HQC CUA VIEN NANG CUNG
KAVIRAN
Chuyén nganh: CONG NGHE DUOC PHAM VA BAO CHE THUOC Mã số: 62 72 04 02
LUẬN ÁN TIÊN SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS NGUYÊN THANH HẢI PGS.TS NGUYÊN TÙNG LINH
HÀ NỘI - NĂM 2017
Trang 3Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới:
PGS TS Nguyễn Thanh Hải PGS TS Nguyễn Tùng Linh
Là những người thấy đã tận tình hướng dẫn và hết lịng giúp đỡ tơi hồn
thành luận án này
Tơi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y,
Phịng sau đại học và các cơ quan chức năng trong Học viện đã cho phép và tạo
điều kiện cho tơi học tập và thực hiện luận án này
Tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Minh Chính và các cán bộ,
giảng viên, kỳ thuật viên Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược đã nhiệt tình
giúp đỡ và tạo mọi diéu kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án này
Tơi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của GS.TS Hồng Văn Lương, PGS.TS Nguyễn Văn Long, PGS.TS Vũ Bình Dương cùng các cán
bộ, kỳ thuật viên Trung tâm nghiên cứu Y Dược học quân sự, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc thực nghiệm - Học viện Quân y
Tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ mơn Dược lý, Bộ mơn Y học quân binh chủng, Bộ mơn Giải phẫu bệnh lý, Khoa Ÿ học hạt nhân - Học viện
Quân y, Bộ mơn Dược lý - Trường Đại học y Hà Nội, TT kiểm nghiệm Dược -
Mỹ phẩm Hà Nội đã tạo mọi điễu kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án nay Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, ủng hộ tơi trong quá trình thực hiện luận án này
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2017 Nghiên cứu sinh
Trang 4LOI CAM DOAN
Tơi xin cam đoan luận án này là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi Tắt cả
số liệu trong luận án là trung thực và chưa được cơng bĩ trong bat kỳ cơng trình nghiên cứu nào
TÁC GIÁ
Trang 5MUC LUC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tất và ký hiệu trong luận án Danh mục bảng Danh mục hình và) ã0 1
Chuong 1 TONG QUAN
1.1 DUGC LIEU DUNG TRONG NGHIEN CUU
1.1.1 Cây nhàu
1.1.2 Cúc hoa vàng
1.1.3 Sâm Ngọc linh sinh kh
1.2 KY THUAT CHIET XUAT DUGC LIEU VA PHUN SAY 1.2.1 Kỹ thuật chiết xuất được liệu -: + 1.2.2 Kỹ thuật phun sấy và ứng dụng trong làm khơ dịch chiết dược liệu
Chuong 2 NGUYEN VAT LIEU, THIET BI, DOI TUONG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU ssesssssssssssssssscecssssussseccssssuseesccsssssnsessecssssunsesseeerssineseeeessunes 36 2.1 NGUYEN VAT LIEU VÀ THIET BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1 Nguyên vật liệu _
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ ¿c¿-222222222 222221111 22121111 t1 ecree
2.1.3 Địa điểm nghiên cứu -2222¿++222222222t2222222122 122E2 re
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Nghiên cứu bào chế bột cao khơ tiêu chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối 222vvv2v+c+++r+reztttztrtrtrvrvrrree 38
2.2.2 Nghiên cứu bao ché, tiêu chuẩn hĩa và đánh giá độ ổn định của
b2121072013906615014:)610 27 Tả“ 48
2.2.3 Nghiên cứu tính độc tính và tác dụng sinh học của viên nang cứng Kayiran trên động vất thực nghiệHocsssnneiinxtsiadiadsa 1011406666 52,
Trang 6Chuong 3 KET QUA NGHIEN CUU
3.1 KET QUA BAO CHE BOT CAO KHO TIEU CHUAN
3.1.1 Két quả định tính, định lượng các hoạt chất trong dược liệu
3.1.2 Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hĩa bột cao khơ cúc hoa vàng 58
3.1.3 Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hĩa bột cao khơ quả nhàu 72 3.1.4 Kết quả chiết xuất, bào chế và tiêu chuẩn hĩa bột cao khơ sâm TNưE THR Sinh Khối sụaueaoaotigttBoIGGRIGAGAUOHOAGGIREINGRRSIRRRGAioflatgus 89
3.2 KET QUA XAY DUNG CONG THUC, TIEU CHUAN CO SG VA DANH GIA DO ON DINH CUA VIEN NANG CUNG KAVIRAN
3.2.1 Xây dựng cơng thức viên nang Kaviran
3.2.2 Kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang cứng
Kaviran
3.2.3 Kết quả đánh giá độ ơn định của viên nang cứng Kaviran
3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH, CHĨNG OXY HĨA, BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN NANG KAVIRAN
3.3.1 Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn
3.3.2 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hĩa và bảo VỆ gữfiGŨ8:vi6ni Tiarig eỨnE KâVITĂ Hs bisacisabitkdig40L531020ã10446054643018/0016568 105
Chương 4 BÀN LUẬN . -©22222222222222221222222221112122222221111212211X 112 4.1 CHIET XUAT, BAO CHE VA TIEU CHUAN CO SO BOT CAO KHO CÚC HOA VÀNG, QUẢ NHÀU VÀ SÂM NGỌC LINH SINH KHĨI 112
4.1.1 Lựa chọn nguyên liệu và kiểm định các được liệu đầu vào 112
4.1.2 Điều chế cao cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh 4.1.3 Bào chế bột cao khơ cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh
sinh khối bằng phương pháp phun sấy -.- :: 222:++222vvvvrerrstrvvvreee 121
4.1.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khơ cúc hoa vàng, quả nhàu ã#đữiiNEgt:1INHSIBH KHỔI:sasuá sai su nnggtữngtGJgqGu gu tung ti680xxadalssa 131
4.2 XÂY DỰNG CƠNG THỨC, TIEU CHUAN CO SG VA DANH GIA DO
ON ĐỊNH CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN
4.2.1 Xây dựng cơng thức bào chế
Trang 7
4.3.1 Đánh giá tính an tồn của viên nang cứng Kaviran 138 4.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hĩa trên động vật thực
nghiệm của viên nang Kaviran
4.3.3 Đánh giá tác dụng của viên nang Kaviran trên chuột nhất trắng bị suy giảm miễn dịch do chiếu tỉa Xạ 2222++2222E2v2reettcrrrvrveccree 141
KẾT TẤN ong 2e ti6s6ietettTDSBIGRGIGHGIIECIENHSRURSGREIESERRGHIGIESĐS 146 KIẾN NGHĨ:bsszzssbittgsiitsigttUBNGElSIGISDGIISGNSHIGSRIRSNHINIHESG82408/08nai 148
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 8¬ a= NYVNNN mm Be mm Bee Be mm = = = BNE COA NI DAABRwWwNH CC 24 25 26 27
DANH MUC CAC CHU VIET TAT
Phần viết tắt Phần viết đầy đủ
AE Aerosil
ALT Alanin Transaminase
AST Aspartat Transaminase
BC Bach cau
BP British Pharmacopoeia (Duge dién Anh)
CHV Cúc hoa vàng
CHV-PS Cao cúc hoa vàng phun sấy
CI Carr’s compressibility index (Chỉ sĩ nén)
CR Chất rắn
CR/DP Chất rắn/ dịch phun (Tỷ lệ chất rắn trong dịch phun sấy)
cs Cong su
cr Cong thire
d Khối lượng riêng (g/ml)
DĐVN Dược điển Việt Nam DL Dược liệu DM Dung mơi DM/DL Dung mợ/ dược liệu DPPH 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazylradical EtOH Ethanol Fla Flavonoid Gy Grey — đơn vị chiếu xạ HH Hỗn hợp
HPLC High performancc liquid chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao) HS Hiệu suất
KLTB Khối lượng trung bình
KLCT Khối lượng cơ thé
Trang 9TT 28 29 30 31 32 33 34 35 36 a7 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Phần viết tắt KLƯTĐ MAE MD MDA n NC NLSK Noni-ppt PL QN SEM SGMD TD TD/C R TCCS USP TNJ < 4l I+ Phần viết đầy đủ
Khối lượng ức tương đối
Microwave - assisted Extraction (Chiét xuat vi song) Maltodextrin
Malondialdehyd
Số lượng mẫu thử
Nghiên cứu
Ngọc linh sinh khối
Phần kết tủa trong ethanol giàu hợp chất polysaccharid
cua dich chiét qua nhau Phu luc
Qua nhau
Scanning Electron Microscope (Quét hién vi dién tir)
Suy giảm miễn dich Ta duoc
Ta duge/ chat ran (Tỷ lệ tá dược so với chất rắn trong cao được liệu)
Tiêu chuẩn cơ sở
United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)
Tahitian noni juiee (Nước ép quả nhàu)
Thể tích
Trang 10DANH MUC CAC BANG
Bảng Tên bảng Trang
1.1 Một số ứng dụng của MAE trong chiết xuất dược liệu 23
2.1 Thành phần cơng thức khảo sát bào chế viên nang cứng Kaviran 49
3.1 _ Hàm lugng luteolin va apigenin trong CHV 56 3.2 Hàm lượng scopoletin trong quả nhàu 57 3.3 _ Hàm lượng ginsenosid Rgl và Rbl trong sâm NLSK 57 3.4 Ham luong flavonoid toan phan trong CHV 58 3.5 Ảnh hưởng của phương pháp đến chiết xuat flavonoid tir CHV 59
3,6 Ảnh hưởng của dung mơi đến chiết xuất flavonoid tr CHV s9 3⁄7 Ảnh hưởng của số lần chiết và tỷ lệ DM/DL đến chiết xuất 60
flavonoid từ CHV
3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết xuất flavonoid từ CHV 6l
3.9 Thơng số qui trình điều chế dịch chiết CHV 62
3.10 Chiết xuất flavonoid từ CHV ở qui mơ 3kg/mẻ 62
311 Kết quả chiết xuất, cơ đặc và loại tap cao CHV 2:1 63
3.12 Thanh phần cao CHV dùng để nghiên cứu phun sấy 64 3.13 Cơng thức khảo sát loại tá dược phun sấy cao CHV 64
3.14 Ảnh hưởng của loại tá được đến phun sấy cao CHV 64
3.15 Cơng thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn đến phun 66
sây cao CHV
3.16 Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/ chất rắn đến phun sấy cao CHV 67
3.17 Cơng thức khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ cấp dịch 69
phun đến phun sây cao CHV
3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ, tốc độ cấp dịch đến phun say cao CHV 69 3.19 Cơng thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao 70
CHV
3.20 Ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao CHV 7I
Trang 113.23 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL và số lần chiết dén chiét flavonoid 74
từ quả nhàu
3.24 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL đến chiết xuất noni-ppt từ quả nhàu — 76
3.25 Kết quả chiết xuất, cơ cao, loại tạp của cao quả nhàu tồn phan 71
3.26 Tỷ lệ chất rắn và hàm lượng hoạt chất trong quả nhàu và cao quả 78
nhau 1:1
3.27 Thiết kế cơng thức khảo sát loại tá dược phun sấy cao quả nhau 79 3.28 Ảnh hưởng của loại tá được đến phun sấy cao quả nhau 79 3.29 _ Cơng thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao 81
quả nhàu
3.30 Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao quả nhàu 82
3.31 Cơng thức khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ cấp dịch 84 đến phun sấy cao quả nhàu
3.32 Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến phun sây 84 cao quả nhàu
3.33 Cơng thức khảo sát ảnh hướng của tỷ lệ chất CR/DP đến phun sấy 86
cao quả nhàu
3.34 Ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao quả nhàu 86
3.35 Thơng số qui trình bào chế bột cao khơ quả nhàu bằng phun say 88 3.36 Thành phần nguyên liệu và cao sâm NLSK 89 3.37 Cơng thức khảo sát ảnh hưởng của loại tá được đến phun sấy cao 90
sâm NLSK
3.38 Ảnh hưởng của tá dược đến kết quả phun sấy cao sâm NLSK 90
3.39 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phun sấy cao sâm NLSK 91
3.40 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phun sấy cao sim NLSK 92
3.41 Cơng thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao 93
sâm NLSK
3.42 Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao sâm NLSK 93
3.43 Cơng thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao 95 sâm NLSK
Trang 123.47 _ Thành phần cơng thức khảo sát bào chế viên nang cứng Kaviran 99
3.48 _ Thành phần cơng thức cho một viên nang cứng Kaviran 100 3.49 Tý lệ chuột sống, chết sau 72 giờ uống Kaviran 102 3.50 Ảnh hưởng của Kaviran đối với khối lượng cơ thể thỏ 102
3.51 Ảnh hưởng của Kaviran đối với điện tim thỏ 103
3.52 Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu và tiểu cầu ở các lơthỏ 103
nghiên cứu
3.53 Nồng độ AST, ALT, Creatinin và Ure của các lơ thỏ 104 3.54 Tĩm tắt nhận xét mơ bệnh học gan, thận, lách thỏ thí nghiệm 105
3.55 Ảnh hưởng của Kaviran lên khối lượng gan tương đối 106 3.56 Ảnh hưởng của Kaviran lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh 106
của các nhĩm chuột nghiên cứu
3.57 Tĩm tắt nhận xét về đại thể và vi thé gan của các nhĩm chuột 107
đánh giá tác dụng bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran
3.58 Ảnh hưởng của Kaviran lên KLƯTĐ và KLLTĐ chuột nhắt trắng 108
3.59 Ảnh hưởng của Kaviran lên số lượng bach cầu chuột nhắt trắng 108
Trang 13DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây nhàu và quả nhau 3 1.2 Cúc hoa vàng 9
1.3 Thiết kế bình chiết sử dụng que siêu âm 18
1.4 Đồ thị biểu diễn trạng thái của các chất 24
1.5 _ Sơ đồ cấu tạo thiết bị và quy trình phun sấy 29
1.6 Một số kiểu thiết kế của đĩa phun ly tâm 31
3.1 Sự phụ thuộc của mật độ quang theo nồng độ cua quercetin 58 3.2 Anh hwong cia thoi gian đến chiết xuất flavonoid từ CHV 61
3.3 Ảnh SEM bột cao khơ CHV phun sây với các tá dược khác nhau 65
3.4 Ảnh SEM bột cao khơ CHV phun sấy với tỷ lệ TD/CR khác nhau 67
3.5 Ảnh SEM bột cao khơ CHV phun sấy ở các nhiệt độ khác nhau 69
3.6 _ Ảnh hưởng của dung mơi đến chiết flavonoid từ quả nhau 73 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết flavonoid từ quả nhàu 75
3.8 Ảnh hưởng của thời gian đến chiết flavonoid từ quả nhàu 75
3.9 Hàm lượng và hiệu suất thu hồi scopoletin trong bột cao khơ quả 79
nhàu phun sây với các tá dược khác nhau
3.10 Ảnh SEM của bột cao khơ quả nhàu ở các tỷ lệ TD/CR khác nhau 80
3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến hàm lượng và hiệu suất thuhồi 82
scopoletin của bột cao khơ quả nhàu
3.12 Ảnh SEM của bột cao khơ quả nhàu ở các tỷ lệ TD/CR khác nhau 82
3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ cấp dịch đến hàm lượng và hiệu 84
suất thu hơi scopoletin của bột cao khơ quả nhàu
3.14 Ảnh SEM bột cao khơ quả nhàu phun sấy ở nhiệt độ khác nhau 85
3.15 Hàm lượng và hiệu suất thu hồi seopoletin của bột cao khơ quả 86
nhàu phun sây ở tỷ lệ CR/DP khác nhau
3.16 Ảnh SEM của bột cao khơ quả nhàu ở tỷ lệ CR/DP khác nhau 87 3.17 Ảnh hưởng của tá dược đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi 90
ginsenosid của bột cao khơ sâm NLSK
Trang 14Hinh Tén hinh Trang
3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ dén ham lvong va hiéu suat thu hdi 92
ginsenosid của bột cao khơ sâm NLSK
3.20 Ảnh SEM của bột cao khơ sâm NLSK khi phun sấy ở 120°C (a) và 92
140°C (b)
3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến hàm lượng và hiệu suất thu hoi 93
ginsenosid của bột cao khơ sâm NLSK
3.22 Ảnh SEM của bột cao khơ sâm NLSK phun sấy ở tỷ lệ TD/CR 94
khác nhau
3.23 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/ dịch phun sấy đến hàm lượng và 95
hiệu suất thu hồi ginsenosid của bột cao khơ sâm NLSK
3.24 Anh SEM cia bét cao khơ sâm NLSK phun sấy ở tỷ lệ CR/DP 95 15%
3.25 Khối lượng tuyến lách và tuyến ức tương đối của các nhĩm chuột 98
3.26 Ảnh hưởng của tá dược đến thơng số của hỗn hợp bột đĩng nang 99 và viên nang khảo sát
Trang 15Hiện nay, các thuốc nguồn gốc dược liệu được sử dụng rộng rãi và phát
triển nhanh chĩng trong hệ thong y tế Ngay ở các nước phát triển, thuốc nguồn
gốc dược liệu đã được sử dụng rất phơ biến như là một liệu pháp bổ trợ hoặc thay thế (Canada 70%, Úc 48%, Mỹ 42%, Pháp 75%) [148] Thuốc cơ truyền đã
được đưa vào chương trình đào tạo ở các trường đại học từ bậc cử nhân đến tiến
sỹ (39 nước, 30% các nước khảo sát) [150] Ở Việt Nam, thuốc nguồn gốc dược
liệu được sử dụng từ lâu đời, nhưng vấn đề tiêu chuẩn hĩa từ nguyên liệu ban
đầu, bán thành phẩm đến thành phẩm nhằm nâng cao chất lượng và độ ồn định
cịn chưa được thực hiện triệt đẻ Phát triển các dạng thuốc hiện đại từ dược liệu cũng cịn nhiều van dé cần giải quyết Việc áp dụng các tiền bộ khoa học (cơng nghệ chiết xuất, bào chế bột cao khơ và bào chế thành phẩm) để hiện đại hĩa các dạng thuốc này là rất cần thiết, nhằm đảm chất lượng, tác dụng điều trị cũng như các lợi ích trong ứng dụng trên lâm sảng
Suy giám miễn dịch mắc phải là hậu quả của nhiều quá trình bệnh lý như:
Suy dinh đưỡng, nhiễm khuẩn, ung thư, sau khi dùng các thuốc ức chế hoặc độc với các tế bào của hệ thống miễn dịch, do tỉa xạ hoặc hố chất điều trị ung thư, đặc biệt là trong nhiễm HIV/AIDS [13], [17] Trong các trường hợp bệnh lý
trên, ngồi điều trị đặc hiệu đề loại trừ tác nhân gây bệnh thì điều trị nhằm nâng đỡ cơ thể, tăng cường miễn dịch là cần thiết Tuy nhiên, do chỉ phí điều trị cao,
đặc biệt là khi sử dụng thuốc kháng retrovirus trong điều trị HIV/AIDS, nhiều
bệnh nhân khơng cĩ cơ hội tiếp cận, thì việc tìm kiếm các thuốc điều trị bổ sung hoặc thay thế, với giá thành đễ chấp nhận là vân đề cấp bách và cĩ ý nghĩa thực
tiễn cao
Các nghiên cứu gần đây cho thay, một số hoạt chất chiết xuất từ dược liệu cĩ tác dụng ức chế sự nhân lên của HIV [105], [133], kích thích miễn dịch [82],
[90] và chống oxy hĩa [133], [158], do vậy rất cĩ thể cĩ hiệu quả trong điều trị
cho bệnh nhân nhiễm HIV, vì những người này bị tổn thương hệ miễn dịch nghiêm trọng Mặt khác, tình trạng cân bằng oxy hĩa khử gây ảnh hưởng đến
Trang 16biện pháp trị liệu thay thế hoặc bé sung trong điều trị các trường hợp suy giảm
miễn dịch mắc phải nĩi chung và HIV/AIDS nĩi riêng
Quả nhàu và cúc hoa vàng (CHV) là các dược liệu sẵn cĩ ở Việt Nam với
trữ lượng lớn, đã được sử dụng từ lâu để làm thuốc Các nghiên cứu gần đây cho
thấy quả nhàu và CHV cĩ nhiều tác dụng sinh học quí như: tăng cường miễn dịch, chống oxy hố, ức chế khối u, kháng khuẩn, chống nắm, chống viêm Sâm
Ngọc linh sinh khối (NLSK) được tạo ra bằng cơng nghệ sinh khối tế bào thực
vật, cĩ chất lượng ổn định Các nghiên cứu bước đầu cho thấy sâm NLSK cĩ
một số tác dụng sinh học tương tự với sâm tự nhiên như: tăng lực, tăng quá trình nhận thức và ghi nhớ, chống oxy hĩa, bảo vệ gan Tuy nhiên, các nghiên cứu về chiết xuất, bào chế chế phẩm từ ba dược liệu này cịn đơn giản và chưa cĩ chế
phẩm thuốc nào bào chế phối hợp từ ba dược liệu này Do vậy, để gĩp phần nghiên cứu phát triển một chế phẩm thuốc mới từ quả nhàu, CHV và sâm NLSK
(Viên Kaviran) nhằm tăng cường miễn dịch và chống oxy hĩa theo hướng hiện đại, an tồn, hiệu quả, thuận tiện khi sử dụng và ứng dụng được vào sản xuất, đề tài: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran” duoc tiến hành nhằm các mục tiêu sau:
1 Bào chế được bột cao khơ định chuẩn của cúc hoa vàng, quả nhàu và
sâm Ngọc linh sinh khối
2 Bào chế được viên nang cứng Kaviran từ bột cao khơ định chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối
Trang 171.1 DƯỢC LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
1.1.1 Cây nhàu
1.1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố
Nhau cĩ tên khoa hoc la Morinda citrifolia L, hg Ca phê (Rubiaceae), nguồn gốc từ Đơng Nam Á đến Ức, được trồng ở Ấn độ, vùng Ca-ri-bê, Nam mỹ [38] Ở Việt Nam, cây mọc chủ yếu ở miền Nam từ Quảng Bình trở vào
[20] Cây Nhàu là cây nhỡ hay to, cao 6 - 8m, cĩ nhiều cành to, lá mọc đối xứng
hình bầu dục, đỉnh lá nhọn hoặc tù, dài 12 - 30cm, rộng 6 - 15cm, mép uốn lượn, mặt trên xanh lục bĩng, mặt dưới nhạt Quả nhàu hình bầu dục, dài 3 - 10cm, rộng 3 - 6cm, mọc thành chùm, quả chín cĩ màu trắng vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt lồi lõm Mùa quả: tháng 3 - 5 Sản lượng quả nhàu ở Hawaii cĩ thể đạt 50
tan/ha/nam [4], [38] Bộ phận dùng: Vỏ, rễ, lá, quả phơi hoặc sấy khơ [4]
se
Hình 1.1 Cây nhàu và quả nhàu
1.1.1.2 Thành phân hĩa học
Cĩ khoảng 160 hợp chất hĩa học đã được xác định trong cây nhàu và các nguyên tố vi lượng Quả nhàu chứa khoảng 90% nước, các thành phần khác
gồm: Chất rắn hịa tan, chất xO, protein (chiém 11,3% khối lượng dịch ép khơ), các amino acid (acid aspartic, acid glutamic và isoleucin), chất khống chiếm
8,4% chat rắn (thành phần chính 1a kali, sulfur, calci, phospho và vết selen) Vitamin chính trong quả nhàu là vitamin C, ngồi ra cịn cĩ tiền vitamin A Các hợp chất chính trong quả là phenolic, acid hữu cơ, alcaloid va polysarcharid
Trang 18là một coumarin đã được phân lập vào năm 1993 tại Đại học Hawaii, cĩ hoạt
tính giảm đau, kháng khuẩn, chống tăng huyết áp, đồng thời kiểm sốt mức độ
serotonin trong co thé Các acid hữu cơ chính là acid aproic và caprylic Trong khi alcaloid quan trọng nhất là xeronin - là một alcaloid cĩ khả năng kết hợp với protein của người làm tăng chức năng của chúng Cĩ khoảng 51 hợp chất dễ bay
hơi đã được xác định trong quả nhàu chín [38], [144] Quả nhàu chứa hàm lượng cao các polysarcharid, là thành phần chính cĩ tác dụng tăng cường miễn dịch và
chống khối u [28], [66]
Theo Nguyễn Trọng Thơng và cs, quả nhàu non, già và chín đều chứa
anthraglycosid, flavonoid, coumarin, triterpenoid, saponin, polyphenol, alcaloid, dau béo, tinh dầu, acid hữu cơ, đường khử, acid uronic Trong đĩ, anthraquinon trong quả nhàu non là 0,56%, quả nhàu già là 0,55% [24]
1.1.1.3 Tác dụng sinh hoc
Nhàu đã được sử dụng làm thuốc trong dân gian từ hơn 2000 năm, với nhiều tác dụng điều trị [144] Tuy nhiên, những bằng chứng nghiên cứu khoa học gần đây gĩp phần làm sáng tỏ những tác dụng điều trị của nhàu, bao gồm:
a Tác dụng kháng khuẩn, kháng nắm và kháng virus:
Một số nghiên cứu cho thấy, quả nhàu ức chế sự phát triển của một số vi
khuan nhu Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus morgaii,
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Salmonella va Shigella Tác dụng kháng khuẩn cĩ thể do sự hiện diện của các hợp chất phenolic nhu
acubin, L-asperuloside, alizarin, scopoletin trong qua nhàu Dịch chiét ethanol
và hexan của quả nhàu cĩ tác dụng chống lao với khả năng ức chế 89-95% sự
phat trién cua Mycobacterium tuberculosis Qua nhau cé tac dung khang virus
Trang 19cơng bố trong nhiều nghiên cứu gần đây, trong đĩ tính đến năm 2011 đã cĩ 19 nghiên cứu liên quan đến ung thư (7 nghiên cứu ¡ viro, 9 nghiên cứu i vivo
trên động vật và 3 nghiên cứu in vivo trên người), nhưng chủ yếu là thử nghiệm với nước ép quả nhàu khơng tỉnh khiết [35] Một số nghiên cứu tập trung vào phần kết tủa trong ethanol (Noni-ppt) của nước ép quả nhàu, tương ứng với một hợp chất giàu polysaccharid gồm acid glucuronic, galactose, arabinose va
rhamnose Noni-ppt đã được chứng minh là cĩ tác dụng điều hịa miễn dịch và
chống khối u trong ung thư biểu mơ phổi trên chuột thực nghiệm, được báo cáo
lần đầu bởi Hiramizu A và cs [66] Trên mơ hình tế bào, Noni-ppt kích thích
việc sản xuất các tế bào lympho T, tế bảo tuyến ức và đại thực bảo sản xuất cytokin, là những chất trung gian quan trọng trong ức chế tăng trưởng tế bào và
độc tế bào khối u [38]
Noni-ppt cũng cĩ khả năng kích thích giải phĩng một số các chất trung gian
từ các tế bào chuột phản ứng, bao gồm yếu tố hoại tử khdi u (TNF-a), interleukin-1f (IL-1), IL-10, IL-12 p70, interferon-y (IFN-y) va nito oxid (NO), ngăn chặn giải phĩng IL-4, nhưng khơng cĩ tác dụng trên IL-2 Noni-ppt làm
chậm chu kỳ tế bao trong khối u, tăng đáp ứng của tế bào để các tế bảo miễn
dịch chồng lại sự phát triển của khối u và tăng hoạt động của đại thực bào Làm
tăng thời gian sống sĩt và tác dụng điều trị khi dùng kết hợp noni-ppt với
ngưỡng dưới liều điều trị tối ưu của các tác nhân hĩa trị liệu chuẩn như
adriamycin, cisplatin, 5-fluorouracil va vincristin Điều này cho thay img dung lâm sàng quan trọng của noni-ppt như một chất bổ sung trong điều trị ung thư [66] Nghiên cứu về cơ chế tác dụng cho thấy, nước ép quả nhàu cơ đặc điều chỉnh các hệ thống miễn dịch thơng qua kích hoạt của thụ thể cannabinoid 2 (CB2), nhưng ức chế CBI, ức chế sản xuất IL-4, nhưng tăng san xuat ctia IFN-a
Trang 20thư Đặc biệt, phân đoạn chiết với ethyl acetat hoac ethyl acetat - nước thé hién
tác dụng ức chế ung thư mạnh nhất khi thử nghiệm với dong ung thư vú va gan
Phân tích về thành phần hĩa học cho thấy ethyl acetat - nước chứa hàm lượng
cao chrysin [69], [121]
Trên mơ hình gây suy giảm miễn dich bang cyclophosphamid va tia xa, cao
quả nhau liều 6g/kg uống liên tục trong 5 ngày và 9 ngày đã làm cải thiện rõ rệt các chỉ số đánh giá chức năng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cũng như
tình trạng chung miễn dịch như: Khối lượng tuyến lách, tuyến ức tương đối và số lượng bach cầu của chuột nhất trắng [2], [24], [25]
e Tác dụng chống oxy hĩa, bảo vệ gan:
- Dịch chiết ethyl acetat từ quả nhàu gây ức chế mạnh quá trình oxy hĩa
lipid khi so sanh véi tocopherol va butyl hydroxy toluen Hoạt động dọn gốc tự do của nước ép quả nhàu là do kha nang bảo vệ các tế bào hoặc lipid từ thay đổi
oxy hĩa được thúc đẩy bởi các gốc tự do anion superoxid (SAR) va lipid peroxid (LPO) Tác dụng ức chế của nước ép quả nhàu phụ thuộc vào liều của cả LPO và SAR khi thử nghiệm in vitro Hoat déng don SAR của nước ép quả nhàu cao gap 2,8 lần so với vitamin C, 1,4 lần so với pycnogenol va 1,1 lần so với bột hat nho [38], [144] Trên mơ hình gây tổn thương cấp tính gan gây ra bởi carbon
tetraclorid (CCl,) in vivo, nước ép quả nhàu 10% cho uống trong 12 ngày đã cĩ
khả năng làm giảm mức SAR và LPO của gan đến mức 20% và 50% so với ba nhĩm chứng sau 3 giờ uống CCl„ Như vậy, nước ép quả nhàu cĩ thể bảo vệ gan
từ một tiếp xúc với CCla gây ung thư bên ngồi [144]
- Phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của nước ép quả nhàu lên men cĩ tác dụng chống oxy hĩa mạnh hơn manmnitol hoặc vitamin C, trong khi phân đoạn
Trang 21- Cao quả nhàu tồn phần (cao 5:1) liều 1,2g và 2,4g/kg, uống liên tục trong § ngày làm giảm hoạt độ của các emzym AST, ALT trong huyết thanh, làm
giảm hàm lượng MDA dịch đồng thể gan của chuột nhất trắng bị tơn thương tế bao gan bang CCl, va paracetamol liều cao Tác dụng của cao quả nhàu ở hai liều như nhau và tương đương silymarin liều 67mg/kg [3]
d Tác dụng chống viêm:
Nước ép quả nhàu ức chế chọn loc enzym cyclo-oxygenase (COX - 1 va
COX-2), ức chế phù chân chuột do carragenan, ức chế sản xuất NO và
prostaglandin E2 [51] Hoat tinh ire ché trên COX-2 và COX-1 của nước ép quả
nhàu (liên quan trong ung thư vú, đại tràng và phổi) được so sánh với các chất chống viêm kinh điển nhĩm NSAIDs như aspirin, indomethacin (ức chế COX-1)
và Celebrex (ức chế COX-2) Kết quả này cho thấy, nước ép quả nhàu cĩ tác
dụng ức chế chọn lọc COX-2 được so sánh với Celebrex [38], [144] Nước ép quả nhàu và chất đánh dấu là scopoletin đã được chứng minh là cĩ tác dụng trong phịng và điều trị viêm dạ dày - thực quản, chủ yếu thơng qua kháng tiết, tăng cường bảo vệ màng nhầy niêm mạc thơng qua ức chế serotonin, gốc tự do
và cytokin trung gian viêm [95] Cao quả nhàu tồn phần (cao 5:1) cĩ tác dụng
giảm thể tích viêm chân chuột do carragenin gây nên, giảm thẻ tích dich và số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm, giảm khối lượng u hạt Tác dụng phụ thuộc
vào liều dùng, bắt đầu từ liều 24g/kg mới cĩ tác dụng chống viêm [24]
e Một số tác dụng sinh học khác:
- Tác dụng giảm đau: Nước ép quả nhàu (TNJ) cĩ tác dụng giảm đau khi
thử trên mơ hình đau quặn So với nhĩm chứng, nhĩm dùng TN! giảm số lượng cơn đau quặn lần lượt là 82,30%, 74,53% và 64,29% tương ứng với nhĩm dùng
Trang 22- Tác dụng trên tìm mạch và huyết áp: Nghiên cứu gần đây đã chứng minh
hiệu quả của quả nhàu trong việc ngăn ngừa xơ cứng động mạch, liên quan đến
quá trình oxy hĩa lipoprotein tỷ trọng thấp [38] Nước ép quả nhàu liều 50 và
100mg/kg làm giảm đáng kế cholesterol tồn phan, triglycerid và lipoprotein -
cholesterol tỷ trọng thấp trên chuột thực nghiệm [123] Dịch chiết ethanol từ lá
và quả nhàu cĩ tác dụng hạ huyết áp khi thử nghiệm trên chuột gây cao huyết áp
bởi dexamethason [146] Cao quả nhàu cĩ tác dụng hạ huyết áp với liều 1,5g/kg,
liều càng cao tác dụng hạ huyết áp càng mạnh [24]
- Quả nhàu và xeronin: Quả nhàu cĩ chứa một tiền chất tự nhiên cho sản xuất xeronin, được đặt tên là proxeronin - một alcaloid cĩ khả năng kết hợp với
protein của người, làm tăng một số chức năng của cơ thể Trong cơ thể,
proxeronin được chuyển đổi thành xeronin nhờ một enzyme gọi là
proxeroninase Alcaloid này là một yếu tố quan trọng giúp duy trì quá trình trao
đổi chất bình thường trong cơ thể Khi bị ốm, quả nhàu cĩ thẻ giúp ích trong các
trường hợp như: Huyết áp cao, viêm khớp, viêm loét dạ dày, bong gân, chấn
thương, trầm cảm, lão suy, tiêu hĩa kém và đau đớn [144]
- Cơng năng, chủ trị của quả nhàu: Nhuận tràng, lợi tiểu, điều kinh, hoạt huyết Dùng khi táo bĩn, tiểu tiện khơng thơng, điều kinh, hạ sốt, chữa ho, hen;
cịn dùng với tính chất tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng cho cơ thê
Ngày dùng 12 - l6 g dạng thuốc sắc [5] 1.1.2 Cúc hoa vàng
1.1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bỗ
Cúc hoa vàng (CHV) cịn cĩ tên khác là Kim cúc, Hồng cúc, Dã cúc, Cam
Trang 23hoặc kẽ lá, đường kính 1-1,5cm [4], [20]
Hình 1.2 Cúc hoa vàng
Nguồn: Theo Đỗ Duy Bích và cộng sự (2004) [4]
CHV cĩ nguồn gốc ở vùng Đơng Á: Trung Quốc và Nhật Bản Ở Việt Nam,
CHV được trồng từ lâu đời Hiện nay cây cĩ nhiều ở Hưng Yên, Hải Dương,
Bắc Ninh, Hà Nội và một số tỉnh khác ở phía bắc với trữ lượng lớn Cây ra hoa
nhiều hàng năm, hiếm cĩ hạt Mùa đơng cĩ hiện tượng rụng lá hơi tàn lụi Bộ
phận dùng: Hoa thu hái vào đầu tháng 10 đến tháng 1-2 năm sau Hoa hái về đem đồ rồi phơi 3-4 nắng đến khơ [4], [20]
1.1.2.2 Thành phần hố học
a Tinh dau:
Hàm lượng tỉnh dầu trong hoa tươi, hoa khơ và hoa chế biến của CHV
Trung Quốc chiếm tỷ lệ lần lượt là 0,25%, 0,43% và 0,23% Trong tinh đầu CHV Han Quốc cĩ 73 hợp chất (chiếm 96,65% tổng tỉnh dầu chiết xuất được) [72] Thành phần chính trong tinh dau CHV là a-pinen, 1,8-cineol, - terpineol, cis-sabinol, thujon, camphor, borneol, bornyl acetat, cis-chrysanthenol, B-
caryophyllen, germacren D, a-cadinol [72], [125] Theo Vi Thi Len va cs, tinh
dầu hoa CHV cĩ 68 cấu tử, trong đĩ cĩ 24 cấu tử với hàm lượng trên 1% và 14 cấu tử cĩ hàm lượng đưới 1% [18]
Trang 24CHV chira ham lugng cao phenolic va flavonoid Trong đĩ, đã được xác dinh duge 10 flavonoid trong CHV Trung Quốc [153] Cao khơ bao chế từ dịch chiết nước của CHV chứa 2,71% phenolic và 2,52% flavonoid, đây là hai nhĩm
hoạt chất liên quan đến tác dụng trong điều trị biến chứng tiêu đường và lão hĩa
[103] Theo Chen Q và cs: CHV chứa 2,2% phenolic (tinh theo acid galic) va 2,8% flavonoid (tính theo rutin), là các nhĩm hoạt chất liên quan đến tác dụng chống oxy hĩa và chống viêm [41] Tuy nhiên, theo Yang C H và cs: CHV
Trung Quốc chứa 6,02mg/g phenolic và 2,23mg/g flavonoid (tính theo quercetin) [154] Như vậy, hàm lượng phenolic và flavonoid giữa các nghiên
cứu là cĩ sự khác biệt, điều này phụ thuộc vào nguồn gốc và chất lượng dược liệu, cũng như phương pháp phân tích áp dụng Trần Vân Hiền và cs đã phân lập từ CHV trồng ở Hưng Yên được 2 chất tinh khiết là apigenin và luteolin Da
đánh giá được tác dụng kháng HIV của hai hợp chất này và do đĩ cĩ thể coi các
flavonoid nay là thành phần cĩ hoạt tính từ CHV [9], [10]
Các thành phần khac trong CHV: Carotenoid (chrysanthemoxanthin); Acid
amin: adenin, cholin, stachydrin; Sesquiterpen: angeloyl cumambrin B, arteglasin A, angeloylajadin, chrysetunon, tuncfulin, cumambrin A [4]
1.1.2.3 Tác dụng và cơng dụng
a Theo y học cổ truyền: CHV vị ngọt, đắng, tính hơi hàn Vào các kinh phé, can, thận Cĩ tác dụng thanh nhiệt, giải độc, mát gan, sáng mắt Thường
được dùng để chữa các chứng phong nhiệt ở can kinh, mắt mờ, mắt đỏ sưng đau,
hoa mắt chĩng mặt Liều dùng mỗi ngày 8-30g dạng thuốc sắc hay bột [4], [20]
b Tác dụng trên vi khuẩn và virus:
Tác dụng kháng khuẩn của CHV chủ yếu là thành phan tinh dau trong hoa
Thanh phan chính trong tỉnh dầu CHV như a-pinen, 1,8-cineole, a-terpineol, cis- sabinol, thujon, camphor, borneol và bornyl acetat cĩ các hoạt tính sinh học
Trang 25hoặc bơi ngồi để điều trị các bệnh khác nhau trên lâm sang như nhiễm khuẩn, cúm, viêm amiđan, viêm miệng, viêm phế quản, viêm phối, viêm ruột thừa,
viêm da và mụn nhọt [125] Tỉnh dầu CHV cĩ hoạt tính kháng khuẩn mạnh,
chống lại các vi khuẩn trong miệng (nồng độ ức chế tối thiểu từ 0,1-1,6 mg/ml)
Cae dit liéu in vitro cho thấy, sử dụng tỉnh dầu CHV với các kháng sinh khác cĩ
thể tạo nên tác dụng hiệp đồng cĩ lợi trong điều trị nhiễm khuẩn [72]
Trần Vân Hiền và cs nghiên cứu về CHV trồng ở Hưng Yên cho thấy, hợp
chất chiết từ CHV thẻ hiện tác dụng ức chế sự nhân bản của HIV trên 2 chủng
virus HIV là HIV-I HIB và HIV-1 SF2 Từ dịch chiết CHV đã phân lập được
các phân đoạn flavonoid là Fl, F2, F3, F5 Trong đĩ, F2 là apigenin, F3 là luteolin, F5 là một hỗn hợp gồm ít nhất 3 flavonoid (Apigenin-, luteolin, acacetin 7-O-B-D-glucopyranosid) Cac phân đoạn dịch chiết này đều cĩ tác
dụng ức chế hình thành NO, nhưng phân đoạn F3 cho tác dụng ức chế mạnh
nhất Ở nồng độ 25 và 150uM, các phân đoạn dịch chiết cĩ tác dụng ức chế sản xuất NO ở mức cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0,05 và P < 0,01) Những phân đoạn dịch chiết nay thé hiện cả tác dụng ức chế tạo ra NO và hoạt dong khang HIV-1 Kết quả này cho rằng, các phân đoạn dịch chiết CHV thử nghiệm cĩ tác dụng rất
mạnh trong ức chế sự hình thành NO sinh ra bởi lipopolysaccharid (LPS) và HIV-I Cùng với tác dụng kháng HIV-I và chống oxy hĩa, trên thực tế là tác
dụng ức chế sản xuất NO, dịch chiết CHV cĩ thể làm chậm sự phát triển của
HIV và ngăn ngừa nhiễm trùng cơ hội trong bệnh nhân nhiễm HIV [9]
e Tác dụng trên hoạt động viêm, đị ứng và miễn dịch:
Nghiên cứu của Cheng W và cs cho thấy: Phân đoạn chiết bang butanol của CHV cĩ tác dụng ức chế phù tai chuột với liều 150mg/kg, khơng làm tăng
đáng kể tuýp phản ứng muộn sự nhạy cảm gây ra bởi 2,4 dinitro-flurobenzen,
Trang 26butanol cĩ hiệu lực trên chức năng của hệ thống thực bào bạch cầu đơn nhân gây ra bởi cyclophosphamid trên chuột Như vậy, phân đoạn butanol cĩ tác dụng
chống viêm, điều chỉnh đáp ứng miễn dịch tế bào, dịch thể và hoạt động thực
bào của bạch cầu đơn nhân Phân tích về hĩa học cho thấy, phân đoạn butanol chứa ba flavonoid chính là luteolin, luteolin-7-glucosid va acacetin- 7-
rhamnoglucosid, các thành phần này được cho là gây nên hoạt tính chống viêm
và miễn dịch [44] Dịch chiết ethanol 70% của CHV ức chế mạnh sự sản xuất NO, PGE;, TNFơ và IL-IB do đĩ nĩ cĩ hoạt tính chống viêm, cĩ thê là kết quả
của sự ức chế các chất trung gian gây viêm [45] Theo Luyen B.T.T và cs,
nhĩm flavonoid và dẫn xuất của acid quinic là những chất đánh dấu gây nên tác dung ức chế sản xuất NO, TNEơ và tác dụng chống viêm của CHV chủ yếu liên quan dén nhém phenolic [91]
Dịch chiết CHV cĩ tác dụng tốt trong viêm da cơ địa khi thử nghiệm trên
chuột thực nghiệm với việc làm giảm ré rét mite IgE, IgG1, IL-4, IFN-y trong
huyết tương và mRNA của IFN-y, IL-4, IL-13 trong tơn thương da lưng Tác
dụng của địch chiết CHV nồng độ cao tương tự như hydrocortison, nhưng khơng cĩ tác dụng phụ như teo da, nhiễm trùng thứ cấp Do vậy, CHV cĩ thể là một giải pháp thay thế cho hydrocortison trong điều trị viêm da dị ứng [113]; Dịch
chiết CHV cịn cĩ tác dụng ức chế phù nề tại chỗ ở tai chuột, dẫn đến giảm đáng
kể độ dày và khối lượng mơ da, giảm sự sản xuất ra cytokin gây viêm, hoạt động
của myeloperoxidase qua trung gian bạch cầu trung tính và các chỉ số mơ bệnh
học khác nhau Do đĩ, dịch chiết CHV cĩ tiềm năng trong điều trị một số bệnh
ngồi da liên quan đến miễn dịch [83]
d Tác dụng chống oxy hĩa:
Nhĩm phenolic và flavonoid trong CHV là những hoạt chất chính gây nên
hoạt tính chống oxy hĩa [41], [92] Theo Debnath T và cs, cả dịch chiết nước và
Trang 27sự oxy hĩa acid linoleie Tác dụng chống oxy hĩa của CHV cĩ sự tương quan
với hàm long phenolic va flavonoid trong dịch chiết, trong đĩ dịch chiết
ethanol cho hoạt tính chống oxy hĩa cao hơn so với dịch chiết nước Ngồi ra,
dịch chiết ethanol cĩ khả năng ngăn cản mạnh sự phá hủy DNA do oxy hĩa và
khơng gây độc trong tế bảo gan [50] Flavonoid chiết từ CHV cĩ tác dụng ức
chế phản ứng peroxy hĩa lipid màng tế bào gan và hạn chế giảm hoạt độ enzym SOD trên chuột gây độc bằng CCl¿ Các phân đoạn flavonoid chiết từ CHV cĩ tác dụng dọn gốc tự do DPPH, ức chế tạo thành gốc tự do anion superoxid và ức
chế NO ir viro ở nồng độ tương đối thấp [§] e Tac dụng trên tế bào ung thư:
Một số nghiên cứu gần đây cho thay, CHV co tác dụng trên tế bào ung thư
Li Z F và cs nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết CHV trên ức chế chu trình tế
bào và chết theo chương trình (apoptosis) trong tế bảo ung thư gan người dịng
MHCC97H Kết quả cho thấy, dịch chiết CHV ức chế sự tăng sinh của các tế
bào MHCC97H phụ thuộc vào liều và thời gian, khơng gây độc tế bào gan chuột
và tế bảo nội mơ người Dịch chiết CHV đã gây ảnh hưởng đáng kể đến sự chết
theo chương trình của tế bào qua con đường của ty thể và trì hỗn chu kỳ tế bào
bằng điều chỉnh protein liên quan đến chu kỳ tế bào trong tế bào MHCC97H mà
khơng ảnh hưởng đến các tế bào bình thường Do đĩ, dịch chiết CHV cĩ thể cĩ
triển vọng trong điều trị ung thư trên người mà khơng gây tác dụng phy [87]
1.1.3 Sâm Ngọc linh sinh khối
1.1.3.1 Nguồn gốc và đặc điểm nguyên liệu
Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) là khối sâm được tạo ra bởi cơng nghệ sinh khối tế bào thực vật Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuơi cấy và tạo khối lượng lớn tế bào thực vật trong mơi trường dinh dưỡng phù hợp mà khơng
cần thâm canh gieo trồng Các tế bào nuơi cấy vẫn giữ nguyên được các đặc tính vốn cĩ ban dau, đặc biệt là các hoạt chất hay các chất chuyển hĩa thứ cấp sinh ra
Trang 28Học viện Quân y đã ứng dụng thành cơng cơng nghệ sinh khối tế bào thực vật tạo khối tế bào sâm Ngọc linh từ rễ sâm Ngọc Linh tự nhiên, qui mơ 100 lit/mé (0,75kg khơ/mẻ) Bằng cơng nghệ này, nguyên liệu sâm NLSK tạo ra ồn
định, đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu và cĩ thể cung cấp cho cơng
nghiệp dược phẩm mà khơng phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết khí hậu và thời gian canh tác [I]
1.1.3.2 Thành phần hĩa học
Sâm NLSK tạo ra trên hệ thống nuơi cấy 100 lít/ mẻ cĩ hàm lượng hoạt
chất tương đối én định Trong đĩ, hàm lượng các ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd dat
trên 0,9% Đồng thời, sự tồn dư các chất kích thích sinh trưởng như I-NAA,
kinetin đều ở mức thấp Do vậy, sâm NLSK hồn tồn đủ tiêu chuẩn để làm
nguyên liệu cho sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng [1] 1.1.3.3 Tác dụng sinh học
- Kết quả nghiên cứu về tác dụng dược lý cho thấy sâm NLSK cĩ một số tác dụng sinh học sau:
+ Làm tăng thời gian bơi trong thử nghiệm chuột bơi kiệt sức, tăng thời gian bám trên trụ quay, tăng sức cơ trong thử nghiệm đo sức cơ chân chuột và khơng gây ảnh hưởng đến cân nặng chuột Tác dụng tốt trên quá trình nhận thức
và ghi nhớ, thể hiện qua đánh giá bằng mơ hình mê cung nước và mơ hình tránh
né chủ động trên chuột gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin Rút ngắn thời
gian hình thành và dập tắt phản xạ khi thử trên mơ hình mê lộ, gay hung phan,
tăng hoạt động [19]
+ Cĩ tác dụng bảo vệ gan: Làm giảm ALT và AST huyết tương, làm giảm
lượng MDA tạo ra ở gan, làm tăng lượng GSH trong gan, làm giảm khối lượng gan bị viêm và giảm tốn thương gan (trên cả hình ảnh đại thê và vi thể) trên
chuột nhắt trắng gây độc bằng CC1; [19]
Trang 29+ Chưa xác định được LDso của cao sâm NLSK trên chuột nhất trắng theo đường uống, mặc dù đã cho chuột uống sâm NLSK ở mức liều cao nhất cĩ thể
đưa vào dạ dày chuột nhất trắng (100g/kg) mà khơng gây chết một con chuột
nhất trắng nao [19]
+ Với liều 2g và 4g/kg/ 24 giờ của sâm NLSK khơ cho thỏ uống liên tục
trong thời gian 42 ngày, sâm NLSK khơng ảnh hưởng đến sự phát triển cân nặng
cơ thể và điện tim của thỏ, khơng độc với cơ quan tạo máu (hồng cầu,
hemoglobin, tiểu cầu, bạch cầu khơng thay đổi, khơng gây tổn thương lách) Khơng làm ảnh hưởng đến chức năng thận (nồng độ ure, creatinin ở mức bình
thường, khơng gây tốn thương thận) và chức năng gan (hoạt độ ALT, AST bình
thường, khơng gây tồn thương gan) [19]
1.2 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU VÀ PHUN SÁY
1.2.1 Kỹ thuật chiết xuất dược liệu
1.2.1.1 Khái niệm và phân loại
a Khái niệm về chiết xuất được liệu:
Hiểu theo nghĩa chung nhất thì chiết xuất là quá trình dùng dung mơi thích
hợp để hịa tan các chất tan cĩ trong dược liệu, chủ yếu là các hoạt chất cĩ tác
dụng điều trị, sau đĩ tách chúng ra khỏi phần khơng tan của được liệu [16] Sản
phẩm chiết xuất cĩ thể ở một trong ba dạng: (ï) dịch chiết tồn phần hay dịch chiết thơ (cao thuốc, cồn thuốc, rượu thuốc ); (1) các nhĩm hoạt chất chọn lọc
(alcaloid, flavonoid, phenolic, anthraquinon ); (iii) cac hop chất tỉnh khiết được
phân lập (Rutin, berberin, rotundin, artemirinin ) Tùy theo mục đích cụ thể mà quá trình chiết xuất tạo ra các sản phẩm ở một trong ba dạng nêu trên
b Một số thuật ngữ liên quan:
- Tỉ lệ dịch chiết: Là tỉ lệ giữa số lượng dược liệu sử dụng dé bao chế ra chế
Trang 30- Chất đánh dấu (Marker):
Là thành phần hoặc nhĩm các thành phần của một dược liệu, một chế phẩm
dược liệu hoặc một sản phẩm thuốc dược liệu, được dùng dé kiểm sốt độc lập
xem liệu các chất đĩ cĩ hoạt tính điều trị hay khơng Marker cịn dùng đề tính
tốn số lượng của các dược liệu hoặc các chế phẩm dược liệu trong các sản phẩm thuốc được liệu nếu như marker đã được định lượng trong dược liệu hoặc
các chế phẩm được liệu Cĩ hai loại marker: Marker sinh học là các thành phần
hoặc nhĩm thành phần cĩ hoạt tính điều trị Marker phân tích là thành phần hoặc nhĩm thành phan chỉ dùng với mục định phân tích [53], [54], [55]
- Cao định chuẩn: Một cao định chuẩn hay tiêu chuẩn (standardised extract) phải mơ tả được bản chất và nồng độ dung mơi sử dụng để chiết xuất, trạng thái vật lý của dịch chiết, số lượng tương đương của dược liệu dùng để bào
chế dịch chiết biểu thị bằng x-y hoặc tỷ lệ (a-b):1 của dược liệu dé bào chế với
số lượng của chế phẩm bào chế Hơn nữa, giới hạn hàm lượng của chất định lượng cũng phải được nêu rõ [53] Ví dụ cao khơ bào chế từ rễ nhân sâm (G115) ty 1é 5:1 (3-7:1), chtra 4% ginsenosid (tinh theo Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg, Rg2), dung mơi chiết xuất là ethanol 40% [56]
e Phân loại:
Cĩ nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất Với phương pháp chiết
xuất thơng thường bằng dung mơi dựa trên việc lựa chọn dung mơi kết hợp song
song với sử dụng nhiệt độ và khuấy trộn, phương pháp chiết xuất cĩ thể được
phân thành hai loại là phương pháp chiết lạnh (ngâm lạnh, ngắm kiệt ) và
phương pháp chiết nĩng (sắc, hầm, hãm, chiết soxhlct )
Ngồi các kỹ thuật chiết xuất thơng thường nêu trên, hiện nay nhiều kỹ
thuật mới đã được ứng dụng rộng rãi thể hiện tính ưu việt trong chiết xuất các
hợp chất tự nhiên ứng dụng trong nhiều ngành cơng nghiệp (dược phẩm, mỹ
Trang 31xuất lỏng siêu tới hạn, chiết xuất bằng dung mơi dưới áp lực cao [64] Trong đề tài luận án này tập trung giới thiệu vào các phương pháp chiết xuất hiện đại
1.2.1.2 Một số phương pháp chiết xuất hiện đại
a Chiết xuất cĩ tác động của siêu âm (Ultrasonication Assisted Extraction)
Chiết xuất cĩ sự tác động của siêu âm (UAE) là phương pháp ngâm cải tiền
với việc sử dụng sĩng siêu âm tần số cao giúp chiết xuất dễ dàng hơn Siêu âm
bao gồm các khu vực tần số giữa 18 kHz và 100 MHz, giới hạn trên khơng được
rõ nét Gần đây, một lượng lớn các hĩa chất và các quá trình cơng nghiệp dựa
vào siêu âm cường độ cao, ví dụ như làm sạch, làm tăng các phản ứng hĩa học, nhũ hĩa, khử khuẩn, đồng nhất hĩa, tăng khả năng hịa tan, chống kết tụ của
khối bột, phá vỡ các tế bảo sinh học, dùng trong chiết xuất, làm khơ, lọc, kết
tinh, đơng khơ [47] * Nguyên lý và cơ chế:
Sĩng âm thanh cĩ tần số cao hơn 20 kHz, là những rung động cơ học trong một chất lỏng, ran va khí Tác dụng cĩ lợi của sĩng âm trong chiết xuất được cho là do sự hình thành và sự sụp đồ khơng đối xứng của các tiểu bong bĩng (microcavities) trong vùng lân cận của thành tế bào tạo ra tia phản lực tốc độ cao của chất lỏng, phản lực này tác động mạnh mẽ trên bề mặt rắn Sự sụp đồ của các tiểu bong bĩng cĩ thể tạo ra các hiệu ứng vật lý, hĩa học và cơ học dẫn đến sự phá vỡ các màng sinh học để tạo điều kiện thuận lợi cho việc giải phĩng của
các hợp chất, làm tăng sự thâm nhập của dung mơi vào các nguyên liệu và làm
tăng chuyển khối Sự phá vỡ thành tế bào và tăng sự chuyển khối là hai yếu tố
chính dẫn đến việc tăng cường sử dụng lực siêu âm trong chiết xuất Ngồi phá
vỡ thành tế bảo và tăng sự chuyển khối, sĩng siêu âm cịn tác động làm cải thiện
tính thấm của dung mơi, làm tăng sự trương nở, khả ning mao dan va quá trình
Trang 32* Thiết bị chiết với sự tác động của sĩng siêu âm:
Trong số vài loại hệ thơng chiết bằng siêu âm hiện cĩ thì sử dụng phổ biến
nhất là bể siêu âm và thiết bị que siêu âm Cả hai hệ thống được dựa trên bộ
chuyển đổi điện từ (tức là thiết bị cĩ khả năng chuyên đổi năng lượng cơ học
hoặc điện thành âm thanh tần số cao) như là một nguồn năng lượng siêu âm, thường hoạt động ở một tan số cố định của 20kHz Trong đĩ, bể siêu âm được
ứng dụng trong rửa hoặc làm sạch dụng cụ Chiết siêu âm được áp dụng với loại
que siêu âm Loại thiết bị que siêu âm áp dụng để chiết xuất cho lực siêu âm cao hon gap 100 lần so với một bể rửa siêu âm, do đĩ nĩ cĩ hiệu quả tốt hơn nhiều
Một đặc trưng chính cho việc áp dụng thành cơng của que siêu âm chính là năng, lượng siêu âm được đưa trực tiếp vào hệ thống chiết Sơ đồ thiết kế que siêu âm
và bễ chiết siêu âm được thé hiện ở hình 3 [47]
Bộ chuyển đỏi May phat Siniial “veneers ena me
Phan dau chop
cĩ thẻ thay thê Vít điều
chỉnh Đầu siêu âm phia trên (cĩ định)
Hình 1.3 Thiết kế bình chiết sử dụng que siêu âm Nguơn: Theo Cooke M (2000) [47]
* Các thơng số chính cần xem xét khi chiết xuất bang siêu âm:
Bên cạnh sự đổi mới về cơng nghệ chiết xuất, thì độ tin cậy và khả năng lặp
lại của kết quả là một trong những mục tiêu chính khi nâng cấp qui mơ của bất
kỳ quá trình chiết xuất nào Trong trường hợp của UAE, cần phải xem xét ảnh
hưởng của các thơng số như: Cơng suất siêu âm, tần số sĩng siêu âm, nhiệt độ,
dung mơi, tỷ lệ dung méi/duge liệu, thời gian chiết, kích thước và cấu trúc
nguyên liệu Các thơng số này cho phép xác định điều kiện chiết xuất tối ưu, đồng thời cũng là yếu tố cần xem xét khi nâng cấp qui mơ chiết xuất Hơn nữa,
Trang 33hiệu suất cao nhất, mà cần xem xét đến cả chỉ phí và tiêu thụ nguồn năng lượng
Do đĩ, xác định các thơng số chiết xuất thích hợp là cần thiết đối với một qui
trình của UAE [52] Trong phần này, chỉ đề cập đến lực siêu âm và tần số siêu âm - là hai thơng số đặc trưng cho một thiết bị UAE Các thơng số khác sẽ được
đề cập ở Mục 1.2.1.3 (Các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất dược liệu)
- Lực siêu âm: Việc đo năng lượng âm thực tế áp dụng trong quá trình chiết
siêu âm là rất khĩ và thường khơng được báo cáo Đơi khi chỉ đề cập đến mức
cơng suất của thiết bị, ví dụ như chiết với cơng suất 20% so với tổng cơng suất điện, nên đây khơng phải là phép đo chính xác Trên thực tế, trong hầu hết các
thiết bị chiết siêu âm, cơng suất đo khơng tỷ lệ với cơng suất tiêu thụ, dẫn đến kết quả sai hoặc khơng chính xác Ngay cả khi biết chính xác cơng suất thực, thì
cũng rất khĩ đề đánh giá hiệu quả chiết xuất, vì hiệu quả qui trình cịn phụ thuộc
vào các yếu tố khác như: Hình dạng bể siêu âm hay thẻ tích của bình chiết
(thường khơng được nêu ở các báo cáo khoa học) Hiệu suất chiết xuất thường
tăng theo cường độ lực tác động, đơi khi là tuyến tính Tuy nhiên, lực siêu âm khơng chỉ ảnh hưởng đến tơng lượng chiết xuất, mà cĩ thẻ ảnh hưởng khác nhau đến từng chất chiết Ví dụ như khi chiết xuất polysaccharid từ lá chè, tăng cơng suất từ 100 lên 300W, làm giảm tỷ lệ polysaccharid trung tính, nhưng khơng ảnh
hưởng đến polysaccharid tổng hoặc các chất cĩ tính acid Như vậy, lực siêu âm
cĩ thể ảnh hưởng đến chiết xuất, khơng chỉ làm tăng hiệu suất chiết trong thời
gian ngắn, mà trong một số trường hợp là cả sản phẩm cuối cùng Do đĩ, các
nhà nghiên cứu hoặc thiết kế cần đánh giá đặc tính của thiết bị để đảm bảo tính
lặp lại của kết quả khi thực hiện trên các thiết bị khác nhau hoặc kiểm tra cơng
suất siêu âm áp dụng [52]
- Tần số siêu âm: Tần số siêu âm càng thấp thì “bong bĩng” tạo thành càng lớn Do vậy, ở cùng cường độ siêu âm thì tần số siêu âm thấp hơn sẽ tạo được lực tác động lớn hơn, đo phản lực sinh ra từ sự sụp đồ của các bong bĩng tăng
Trang 34sự hình thành và sụp đỗ của các bong bĩng để tạo thành vi phản lực cao, mà nĩ
cịn ảnh hưởng đến quá trình chuyển khối (như đã trình bày ở phần nguyên lý) Tuy nhiên, cĩ rất ít nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của tần số siêu âm đến chiết
xuất Như Ma và cs quan sát thấy với cùng cơng suất áp dụng, tần số tốt nhất
cho việc chiét xuat hesperidin tir v6 quyt (Citrus reticulata) là 60 kHz, thay vì 20 hoặc 100 kHz Hoặc theo Dong và cs thì hiệu suất chiết acid salvianolic B từ
rễ cây Đan sâm ở tần số siêu âm khác nhau (28, 45 va 100 kHz), thì hiệu suất chiết ở tần số cao là thấp hơn ở tần số thấp [52] Như vậy, tần số siêu âm cĩ thể
ảnh hưởng đến hiệu suất và động học quá trình chiết xuất Tuy nhiên, sự ảnh hưởng này cịn phụ thuộc vào tính chất của nguyên liệu Tần số nhỏ cĩ thể làm tăng hiệu suất (như làm tăng khoảng 32% khi chiết pyrethrin từ hoa cây
pyrethrum), hoặc rất ít ảnh hưởng đến hiệu suất (như chiết dau từ hạt cải) Mặt
khác, sự phân bố sĩng siêu âm bên trong thiết bị chiết cũng là một đặc điểm quan trọng trong việc thiết kế bể siêu âm Cường độ siêu âm mạnh nhất là ở vùng lân cận của đầu phát siêu âm, càng xa thì cường độ siêu âm càng giảm, đặc
biệt là khi cĩ mặt của các tiểu phân dược liệu rắn [143]
* Ưu và nhược điểm của chiết xuất bằng sĩng siêu âm:
Chiết xuất với sự trợ giúp của siêu âm thể hiện sự hiệu quả, đơn giản và ít
tốn kém so với các kỹ thuật chiết xuất thơng thường Ưu điểm chính của phương
pháp này là làm tăng khối lượng chiết xuất và động học của quá trình chiết xuất
cũng nhanh hơn nên rút ngắn được thời gian chiết xuất Siêu âm cũng cĩ thể làm
giảm nhiệt độ chiết xuất, cho phép chiết xuất các hợp chất kém bền với nhiệt So
với chiết xuất bằng vi sĩng và siêu tới hạn thì thiết bị chiết siêu âm rẻ hơn và
tiến hành dễ dàng hơn Hơn nữa, các dung mơi sử dụng trong chiết xuất siêu âm
cũng giống như chiết soxhlet, cĩ thể sử dụng nhiều loại dung mơi dé chiết xuất
một khoảng rộng các hoạt chất [143]
Trang 35một pha phân tán gĩp phần vào sự suy giảm sĩng siêu âm và phần hoạt động của siêu âm bên trong bình chiết được giới hạn trong khu vực phát ra siêu âm [143]
* Một số ứng dụng của chiết xuất bằng siêu âm:
Siêu âm đã được áp dụng quy ở cả mơ nhỏ và cơng nghiệp trong chiết xuất
các hợp chất từ tự nhiên đối với một khoảng rộng các dịch chiết được liệu và các
nhĩm hoạt chất như dầu béo, protein, saponin, antraquinon, phenolic, flavonoid, polysaccharid, acid hữu cơ, các chất màu thực vật [140] Mười hai thí nghiệm
với các dược liệu khác nhau được thực hiện ở qui mơ cơng nghiệp với phương pháp ngâm trong 28 ngày kết hợp khuấy trộn liên tục trong cthanol ở 45°C cho
hiệu suất chiết tương đương khi chiết bằng siêu âm trong 6h [141] Siêu âm được ứng dụng phổ biến để chiết các ginsenosid từ nhân sâm So với phương pháp chiết soxhlet, chiết siêu âm cĩ thể rút ngắn thời gian chiết xuất (khoảng 3 lần), hơn nữa phương pháp này cho phép chiết ở nhiệt độ thấp, là yếu tố làm hạn
chế sự giáng hĩa của một số ginsenosid khi chiết ở nhiệt độ cao Chiết
ginsenosid bang siêu âm (bể hay đầu đị) trong 2 giờ cho hiệu suất cao hơn khi
chiết soxhlet ở nhiệt độ sơi trong 8 giờ [152] Khi chiết xuất anthraquinon từ rễ
nhàu bằng siêu âm với hỗn hợp ethanol - nước làm giảm 75% thời gian chiết xuất khi so sánh với phương pháp khơng dùng siêu âm Trong cả cơng nghiệp
thực phẩm và dược phẩm, siêu âm đã được ứng dụng để chiết các hợp chất
polyphenol và carotenoid bằng nước và các dung mơi khác, làm tăng khối lượng
chiết xuất trong khoảng từ 6 đến 35% [140]
Lee M H và cs nghiên cứu chiết xuất isoflavon chính từ sắn đây (Pueraria lobata), áp dụng ba phương pháp là chiết xuất truyền thống, chiết bằng dung
mơi ở áp suất cao và chiết siêu âm Kết quả cho thấy, chiết isoflavon bằng siêu
âm cĩ năng suất cao hơn hai phương pháp cịn lại, làm giảm dung mơi tiêu thụ,
Trang 36với nhiệt, trong khi phương pháp siêu âm thích hợp dé chiết xuất lượng lớn cho
các dịch chiết khơng bên với nhiệt [84]
b Chiết xuất bằng vi sĩng (Microwave - assisted Extraction)
Chiết xuất dưới hỗ trợ của vi sĩng (MAE) là một phương pháp mới, thể
hiện tính ưu việt hơn so với các phương pháp chiết truyền thống MAE là
phương pháp chiết xuất rất hấp dẫn do tốc độ chiết xuất nhanh, lượng dung mơi sử dụng nhỏ, chỉ phí thấp và thân thiện với mơi trường [47], [64]
* Nguyên lý và cơ chế:
Vi sĩng là sĩng điện từ tần số cao được đặt giữa tần số vơ tuyến điện và các
vùng hồng ngoại của quang phơ điện từ (Tần số trong khoảng 0,3 - 300GHz) Vi sĩng được truyền đi như sĩng, cĩ thể xuyên qua các vật liệu sinh học và tương tác với các phân tử cĩ cực như nước trong vật liệu sinh học để tạo ra nhiệt Do đĩ, vi sĩng cĩ thể làm nĩng một vật liệu cùng lúc với sự thâm nhập của nĩ
MAE cung cấp nhiệt lượng nhanh đến tồn bộ dung mơi và khối nguyên liệu rắn với hiệu quả cao và đồng nhất Nước trong các cau trúc nguyên liệu cũng gĩp
phần hấp thụ nhiệt lượng từ vi sĩng [47], [64] [73], [143]
Năng lượng vi sĩng ảnh hưởng đến các phân tử bởi truyền dẫn ion và sự
quay lưỡng cực Trong truyền dẫn ion, các ion trong dung dịch sẽ di chuyển khi
một trường điện từ được áp dụng Sự quay lưỡng cực cĩ nghĩa là sắp xếp lại các
lưỡng cực với trường điện từ áp dụng Ở 2,45 GHz, lưỡng cực sắp xếp thắng và
ngẫu nhiên là 4,9 x 10” lần/ giây Điều nay đã cưỡng bức sự di chuyền của các
phân tử gây ra ma sát phân tử và do đĩ làm nĩng dung dịch [47], [73]
* Thiết bị chiết xuất vi sĩng:
Hiện nay, cĩ hai loại hệ thống MAE chính: (¡) Loại cĩ bể vi sĩng tập trung
hay bể chiết vi sĩng chuẩn hoạt động ở áp suất khí quyền; (ii) Loại cĩ bễ chiết
kín cĩ khả năng kiểm sốt về nhiệt độ và áp suất trong quá trình chiết Loại hệ
thống MAE kín thường sử dụng để chiết xuất ở trong các điều kiện nhiệt độ cao
Trang 37mơi Loại hệ thống MAE tập trung cĩ thể hoạt động ở nhiệt độ cao nhất xác định
bởi điểm sơi của dung mơi ở áp suất khí quyén [47], [64], [143]
* Ưu và nhược điểm của chiết xuất bằng vi sĩng:
Chiết xuất bằng vi sĩng là một phương pháp mới, cĩ khả năng chiết xuất
rất nhanh, lượng dung tiêu thụ ít hơn so với chiết soxhlet và siêu âm (30ml trong
MAE so với 300 - 500 ml trong chiết soxhlet); Cải thiện năng suất và hiệu quả
chiết xuất khi so sánh với các kỹ thuật chiết xuất hiện đại khác như chiết siêu
âm, chiết siêu tới hạn, chiết áp suất cao Nĩ cho phép kiểm sốt các thơng số
chiết xuất (thời gian, nhiệt độ và lực tác động) và cĩ thể khuấy trộn khi chiết xuất MAE là kỹ thuật thân thiện với mơi trường, khi thực hiện trong thiết bị kín cĩ thể kiểm sốt tốt dung mơi chiết và cĩ chế độ an tồn khi cĩ bất kỳ sự dị rỉ
dung mơi trong quá trình chiết xuất Tuy nhiên, MAE cĩ một số hạn chế như:
Cần phải sử dụng các dung mơi phân cực, cĩ thể ít hiệu quả dé chiết xuất các
hoạt chất hoặc các dung mơi khơng phân cực hay dễ bay hơi Làm sạch hay loại
tạp dịch chiết là cần thiết vì phương pháp này cĩ hiệu quả chiết rất cao đối với
cả hoạt chất và tạp chất, thiết bị chiết vi sĩng tương đối đắt tiền [47], [143]
* Một số ứng dụng của MAE:
Từ những ưu điểm vượt trội mà MAE được ứng dung rộng rãi trong chiết xuất được liệu Một số ứng dụng tiêu biểu được trình bay 6 bang 1.1 [96]
Bảng 1.1 Một số ứng dụng của MAE trong chiết xuất dược liệu
Nguyên liệu Chất chiết Dung mơi Thời gian
Ré Cam thao Acid glycyrrhizic Ethanol (50-60%) | 4-5 phút
Rễ cây Nghệ Curcumol, curdion và germacron Nước 4 phút
Lá chè xanh Polyphenol va caffein Ethanol 50% 4 phút Rễ Nhân sâm Ginsenosid Ethanol 15 phút Lá Thơng đỏ Paclitaxel Methanol 90% 15 phút Ré Nhau Anthraquinon Ethanol 80% 15 phút
c Phương pháp chiết xuất lỏng siêu tới hạn
* Trạng thải siêu tới hạn:
Đối với một chất ở điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trong ba
Trang 38nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hĩa lỏng Tuy nhiên, cĩ một giá
trị áp suất mà ở đĩ, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng khơng trở về
trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical) Hay nĩi cách khác, trạng thái siêu tới hạn đạt được khi nhiệt độ và áp suất của một chất được nâng lên trên giá trị tới hạn của nĩ Ở điều kiện thích hợp, mọi chất lỏng cĩ thể đạt được trạng thái siêu tới hạn Tuy nhiên,
chỉ những chất cĩ nhiệt độ tới hạn khơng cao quá so với nhiệt độ mơi trường
mới được sử dụng làm dung mơi siêu tới hạn Trong đĩ, CO; cĩ nhiệt độ tới hạn là 31,06°C và áp suất tới hạn là 73,81bar, được sử dụng phổ biến nhất làm dung
mơi siêu tới hạn [65], [97], [143] Hình 1.4 biểu diễn trạng thái của các chất theo
nhiệt độ và áp suất
Hình 1.4 Đồ thị biễu diễn trạng thái của các chất
(Điểm ba pha (Pạ, Tị); Điểm toi han (Pc, Te) * Nguyên lý và quy trình chiết xuất siêu tới hạn:
Trong quá trình siêu tới hạn, nguyên liệu được nạp vào trong bình chiết
(một hoặc nhiều bình) Dung mơi (như CO; lỏng) từ bình chứa được làm lạnh sau đĩ nén dưới áp suất cao bằng bơm cao áp, sau đĩ CO; được dẫn qua thiết bị
làm nĩng để chuyền thành trạng thái tiền siêu tới hạn trước khi vào bình chiết Bình chiết được kiểm sốt về nhiệt độ và áp suất để đạt được trạng thái siêu tới
Trang 39tính hịa tan do vậy chất chiết sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp, lắng xuống đưới và được lấy ra ngồi CO; ở thể khí được chuyển tiếp qua bình ngưng, tại bình ngưng CO; được làm lạnh và nén dưới áp lực cao để chuyên CO; sang thể lỏng,
sau đĩ tuần hồn trở lại hệ thống và quá trình chiết xuất tiếp tục Một số hệ thống chiết xuất quy mơ phịng thí nghiệm khơng cĩ hệ thống tuần hồn dung
mơi, khi đĩ CO; ở thể khí được thốt ra mơi trường [65], [97], [143]
* Ưu điểm:
- Trạng thái siêu tới hạn cĩ khả năng hịa tan tương tự như dung mơi hữu
cơ nhưng khuếch tán nhanh hơn, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp hơn Đặc tính hịa tan của một chất lỏng siêu tới hạn dễ kiểm sốt hơn vì nĩ phụ thuộc vào
điều kiện nhiệt độ và áp suất Cĩ thể dễ dàng và nhanh chĩng điều chỉnh nhiệt độ và áp suất của bình chiết và bình tách để chiết và tách phân đoạn các chất
Khi thêm các đồng dung mơi (như methanol, ethanol ) cĩ thể thay đổi độ phân
cực của dung mơi để tăng tính chọn lọc tách chiết các chất nên cĩ thể chiết được
cả các nhĩm chất cĩ tính phân cực hơn như flavonoid, alcaloid Trong qui trình
cơng nghiệp liên quan đến thuốc hoặc thực phâm, khơng phải lo lắng vi tổn dư
của dung mơi Chất sử dụng thơng thường nhất là CO; cĩ đặc tính trơ, tỉnh khiết,
rẻ tiền, khơng tự kích nỗ, khơng bắt lửa và duy trì sự cháy, ít độc với co thé,
khơng ăn mịn thiết bị CO; cĩ thể được thu hồi nên chỉ phí sản xuất thấp Sản
phẩm thu được tỉnh khiết, ít bị phân hủy và biến đổi đo trạng thái siêu tới hạn
đạt được ở nhiệt độ và áp suất thấp [143]
* Nhược điểm: Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền Khơng thích hợp với mẫu
chiết ở thể lỏng Chỉ thích hợp để chiết các hợp chất ít phân cực Khĩ lường
được khi dùng hỗn hợp dung mơi
* Mot số ứng dụng của chiết xuất siêu tới hạn:
Từ những ưu điểm trên nên phương pháp chiết siêu tới hạn được áp dụng
rộng rãi dé chiết tách dầu béo, tinh đầu, hương liệu, chat màu, chất béo, các hoạt
Trang 40paclitaxel ) [65], [97], [143] Ngồi ra, phương pháp này cũng áp dụng dé chiết
loại các thành phần khơng mong muốn ra khỏi nguyên liệu như loại cafein ra hạt cà phê, loại các chất kích thích sinh trưởng, chất bảo quản, thuốc trừ sâu trong
thực phẩm, loại các chất béo trong dược liệu
1.2.1.3 Một số yếu tố ánh hưởng đến chiết xuất dược liệu
Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu, dưới đây là
những yếu tố cĩ thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, nhằm
điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất, bao gồm: a Độ mịn của dược liệu:
Bột dược liệu thơ làm dung mơi khĩ thám ướt dược liệu nên khĩ chiết kiệt
hoạt chất Khi giảm kích thước được liệu, làm tăng diện tích tiếp xúc giữa dung mơi và dược liệu nên tăng hiệu suất và rút ngắn thời gian chiết Tuy nhiên, trong
thực tế, nếu dược liệu quá mịn sẽ gây ra một số bắt lợi khi chiết xuất như: Bột
dược liệu bị dính bết vào nhau khi cĩ mặt dung mơi, tạo thành dạng bột nhão, vĩn cục nên khĩ khuấy trộn hoặc khĩ rút dịch chiết khi chiết xuất bằng các phương pháp thơng thường như ngâm hay ngắm kiệt Khi bột dược liệu quá mịn,
nhiều tế bào thực vật bị phá huỷ, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp nên gây khĩ khăn
cho quá trình tỉnh chế và bảo quản Do vậy, cần phải lựa chọn độ mịn của được
liệu thích hợp, tuỳ thuộc vào bản chất dược liệu, dung mơi và phương pháp chiết
xuất Đối với trường hợp dùng loại dung mơi dễ hịa tan nhiều tạp, nên tránh xay dược liệu quá mịn Đối với trường hợp chiết xuất ở nhiệt độ cao, cũng nên tránh xay dược liệu quá mịn để tránh đưa nhiều tạp vào dịch chiết
b Dung mơi và tỷ lệ dung mơi/ dược liệu:
Chiết xuất là bước đầu tiên và quan trọng để phân tách và lựa chọn được
các thành phần hoạt chất mong muốn từ dược liệu, sau đĩ là tinh chế và phân lập chúng Việc lựa chọn dung mơi thích hợp khi chiết xuất cĩ vai trị quan trọng,