Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin b

ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ những năm 60 của thế kỉ trước, A. D. Bangham và cộng sự đã phát h và bào chế ra liposome. Cho đến nay liposome được nghiên cứu rất nhiều như m hệ mang thuốc trong công nghệ dược phẩm do nó có rất nhiều ưu điểm như: tươ thích sinh học; có thể mang dược chất thân nước trong khoang nước, dược chất th dầu trong vỏ; có thể mang dược chất đến tế bào đích, thậm chí là nội bào; k thước, điện tích bề mặt có thể thay đổi dễ dàng bằng cách thêm một số thành ph vào trong vỏ…Mục tiêu của các nghiên cứu này là nhằm tìm ra những dạ liposome mang đặc tính mới phù hợp với từng loại dược chất mà nó vận chuy Kết quả là ngày nay trên thế giới nhiều chế phẩm liposome đã được ứng dụng tro lâm sàng như Daunosome ® , Lipodox ® , Lipoplatin ® , Ambisome ® . Amphotericin B là một dược chất thân dầu được chỉ định trong trường h nhiễm nấm nặng toàn thân (đặc biệt ở người suy giảm miễn dịch) do hoạt t kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng. Tuy nhiên thuốc rất kém tan trong nước n sinh khả dụng đường uống rất thấp, thải trừ rất chậm qua thận, gây tích lũy thuốc đó AMB gây độc cao với thận. Hiện nay, việc sử dụng liposome làm chất mang l tăng sinh khả dụng và thời gian tuần hoàn trong máu của AMB do đó mang nhiều lợi ích trong việc hạn chế độc tính và tăng hiệu quả điều trị. Một số ngh cứu trước đây tại trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu kỹ th bào chế liposome AMB bằng các phương pháp khác nhau như: hydrat hóa fi tiêm ethanol. Tuy nhiên độ ổn định của liposome vẫn là mối quan tâm lớn do thay đổi KTTP, phân bố KTTP, hàm lượng thuốc và sự kết tụ có thể xảy ra khi b quản trong thời gian dài. Chính vì vậy trên cơ sở các kết quả nghiên cứu bào trước đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông k liposome Amphotericin B” nhằm mục tiêu: 1. Bào chế và làm giảm KTTP liposome AMB. 2. Xây dựng công thức và quy trình đông khô liposome AMB. 3. Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB đông khô.

HÀ NỘI - 2015

Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Thị Hải Yến đã tận

tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận Dưới sự hướng

dẫn của cô, em đã học hỏi được rất nhiều điều bổ ích

Em cũng chân thành cám ơn PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ, ThS Nguyễn

Tuấn Quang, ThS Nguyễn Văn Lâm Sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của các

thầy cô đã giúp em có điều kiện hoàn thành khóa luận một cách thuận lợi nhất

Trong quá trình làm thực nghiệm và nghiên cứu, em cũng nhận được sự giúp

đỡ và tạo điều kiện của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Bào

Chế Em xin cám ơn những sự giúp đỡ quý báu này

Cuối cùng em xin cám ơn gia đình và bạn bè đã động viên, luôn bên cạnh em

trong suốt quá trình nghiên cứu và học tập

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Nho Đán

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Amphotericin B 2

1.1.1 Nguồn gốc 2

1.1.2 Công thức hóa học 2

1.1.3 Đặc tính lý hóa 2

1.1.4 Tác dụng dược lý 3

1.1.5 Dược động học 3

1.1.6 Chỉ định 3

1.1.7 Liều dùng 3

1.1.8 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 4

1.2 Liposome 4

1.2.1 Khái niệm 4

1.2.2 Thành phần của liposome 4

1.2.2.1 Vỏ liposome 4

1.2.2.2 Dược chất 5

1.2.3 Ưu, nhược điểm 6

1.2.3.1 Ưu điểm 6

1.2.3.2 Nhược điểm 6

1.2.4 Độ ổn định 6

1.2.5 Bào chế liposome 7

1.2.5.1 Các phương pháp bào chế liposome 7

1.2.5.2 Bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa film 7

1.3.1 Khái niệm và ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 9

1.3.2 Một số khái niệm khác 10

1.3.3 Các giai đoạn của quá trình đông khô 10

1.3.3.1 Giai đoạn đông lạnh 10

1.3.3.1 Giai đoạn làm khô sơ cấp 12

1.3.3.2 Giai đoạn làm khô thứ cấp 12

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng liposome đông khô 13

1.3.4.1 Yếu tố thuộc về công thức 13

1.3.4.2 Yếu tố thuộc về kỹ thuật: 14

1.4 Các nghiên cứu về L-AMB và đông khô L-AMB 15

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 15

1.4.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp bào chế L-AMB 18

2.3.1.1 Công thức bào chế 18

2.3.1.2 Qui trình bào chế 18

2.3.1.3 Khảo sát phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP 19

2.3.2 Phương pháp đông khô L-AMB 20

2.3.2.1 Quy trình bào chế L-AMB đông khô: 20

2.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của L-AMB và L-AMB đông

khô ……… 21

2.3.3.1 Đánh giá L-AMB 21

2.3.3.2 Đánh giá L-AMB đông khô 21

2.4 Điều kiện thí nghiệm 23

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả bào chế L-AMB bằng phương pháp hydrat hóa film và khảo sát các phương pháp làm giảm KTTP 24

3.1.1 Kết quả liposome thu được sau khi hydrat hóa 24

3.1.2 Khảo sát các phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP 25

3.1.2.1 Phương pháp đùn qua màng 25

3.1.2.2 Phương pháp siêu âm 26

3.1.2.3 Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng 28

3.2 Kết quả bào chế L-AMB đông khô 32

3.2.1 Khảo sát tác dụng của tá dược bảo vệ trong quá trình đông lạnh 32

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược saccarose trong quá trình đông khô ……… 34

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố kỹ thuật 35

3.2.3 Quy trình bào chế L-AMB đông khô 37

3.2.4 Đánh giá lại một số đặc tính của L- AMB đông khô 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

13 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

Bảng 1.1 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 4

Bảng 3.1 KTTP và phân bố KTTP của các mẫu L-AMB sau khi hydrat

Bảng 3.3 KTTP, phân bố KTTP sau các khoảng thời gian siêu âm 30

Bảng 3.6 KTTP, phân bố KTTP dưới áp suất đồng nhất hóa khác nhau 28

Bảng 3.8 KTTP, phân bố KTTP sau các lần đùn qua màng 400 nm

Bảng 3.9 KTTP và phân bố KTTP của mẫu chứa saccarose sau khi rã

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát nhiệt độ quá trình làm khô sơ cấp 36

Hình 1.1 Thiết bị đồng nhất hóa và đùn áp suất cao 9

Hình 3.1

Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) và sau khi làm giảm

KTTP bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp

với đùn qua màng (b)

31

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP thu được từ các

Hình 3.4 Bánh đông khô có mặt 1% (a) và 2% (b) glycerin (kl/tt) 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kể từ những năm 60 của thế kỉ trước, A D Bangham và cộng sự đã phát hiện

và bào chế ra liposome Cho đến nay liposome được nghiên cứu rất nhiều như một

hệ mang thuốc trong công nghệ dược phẩm do nó có rất nhiều ưu điểm như: tương thích sinh học; có thể mang dược chất thân nước trong khoang nước, dược chất thân dầu trong vỏ; có thể mang dược chất đến tế bào đích, thậm chí là nội bào; kích thước, điện tích bề mặt có thể thay đổi dễ dàng bằng cách thêm một số thành phần vào trong vỏ…Mục tiêu của các nghiên cứu này là nhằm tìm ra những dạng liposome mang đặc tính mới phù hợp với từng loại dược chất mà nó vận chuyển Kết quả là ngày nay trên thế giới nhiều chế phẩm liposome đã được ứng dụng trong lâm sàng như Daunosome®, Lipodox®, Lipoplatin®, Ambisome®

Amphotericin B là một dược chất thân dầu được chỉ định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân (đặc biệt ở người suy giảm miễn dịch) do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng Tuy nhiên thuốc rất kém tan trong nước nên sinh khả dụng đường uống rất thấp, thải trừ rất chậm qua thận, gây tích lũy thuốc do

đó AMB gây độc cao với thận Hiện nay, việc sử dụng liposome làm chất mang làm tăng sinh khả dụng và thời gian tuần hoàn trong máu của AMB do đó mang lại nhiều lợi ích trong việc hạn chế độc tính và tăng hiệu quả điều trị Một số nghiên cứu trước đây tại trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật bào chế liposome AMB bằng các phương pháp khác nhau như: hydrat hóa film, tiêm ethanol Tuy nhiên độ ổn định của liposome vẫn là mối quan tâm lớn do sự thay đổi KTTP, phân bố KTTP, hàm lượng thuốc và sự kết tụ có thể xảy ra khi bảo quản trong thời gian dài Chính vì vậy trên cơ sở các kết quả nghiên cứu bào chế

trước đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô

liposome Amphotericin B” nhằm mục tiêu:

1 Bào chế và làm giảm KTTP liposome AMB

2 Xây dựng công thức và quy trình đông khô liposome AMB

3 Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB đông khô.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Amphotericin B

1.1.1 Nguồn gốc

Amphotericin B là một hỗn hợp của polyenes kháng nấm sản xuất bởi sự tăng

trưởng của một số chủng Streptomyces nodosus, bao gồm chủ yếu là

(1R,3S,5R,6R,9R,11R,15S,16R,17R,18S,19E,21E,23E,25E,27E,29E,

31E,33R,35S,36R,37S)-33-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-D-mannopyranosyl) oxy] -1,3, 5,6,9,11,17,37-octahydroxy-15,16,18-trimethyl-13-oxo-14,39-dioxabicyclo [33.3.1] nonatriaconta-19,21,23,25,27,29,31 - heptaene-36-carboxylic acid Hàm lượng không nhỏ hơn 750 IU/mg, tính theo chất khô [10]

1.1.2 Công thức hóa học

Công thức phân tử: C47H73NO17 Khối lượng phân tử: 924 [10]

1.1.3 Đặc tính lý hóa

* Lý tính:

- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [2], [10]

- Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong dimethyl sulphoxide và trong propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong methanol, thực tế không tan trong cồn [10]

* Hóa tính: Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin

và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:

- Dung dịch AMB trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm Tỷ lệ

độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với

405 nm là 0,87-0,93 [2]

1.1.4 Tác dụng dược lý

Amphotericin B là một kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là ergosterol) ở màng tế bào nấm làm biến đổi tính thấm của màng AMB cũng gắn với sterol ở màng tế bào chất của người (chủ yếu cholesterol) nên giải thích được một phần độc tính của thuốc đối với người [3]

1.1.5 Dược động học

Dược động học của AMB thay đổi đáng kể phụ thuộc vào dạng dùng như AMB quy ước (micell), phức amphotericin sulfate cholesteryl, phức AMB lipid hoặc liposome AMB

- Hấp thu: AMB không hấp thu được qua đường tiêu hóa và phải được dùng đường tiêm

- Phân bố: Hơn 90% thuốc gắn kết với protein huyết tương, chủ yếu là lipoprotein Thông tin về phân bố của AMB còn hạn chế Để đạt được nồng độ trong dịch não tủy có tác dụng kìm nấm, AMB phải được tiêm thường xuyên vào trong vỏ não Thuốc qua được nhau thai

- Chuyển hóa: Chưa được làm rõ

- Thải trừ: AMB được thải trừ rất chậm qua thận Thời gian bán thải của liposome AMB là 100-153 giờ [9]

1.1.6 Chỉ định

- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida albicans

ở miệng và đường tiêu hóa

- Thuốc tiêm tĩnh mạch AMB thông thường dùng điều trị nhiễm khuẩn nấm toàn thân do nấm Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioidesimmitis, Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum

- Dạng liposome hoặc phức hợp với lipid: chỉ định cho những trường hợp đã điều trị bằng AMB thông thường mà bị thất bại hoặc những trường hợp mà AMB thông thường có thể gây độc cho thận hoặc suy thận [3]

1.1.7 Liều dùng

* Đường tiêm tĩnh mạch:

- AMB thông thường: từ liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cách 1 ngày

- AMB dạng liposome: từ liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4 mg/kg/ngày

- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày [3]

1.1.8 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường

Bảng 1.1 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường

TT Tên chế

phẩm

Hàm lượng Thành phần

Dạng cấu trúc

Dạng bào chế

1 Fungizone 50 mg AMB với natri

Bột đông khô

2 Abelcet 100 mg/

20 ml

DMPC:DMPG:AMB (tỷ lệ mol 7:3:10)

Phức hợp lipid

Bột đông khô

4 Ambisome 50 mg HSPC:DSPG:Chol:AMB

(tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4) Liposome

Bột đông khô

1.2 Liposome

1.2.1 Khái niệm

Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1], [8]

1.2.2 Thành phần của liposome

1.2.2.1 Vỏ liposome

Vỏ liposome gồm 2 thành phần chính là phospholipid và cholesterol:

* Phospholipid: Phospholipid sử dụng trong liposome AMB bao gồm

distearoylphosphatidylglycerol (DSPG)

HSPC có các ưu điểm sau: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu nành chưa hydrogen hóa do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa no, giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ DC [8]

DSPG ngoài vai trò tham gia tạo thành lớp lipid kép, còn đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành của liposome AMB theo cơ chế sau: Trong khoảng

pH trung tính, AMB tồn tại ở dạng lưỡng cực còn DSPG có một nhóm phosphate bị ion hóa nên phân tử tích điện âm Khi hòa tan trong một dung môi pH khoảng từ 1,0 đến 3,0 các phân tử DSPG nhận thêm một proton và tạo thành một phân tử trung hòa về điện tích Khi AMB thêm vào dung dịch acid hóa trên, các proton của nhóm phosphate sẽ được chuyển cho các nhóm amin của AMB Kết quả là AMB sẽ tích điện dương còn DSPG mang điện tích âm Do sự tích điện trái dấu, các phân tử hút nhau tạo thành một cặp ion Như vậy, sự hấp dẫn phân tử giữa AMB và DSPG được tăng lên rất nhiều [21]

* Cholesterol

Cholesterol lấp vào các khoang của phospholipid kép làm tăng độ vững chắc cho màng liposome [7] Ngoài ra, trong liposome AMB, cholesterol có ái lực tốt với AMB nên tạo liên kết với AMB góp phần đưa DC vào pha dầu của cấu trúc liposome, giúp ổn định cấu trúc này, hạn chế rò rỉ DC và giúp liposome vận chuyển AMB tới đích tác dụng [21]

1.2.2.2 Dược chất

- DC được dùng trong bào chế các dạng thuốc liposome khá đa dạng, thường là các DC cần tập trung tại đích, các DC khó thấm như DC điều trị ung thư, một số kháng sinh, enzyme,… DC có thể được gắn vào liposome theo một trong hai cách là gắn thụ động (thực hiện trong quá trình tạo liposome) hoặc gắn chủ động (thực hiện sau khi đã hình thành liposome) [7]

- Một số liposome còn sử dụng các chất khác làm thay đổi đặc tính của vỏ liposome như các polyme thân nước (kéo dài thời gian tuần hoàn), các chất diện hoạt (để tăng tính thấm qua da),…

- AMB được gắn chủ động vào liposome trong quá trình tạo thành liposome bởi sự hình thành các liên kết tĩnh điện với DSPG và liên kết với cholesterol trong thành phần vỏ phospholipid

1.2.3 Ưu, nhược điểm

1.2.3.1 Ưu điểm

- Liposome có thành phần cấu tạo và tính chất lí hóa tương tự màng sinh học Do đó

được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao [32]

- Có thể mang được cả DC thân dầu và thân nước [8], [32]

- Có tác dụng bảo vệ DC; kéo dài tác dụng của thuốc [7]

- Giảm độc tính của thuốc [25]

- Có thể vận chuyển thuốc tới tế bào đích, thậm chí là nội bào [7], [8], [32]

1.2.3.2 Nhược điểm

- Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về vật lí, hóa học và sinh học [28]

- Nguyên liệu phải có độ tinh khiết cao, đắt nên giá thành chế phẩm cao [1]

- Các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng và môi trường [28]

- Hầu hết các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [28]

1.2.4 Độ ổn định

Trong quá trình bảo quản, liposome không bền cả về vật lý và hóa học

- Về hóa học: Sự kém ổn định là do quá trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của

phân tử phospholipid và quá trình thủy phân liên kết ester của phospholipid tạo ra các lysophospholipid [16]

- Về vật lý: Sự kém ổn định là do quá trình thấm thuốc qua màng và sự có mặt của

các thành phần tích điện trên bề mặt gây hiện tượng kết tụ tiểu phân [16] Sự ổn định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số PDI, sự tích điện bề mặt, tính vững chắc của lớp màng kép, sự rò rỉ của DC qua màng

Vì vậy, bào chế liposome ở dạng bột đông khô là hướng nghiên cứu để kéo dài tuổi thọ của chế phẩm

1.2.5 Bào chế liposome

1.2.5.1 Các phương pháp bào chế liposome

Tùy thuộc vào tính chất lý hóa của phospholipid và mục đích sử dụng liposome

có thể được bào chế theo một số phương pháp sau:

- Phương pháp hydrat hóa film

- Phương pháp thay đổi dung môi (tiêm ethanol)

- Phương pháp bốc hơi pha đảo

- Phương pháp dùng chất diện hoạt

- Phương pháp đông khô

1.2.5.2 Bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa film

Phospholipid tạo vỏ và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp Sau đó, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách bốc hơi trong một bình cầu để tạo một lớp film khô Hydrat hóa film đã tráng để tạo liposome [21]

Liposome được tạo ra bởi phương pháp này có thể có KTTP lớn và không đồng nhất Để đạt mục đích điều trị, việc đồng nhất và giảm KTTP liposome là cần thiết

1.2.5.3 Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome

Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lý, cải thiện hình thức cho chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng đường tiêm tĩnh mạch [31]

Các phương pháp được sử dụng để làm giảm kích thước của liposome là đùn ép; siêu âm; đồng nhất; đóng băng và tan băng

* Đùn ép

Đùn ép là một biện pháp làm giảm KTTP, sử dụng áp lực vừa phải để đẩy các liposome trong hỗn dịch qua các màng lọc polycarbonat tiêu chuẩn với kích thước màng xác định [18]

Cơ chế: Thường ép hỗn dịch liposome nhiều lớp qua màng để thu liposome nhỏ một lớp Liposome sẽ bị “bóc từng lớp một” cho đến kích thước mong muốn Khi bị nén qua lỗ lọc hình trụ, liposome có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc dễ dàng đi qua màng lọc Liposome có kích thước lớn hơn đường kính lỗ lọc, một số sẽ bị biến dạng để đi qua lỗ lọc và bị một số tác động của lực trượt sẽ bị “bóc” lớp vỏ ngoài sau khi đi qua lỗ lọc [7]

Kỹ thuật đùn ép có nhiều ưu điểm: có thể được áp dụng cho nhiều loại lipid và hỗn hợp, nhanh, chi phí thấp, có thể đùn trực tiếp liposome đa lớp thành đơn lớp [18]

Đùn ép có 2 loại: đùn tay hoặc đùn ép dưới áp suất cao

- Đùn tay

Đùn ép được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống xylanh cầm tay trang

bị bộ giữ màng lọc với kích thước màng lọc phù hợp Để có thể đùn ép qua lỗ lọc

200 nm, hỗn dịch liposome loãng phải được tuần tự đùn qua các màng lọc với kích thước lỗ lọc lớn hơn [18]

- Đùn ép dưới áp suất cao

Với thiết bị có quy mô lớn hơn, liposome có thể được nén qua màng với áp suất cao hơn, sử dụng khí nén là Nitơ (Hình 1.1)

* Siêu âm

Siêu âm là một trong những phương pháp phổ biến để làm nhỏ kích thước tiểu phân của liposome Có thể sử dụng siêu ẩm bể hoặc siêu âm que, tuy nhiên dùng que dễ đưa tạp vào chế phẩm [7]

Nhược điểm: Có hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá trình siêu âm, hiệu suất nạp thuốc giảm do rò rỉ dược chất trong quá trình siêu âm So với phương pháp đùn ép, phương pháp siêu âm không có sự đồng nhất giữa các lô mẻ [18]

* Đồng nhất hóa áp suất cao

Nguyên tắc hoạt động: Nén hỗn dịch qua khe hẹp có kích thước xác định trong thiết bị đồng nhất hóa ở áp suất cao Thường nén tuần hoàn nhiều vòng cho đến lúc thu được liposome khoảng 50- 100 nm [7]

Hình 1.1 Thiết bị đồng nhất hóa và đùn áp suất cao.

Đây là phương pháp dễ áp dụng trong sản xuất, ít ảnh hưởng đến độ ổn định của liposome

1.3 Kỹ thuật đông khô

1.3.1 Khái niệm và ưu nhược điểm của phương pháp đông khô

* Khái niệm:

Đông khô là quá trình làm khô chế phẩm trong các điều kiện đặc biệt, trong đó chế phẩm được đông lạnh, sau đó dung môi sẽ được thăng hoa trực tiếp (giai đoạn làm khô sơ cấp) rồi giải hấp phụ (giai đoạn làm khô thứ cấp) để ngăn chặn phản ứng hóa học và sự phát triển của vi sinh vật [30]

* Ưu điểm:

- Quá trình loại nước ở nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ phản ứng phân hủy DC đáng

kể so với việc loại nước bằng các phương pháp khác

- Sản phẩm đông khô hòa tan rất nhanh khi cần hòa tan trở lại

- Thuốc được phân liều vào lọ trước khi đông khô ở dạng dung dịch nên dễ dàng đạt được yêu cầu đồng nhất về hàm lượng DC

- Hạn chế phản ứng oxy hóa – khử DC

* Nhược điểm:

- Thời gian tiến hành kéo dài, giá thành sản phẩm cao, thiết bị phức tạp

- Nhiều loại thuốc mới có bản chất protein dễ bị mất hoạt tính hoặc phá hủy trong quá trình đông lạnh

- Nếu quá trình đông khô tạo ra chất rắn vô định hình và dạng này không ổn định thì sản phẩm sẽ không đạt được chất lượng như mong muốn [6]

1.3.2 Một số khái niệm khác

* Nhiệt độ kết tinh (Eutectic temparature, Te): là nhiệt độ thấp nhất mà ở đó dung

dịch vẫn tồn tại ở dạng lỏng Hay chính là điểm giao nhau giữa đường cong đóng băng và đường cong độ tan [30]

Hình 1.2 Giản đồ pha trong quá trình đông khô

* Nhiệt độ phá vỡ cấu trúc (Collapse Temparature, Tc): được định nghĩa là nhiệt độ

mà trên nhiệt độ đó các sản phẩm đông khô mất cấu trúc vĩ mô và sụp đổ trong đông khô Nhiệt độ phá vỡ cấu trúc thường được xác định là điểm băng bắt đầu tan chảy được quan sát trên kính hiển vi đông khô [30]

* Nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (Glass transition temperature, Tg’): Quá trình chuyển hóa thủy tinh xảy ra khi nguyên liệu trải qua một sự thay đổi đáng kể về độ nhớt khi qua một khoảng thay đổi nhỏ về nhiệt độ Tg’ là giao điểm giữa đường cong chuyển hóa thủy tinh và đường cong đông lạnh

1.3.3 Các giai đoạn của quá trình đông khô

Quá trình ĐK có thể được chia thành ba giai đoạn: đông lạnh, làm khô sơ cấp, làm khô thứ cấp [11]

1.3.3.1 Giai đoạn đông lạnh

Trong quá trình đông lạnh chế phẩm, có thể xảy ra một trong các hiện tượng sau:

- Cách 1: Đơn giản nhất là trong quá trình làm lạnh, băng được hình thành Khi đến

Te (nhiệt độ eutectic) một lượng chất tan đạt đến giới hạn độ tan và kết tinh khỏi dung dịch Sự kết tinh này gây loãng phần dung dịch còn lại làm hình thành nhiều

băng hơn, dẫn đến kết tinh nhiều chất tan hơn Sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp của băng và chất tan kết tinh Cách này chỉ xảy ở vài phần trăm các trường hợp

- Cách 2: Trong hầu hết các trường hợp chất tan không kết tinh ở giới hạn độ tan,

băng tiếp tục được hình thành trong khi nhiệt độ giảm và dung dịch tiếp tục được cô đặc cho đến khi nó nhớt đến mức chuyển hóa thành thủy tinh Điều này xảy ra ở một nhiệt độ đặc trưng gọi là nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (nhiệt độ chuyển kính) Tg’ Đối với các sản phẩm xảy ra theo cách này, Tg’ là nhiệt độ mà băng bắt đầu tan chảy trở lại và sản phẩm bất đầu bị phá vỡ cấu trúc (Tc = Tg’)

- Cách 3: Mặc dù hiếm nhưng có thể xuất hiện trường hợp sản phẩm có một thành

phần kết tinh còn các thành phần còn lại chuyển thành thủy tinh Nhìn chung công thức xảy ra theo cách này nên tránh vì có thể gây ra sự kết tinh không đồng nhất của các hoạt chất [29]

* Nguyên nhân liposome bị tăng kích thước trong quá trình đông lạnh có thể do:

- Trong quá trình đông lạnh làm hình thành các tinh thể băng bên trong liposome gây sự giãn nở của pha nước Từ đó tạo áp lực gây nứt vỡ lớp màng lipid của liposome thành các mảnh nhỏ Các mảnh vỡ này sẽ tái lắp ráp thành các liposome mới do hiện tượng kỵ nước và hình thành các liposome mới với kích thước khác Sự

tái hợp này có thể gây hợp nhất các liposome với nhau [14]

- Việc sử dụng đệm cũng làm tăng KTTP hơn so với sử dụng nước cất Các ion sẽ làm ức chế các lực đẩy giữa các liposome (lực hydrat hóa hoặc lực điện) dẫn đến tăng việc kết tụ của các mảnh vỡ do quá trình đông lạnh Ngoài ra, đệm có thể tạo ra

1 gradien thẩm thấu qua lớp màng lipid của liposome dẫn đến sự bất ổn định của một số khu vực trên màng do sự co rút thẩm thẩu Những khu vực này dễ bị phá vỡ khi đông lạnh [14] Vì vậy người ta thường sử dụng các chất bảo vệ (lyoprotectant) như: đường , glycerol, DMSO, PVP… để bảo vệ liposome trong quá trình đông lạnh Việc sử dụng glycerol ở nồng độ thấp kết hợp với mannitol có tác dụng làm tăng sự đông nhất của mẫu trong quá trình đông lạnh [27]

1.3.3.1 Giai đoạn làm khô sơ cấp

Trong giai đoạn này, dung môi sẽ được thăng hoa trực tiếp từ pha rắn sang pha hơi bằng cách hạ áp suất của buồng ĐK xuống thấp hơn áp suất hơi bão hòa của dung môi Bằng cách đó, phần dung môi không liên kết sẽ được tách ra khỏi sản phẩm Tốc độ thăng hoa của nước đá được tính theo công thức:

𝑑𝑚

𝑑𝑡 =

𝑃𝑖𝑐𝑒 − 𝑃𝑐

𝑅𝑝 + 𝑅𝑠Trong đó:

dm/dt: Tốc độ thăng hoa nước đá (g/cm2/giờ)

Pice: Áp suất hơi bão hòa của nước đá tại nhiệt độ của buồng ĐK (mmHg) Pc: Áp suất của buồng ĐK (mmHg)

Rp : Hệ số cản trở thăng hoa của sản phẩm

Rs: Hệ số cản trở thăng hoa của nắp [30]

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt tính của liposome trong quá trình này:

- Áp suất buồng đông khô càng thấp, tốc độ thăng hoa của dung môi càng nhanh

nhưng áp suất quá thấp có thể gây nhiễm các tạp dễ bay hơi từ bao bì và thiết bị vào chế phẩm Áp suất buồng ĐK càng cao, hiệu suất quá trình làm khô sơ cấp càng giảm

- Nhiệt độ làm khô càng cao thì Pice càng tăng, hiệu suất quá trình sấy sơ cấp càng

tăng Tuy nhiên, nếu nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ chuyển kính Tg’ (hệ vô định hình) hoặc nhiệt độ eutectic Teu (hệ kết tinh) sẽ dẫn tới hiện tượng vỡ cấu trúc của

hệ Kết quả là hàm ẩm tăng và giảm độ ổn định của chế phẩm

- Thời gian làm khô không đủ để loại phần dung môi không liên kết cũng dẫn tới

phá vỡ cấu trúc của hệ khi chuyển sang giai đoạn làm khô thứ cấp

1.3.3.2 Giai đoạn làm khô thứ cấp

Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, hấp phụ trong khối bột sẽ được loại bỏ bằng cách tiếp tục nâng nhiệt độ của buồng đông khô trong điều kiện áp suất thấp để làm giảm hàm ẩm còn lại tới mức tối ưu, đảm bảo độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bảo quản Nhiệt độ làm khô phải đảm bảo loại bỏ được phần nước

liên kết nhưng không làm ảnh hưởng đến đặc tính của liposome, thường từ 25-30oC

để đạt được tốc độ phản hấp thụ thích hợp [6], [12]

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng liposome đông khô

Liposome ĐK cần có các đặc tính mong muốn nhất định:

- Duy trì được các đặc tính vật lý và hóa học gốc của sản phẩm ban đầu (bánh hình thức đẹp, thời gian phân tán lại ngắn, kích thước và phân bố kích thước, hiệu suất liposome hóa thay đổi không đáng kể)

- Độ ẩm tương đối chấp nhận được

- Sự ổn định lâu dài [11]

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của liposome ĐK, bao gồm:

1.3.4.1 Yếu tố thuộc về công thức

- Dược chất: Do cấu trúc lưỡng thân của các phospholipid, thuốc thân nước nằm

trong pha nước, còn thuốc thân dầu chủ yếu nằm trên màng lipid Thuốc thân dầu khó rò rỉ khỏi liposome so với những thuốc thân nước do độ tan kém trong nước sau khi hydrat hóa lại [15]

- Dung môi: Thường dùng nhất là nước tinh khiết (nếu dùng cho chế phẩm vô

khuẩn, dùng nước để pha tiêm), bởi nhiều ưu điểm như: không độc, an toàn, dễ hóa hơi, rẻ tiền, do đó tiết kiệm trong sản xuất [6]

- Hệ đệm: Hệ đệm được yêu cầu trong công thức để ổn định pH Nên sử dụng hệ

đệm mà pH thay đổi ít nhất trong đông lạnh như citrate, tris [12]

- Tá dược tạo khung: Mục đích của nhóm tá dược này là tạo khuôn cho chế phẩm

Các tá dược độn kết tinh (manitol, lactose, glycin…) tạo ra bánh ĐK có hình thức đẹp, độ bền cơ học tốt, tuy nhiên không hiệu quả trong việc ổn định một số chế phẩm như nhũ tương, protein, liposome…[12]

- Tá dược bảo vệ: Ngoài việc là tá dược tạo khung, disaccharides tạo thành dạng

thủy tinh vô định hình đã được chứng minh là có hiệu quả nhất trong việc ổn định các sản phẩm như liposome và protein trong quá ĐK Saccarose và trehalose được

sử dụng nhiều trong việc ổn định công thức liposome, protein và virut [12], [15]

Cơ chế bảo vệ: Hai giả thuyết đã được đưa ra để giải thích là Giả thuyết thay thế nước và thủy tinh hóa

+ Giả thuyết thay thế nước: Các tá dược bảo vệ thay thế nước tương tác với

phospholipid thông qua liên kết hydro để giúp liposome không bị nứt vỡ trong quá trình đông lạnh và hydrat hóa trở lại Tá dược bảo vệ tương tác với đầu phân cực của phospholipid giúp duy trì khoảng cách giữa các đầu phân cực và giảm lực Van der Waals giữa các chuỗi acyl của phospholipid Nhờ đó tá dược bảo vệ làm giảm

sự tương tác giữa nước và phospholipid rồi sau đó thay thế nước Các liên kết hydro giữa tá dược bảo vệ và lipid được hình thành trên bề mặt của lớp màng kép Việc bổ sung các disaccharide không làm thay đổi lớp cấu trúc kép và các disaccharide là một sự thay thế tốt cho nước dưới điều kiện khan Một phân tử đường có thể tương tác với tối đa ba lipid khác nhau cùng lúc Thứ tự ưu tiên các nhóm của lipid tạo liên kết hydro với nhóm OH của đường là: phosphate, methyl choline, cacbonyl Vì vậy, nhóm phosphate trên lớp màng kép là vị trí có khả năng nhất mà đường tương tác Tóm lại, tương tác trực tiếp giữa phospholipid và tá dược bảo vệ qua liên kết hydro đóng vai trò quan trọng trong quá trình ĐK liposome [15]

+ Giả thuyết thủy tinh hóa: Tá dược bảo vệ hình thành dạng thủy tinh hóa ổn

định giữ cố định liposome khi nước đóng băng trong quá trình đông lạnh Cấu trúc thủy tinh hóa có độ nhớt cao và tính di động thấp, cần năng lượng kích hoạt rất cao

để bất kỳ tương tác nào xảy ra do đó ngăn ngừa liposome kết tụ và bảo vệ màng lipid kép khỏi bị hư hại bởi các tinh thể băng Cấu trúc này cũng ức chế sự thay đổi liên quan tới giai đoạn chuyển pha của lipid Chính vì vậy nó có thể giảm bớt thiệt hại do tinh thể nước đá, ngăn ngừa hiện tượng hợp nhất, kết tụ và tránh quá trình chuyển pha [15]

1.3.4.2 Yếu tố thuộc về kỹ thuật:

- Tốc độ làm lạnh chậm (0,5oC/phút) cho hàm lượng DC được giữ lại cao hơn [31]

- Trong quá trình làm khô sơ cấp, nhiệt độ sản phẩm phải được điều chỉnh xuống dưới nhiệt độ phá vỡ cấu trúc (Tc) của hệ [11]

- Thông số của quá trình sẽ được xác định bởi công thức Ví dụ: Nếu sử dụng các disaccharides có nhiệt độ phá vỡ cấu trúc thấp thì quá trình làm khô sơ cấp sẽ phải thực hiện ở nhiệt độ thấp và kéo dài ĐK với thể tích lớn sẽ cản trở quá trình thăng hoa do đó kéo dài quá trình hơn [12]

1.4 Các nghiên cứu về L-AMB và đông khô L-AMB

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới

A Manosroi cùng cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB với nguyên liệu là HSPC, Chol và các phospholipid tích điện: dicetyl phosphate (-), stearylamine (+) với các tỷ lệ 1:1:0, 7:2:0, 7:2:1 (-), 7:2:1 (+), nồng độ 0,05 mg AMB/ mg lipid bằng phương pháp hydrat hóa film, sử dụng kĩ thuật siêu âm để đồng nhất hóa và giảm kích thước tiểu phân, sử dụng phân tích nhiệt vi sai để đánh giá mức độ ổn định của liposome Đánh giá hiệu suất liposome hóa bằng phương pháp li tâm ở tốc độ 50 000 g (ở 4ºC), trong 1h Kết quả thu được các liposome có kích thước từ 115 – 364 nm, hiệu suất liposome hóa trên 85% với tất cả các mẫu, trong đó mẫu 7:2:1 (+) AMB cho hiệu suất nạp thuốc và ổn định nhất được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo [20]

S.P Shah và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB dạng bột xông hít dùng điều trị nhiễm nấm xâm lấn ở phổi, bằng phương pháp bốc hơi pha đảo sử dụng hỗn hợp ethyl acetat và ethanol làm pha dung môi hữu cơ, pha nước là dung dịch đệm Tris 0,01 M pH 6,5 chứa 1 mM EDTA Liposome tạo ra được đùn ép qua màng polycarbonat 2 µm, ở nhiệt độ 60ºC, loại dược chất không được gắn vào liposome bằng li tâm ở tốc độ 4,38 × 103 trong 90 giây Sử dụng HSPC, Chol và phosphatidylglycerol đậu nành (7:3:0,5) hoặc stearylamin (1:1:0,1) để tạo liposome AMB tích điện âm (AMB 1) hoặc dương (AMB 2), đông khô liposome bằng các tá dược bảo vệ khác nhau, sau đó sử dụng sorbolac 400 và pharmatose 325M đã rây qua rây 500 để làm chất mang tạo dạng liposome bột xông hít Kết quả khảo sát các điều kiện thí nghiệm cho thấy với tỷ lệ ethyl acetat: ethanol là 1:1, tỷ lệ pha nước: pha dung môi hữu cơ là 1:5 tạo ra các liposome có đặc tính tốt nhất với kích thước 1,8 ± 0,2 µm (AMB 1) và 2,0 ± 0,3 µm (AMB 2), hiệu suất nạp thuốc 95,8 ± 1,5 %

(AMB 1) và 87,9 ± 1,3 (AMB 2) Trong các chất bảo vệ đã khảo sát, saccarose được lựa chọn cho các nghiên cứu sau với tỷ lệ tối ưu lipid: saccarose là 1:5, sản phẩm sau khi tạo dạng bột xông hít thì hiệu suất nang hóa là 22,5 ± 2,2 % (AMB 1)

và 16,8 ± 2,2 % (AMB 2) Liposome AMB tạo ra có tuổi thọ trên 1 năm, bảo quản ở 2-8 ºC [24]

1.4.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Ngô Thị Bích Phượng đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương pháp bốc hơi pha đảo với các tá dược là SPC và Chol theo tỉ lệ mol 5:5, môi trường hydrat hóa là đệm phosphate pH 7,4, tỷ lệ % dược chất/tổng lượng lipid là 3mol% cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI< 0,3) và hiệu suất

liposome hóa cao (khoảng 90%) [5]

Mai Thị Thùy Linh đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương pháp hydrat hóa film với các tá dược theo tỷ lệ mol HSPC: DSPG: Chol = 2:0,8:1,9, tỷ lệ dược chất/ tổng số mol lipid đạt 9 mol%, môi trường hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI<0,2) và hiệu suất liposome hóa cao (khoảng gần 90%) [4]

Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về ĐK L-AMB ở Việt Nam được công bố

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu: L-AMB và L-AMB đông khô

* Nguyên liệu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu

* Phương tiện nghiên cứu:

- Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 2000ml(Buchi – Đức)

- Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh)

- Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ)

- Thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-C5 (Avestin – Canada)

- Bể siêu âm Wiseclean 40 kHz (Hàn Quốc)

- Máy đo quang Hitachi U – 1800 (Nhật Bản)

- Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản)

- Máy đông khô Labocono Freezone Triad 740030 (Mỹ)

- Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Bào chế liposome AMB bằng phương pháp hydrat hóa film và khảo sát các phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP

- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và quy trình đông khô AMB

L Đánh giá một số đặc tính của LL AMB đông khô

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế L-AMB

2.3.1.1 Công thức bào chế

Bào chế liposome AMB bằng phương pháp hydrat hóa film theo công thức của nghiên cứu [4]: tỷ lệ dược chất/ tổng số mol lipid đạt 9 mol%, tỷ lệ Chol là 40% so với tổng lượng lipid và HSPC:DSPG= 2:0,8, dung dịch hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 có thể kết hợp với tá dược đông khô

Công thức cho mẫu 80 ml :

- Cân và hòa tan DSPG trong hỗn hợp methanol:chloroform tỉ lệ 1:1, điều chỉnh đến

pH 1-2 bằng dung dịch HCl 2,5N trong methanol ở 60oC (1)

- Cân và phân tán AMB trong methanol ở 60oC (2)

- Cân và hòa tan HSPC và Chol trong hỗn hợp methanol:chloroform tỉ lệ 1:1 (3)

- Phối hợp (2) vào (1) ở 60oC, khuấy để hòa tan hoàn toàn Sau đó phối hợp thêm (3) vào dung dịch đã thu được ở trên