Ngô Thị Bích Phượng đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương pháp bốc hơi pha đảo với các tá dược là SPC và Chol theo tỉ lệ mol 5:5, môi trường hydrat hóa là đệm phosphate pH 7,4, tỷ lệ % dược chất/tổng lượng lipid là 3mol% cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI< 0,3) và hiệu suất liposome hóa cao (khoảng 90%) [5].
Mai Thị Thùy Linh đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương pháp hydrat hóa film với các tá dược theo tỷ lệ mol HSPC: DSPG: Chol = 2:0,8:1,9, tỷ lệ dược chất/ tổng số mol lipid đạt 9 mol%, môi trường hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI<0,2) và hiệu suất liposome hóa cao (khoảng gần 90%) [4].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu.
* Đối tượng nghiên cứu: L-AMB và L-AMB đông khô
* Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Amphotericin B Trung Quốc USP
2 Cholesterol Trung Quốc NSX
3
Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (hydrogenated soy
phosphatidylcholin)
Lipoid – Đức NSX
4 Distearoyl phosphatidylglycerol Lipoid – Đức NSX
5 Chloroform Labscan – Thái
Lan NSX
6 Methanol Trung Quốc TKHH
7 Nước cất 2 lần Việt Nam DĐVN
8 Acid citric Trung Quốc TKHH
9 Saccarose Trung Quốc BP
10 Mannitol Trung Quốc BP
11 Natri hydroxyd Trung Quốc TKHH
12 Acid hydroclorid đặc Trung Quốc TKHH
* Phương tiện nghiên cứu:
- Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 2000ml(Buchi – Đức).
- Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh). - Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ).
- Thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-C5 (Avestin – Canada). - Bể siêu âm Wiseclean 40 kHz (Hàn Quốc).
- Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản). - Máy đông khô Labocono Freezone Triad 740030 (Mỹ).
- Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Bào chế liposome AMB bằng phương pháp hydrat hóa film và khảo sát các phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP.
- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và quy trình đông khô L- AMB.
- Đánh giá một số đặc tính của L-AMB đông khô.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế L-AMB
2.3.1.1. Công thức bào chế
Bào chế liposome AMB bằng phương pháp hydrat hóa film theo công thức của nghiên cứu [4]: tỷ lệ dược chất/ tổng số mol lipid đạt 9 mol%, tỷ lệ Chol là 40% so với tổng lượng lipid và HSPC:DSPG= 2:0,8, dung dịch hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 có thể kết hợp với tá dược đông khô.
Công thức cho mẫu 80 ml :
Amphotericin B ………..110,8 mg Distearoylphosphatidylglycerol ……….178,0 mg Hydrogennated soy phosphatidylcholine ………...451,6 mg Cholesterol ………..206,2 mg
2.3.1.2. Qui trình bào chế
- Cân và hòa tan DSPG trong hỗn hợp methanol:chloroform tỉ lệ 1:1, điều chỉnh đến pH 1-2 bằng dung dịch HCl 2,5N trong methanol ở 60oC (1).
- Cân và phân tán AMB trong methanol ở 60oC (2).
- Cân và hòa tan HSPC và Chol trong hỗn hợp methanol:chloroform tỉ lệ 1:1 (3). - Phối hợp (2) vào (1) ở 60oC, khuấy để hòa tan hoàn toàn. Sau đó phối hợp thêm (3) vào dung dịch đã thu được ở trên.
- Cho 9 g bi thủy tinh vào bình cầu dung tích 2000 ml của hệ thống cất quay. Chuyển dung dịch lipid vào bình cầu.
- Tiến hành cất quay ở điều kiện nhiệt độ 41oC, tốc độ quay 150 vòng/phút. Hệ thống cất quay được hút chân không, điều chỉnh áp suất để dung môi bay hơi từ từ. Sau 30 phút hút chân không, dung môi bay hơi hết và film được hình thành thì giảm tốc độ quay xuống 100 vòng/phút. Tiếp tục cất quay thêm 15 giờ nữa để đảm bảo loại hết hoàn toàn dung môi hữu cơ.
- Tiến hành hydrat hóa film bằng 80 ml dung dịch đệm citrat pH = 5,5. Quá trình hydrat hóa được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 50oC, tốc độ quay 250 vòng/phút trong 15 phút để đảm bảo film đã được hydrat hóa hoàn toàn.
2.3.1.3. Khảo sát phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP * Phương pháp đùn qua màng * Phương pháp đùn qua màng
Liposome thu được sau bào chế được đùn ép lần lượt dưới áp suất thấp sử dụng thiết bị đùn tay mini extruder:
+ Nâng nhiệt độ của mẫu lên 60oC và giữ nhiệt trong suốt quá trình đùn bằng bể điều nhiệt.
+ Đùn lần lượt mẫu qua màng polycarbonat kích thước 1000 – 400– 200 nm, mỗi mẫu đùn 29 lần.
* Phương pháp siêu âm
Liposome thu được sau bào chế được siêu âm trong bể Wiseclean (40 kHz) để làm giảm KTTP:
+ Chia mẫu thành các phần 20 ml, cho vào cốc có mỏ dung tích 100 ml, tiến hành khảo sát quá trình siêu âm ngắt quãng: siêu âm 30 giây, nghỉ 30 giây; siêu âm 1 phút, nghỉ 1 phút; siêu âm 2 phút, nghỉ 2 phút. Trong quá trình siêu âm có sử dụng nước đá để tránh tăng nhiệt cục bộ hỗn dịch liposome. Mẫu thu được đánh giá các đặc tính để chọn ra điều kiện thích hợp nhất cho quá trình siêu âm.
+ Mẫu có KTTP và phân bố KTTP có giá trị nhỏ nhất được lựa chọn để thực hiện quá trình đùn ép qua màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 400 nm.
* Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp với đùn qua màng
Mẫu liposme sau khi bào chế được tiến hành đồng nhất hóa và đùn qua màng 400 nm bằng máy Emulsiflex-C5 dưới áp lực của bình khí N2 lỏng:
+ Đồng nhất hóa: được tiến hành dưới các áp suất khác nhau 5000 psi (350 bar), 10000 psi (700 bar), 15000 psi (1050 bar) với số lần khác nhau để tìm ra điều kiện phù hợp.
+ Đùn qua màng 400 nm: đùn tại áp suất 500 psi (35 bar).
2.3.2. Phương pháp đông khô L-AMB
2.3.2.1. Quy trình bào chế L-AMB đông khô:
- Bào chế L-AMB theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.1.
- Đồng nhất và làm giảm KTTP theo phương pháp đồng nhất hóa và đùn áp suất cao được mô tả ở mục 2.3.1.
- Lọc tiệt khuẩn qua màng 0,2 µm.
- Hút chính xác mỗi 2 ml hỗn dịch liposome sau khi giảm KTTP, cho vào lọ thủy tinh dung tích 10 ml, đông khô theo quy trình.
2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và qui trình đông khô L-AMB
* Khảo sát tá dược:
- Khảo sát tác dụng của tá dược bảo vệ trong quá trình đông lạnh :
+ Hỗn dịch liposome tạo thành được đóng băng trong quá trình đông lạnh có mặt các tá dược khác nhau là saccarose và mannitol. Tỷ lệ khối lượng của lipid:đường được thay đổi để lựa chọn tỷ lệ phù hợp. Glycerin cũng được thêm vào với các tỷ lệ 1%; 2%
+ Quy trình đông lạnh: Mẫu được làm lạnh với tốc độ 0,5oC/phút từ nhiệt độ phòng tới 0oC; tốc độ làm lạnh 0,25oC/phút từ 0oC tới -50oC; rồi được giữ ở đó 8h. Sau khi kết thúc quá trình đông lạnh mẫu được để rã đông ở nhiệt độ phòng
- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược : đông khô L-AMB với các tỷ lệ đường bảo vệ khác nhau rồi đánh giá để lựa chọn tỷ lệ phù hợp.
* Khảo sát qui trình đông khô : Khảo sát nhiệt độ của quá trình làm khô sơ cấp : tiến hành khảo sát ở 2 nhiệt độ là -15oC và -35oC
2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của L-AMB và L-AMB đông khô
2.3.3.1. Đánh giá L-AMB
* Hình thức: L-AMB sau khi làm giảm KTTP phải là hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, không có lắng cặn tinh thể, không có các tiểu phân có kích thước lớn, có thể quan sát bằng mắt thường
* Hình thái: Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để quan sát đặc điểm hình thái, kích thước của liposome.
* KTTP và PDI
Pha loãng hỗn dịch liposome 100 lần bằng nước cất đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm, tiến hành đo KTTP bằng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động (DLS) trên máy Zetasizer ZS 90. Thiết bị cũng cho giá trị về chỉ số đa phân tán PDI của hệ.
* pH: Theo DĐVN IV.
2.3.3.2. Đánh giá L-AMB đông khô
* Hình thức: Bánh thuốc sau đông khô phải có hình thức đẹp không bị co ngót, màu vàng nhạt, cấu trúc bánh xốp, mịn.
* Thời gian phân tán lại: Hút chính xác 2 ml nước cất vào mỗi lọ đông khô rồi lắc. Cứ mỗi khoảng 10 giây thì quan sát 1 lần.
* Hình thức cảm quan mẫu sau khi phân tán lại
Là hỗn dịch màu vàng nhạt, không có lắng cặn tinh thể, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát được bằng mắt thường
* pH: Mẫu sau khi phân tán lại đánh giá theo DĐVN IV. ∆pH = |pHsauđk – pHtrướcđk|.
* Hình thái: Sau khi phân tán lại, tiến hành tương tự mục 2.3.3.1 * KTTP và PDI: Sau khi phân tán lại, tiến hành tương tự mục 2.3.3.1.
* Hàm lượng AMB
Xác định hàm lượng AMB trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS. Phương pháp đã được thẩm định theo khóa luận trước [4]. - Điều kiện đo:
+ Máy đo quang Hitachi U – 1800 (Nhật Bản). + Cuvet: thạch anh.
+ Bước sóng: 405 nm. + Dung môi: methanol.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: 1 – 6 µg/ml - Pha mẫu chuẩn và mẫu thử:
+ Mẫu chuẩn:
Cân khoảng 0,01 g AMB hòa tan bằng methanol trong bình định mức 50 ml, bổ sung methanol đến vạch, thu được dung dịch gốc có nồng độ 200 µg/ml. Hút chính xác một thể tích dung dịch gốc, pha loãng bằng dung môi methanol đến khi thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp.
+ Mẫu thử:
Hút chính xác 1 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp dung môi methanol:chloroform tỉ lệ 3:1 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên, pha loãng bằng dung môi methanol trong bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích đến vạch.
Hàm lượng AMB được xác định bằng công thức: CT = 𝐴𝑡
𝐴𝑐 x mc x k. Trong đó:
CT : nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome (mg/ml). At : độ hấp thụ quang của mẫu thử.
Ac : độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn. mc : khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg). k : hệ số pha loãng.
* Hiệu suất liposome hóa
Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome sau phân tán lại. Hút chính xác 1 ml hỗn dịch liposome, pha loãng mẫu như mô tả ở mục “Hàm lượng AMB trong mục 2.3.3.2”. Đo quang mẫu ở bước sóng 405 nm thu được độ hấp thu quang là A1.
Định lượng AMB gắn trong lớp lipid của liposome: Để đánh giá được lượng AMB gắn với lipid cần loại bỏ phần AMB tự do. AMB tự do không tan trong nước ở dạng kết tủa và bị loại đi khi lọc mẫu sau khi phân tán lại qua màng 100 nm. Hỗn dịch thu được sau khi đã loại AMB kết tủa: Hút chính xác 1 ml hỗn dịch liposome, pha loãng mẫu như mô tả ở mục “Hàm lượng AMB trong mục 2.3.3.2”. Tiến hành đo quang mẫu ở bước sóng 405 nm thu được độ hấp thụ quang A2.
- Hiệu suất liposome hóa được xác định bằng công thức: H1 = 𝐴2
𝐴1 x 100%.
* Tỷ lệ dược chất rò rỉ sau đông khô được tính như sau: H2 = 100% - H1
* Độ ẩm: Tiến hành theo phương pháp mất khối lượng do làm khô: - Cân cả lọ đông khô rồi cho vào tủ sấy ở 100oC trong vòng 1 giờ.
- Sau khi sấy, làm nguội lọ tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay. Sự chênh lệch khối lượng sau khi sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy so với lần trước đó không được quá 0,5 mg.
- Sau khi sấy lọ đến khối lượng không đổi, rửa sạch lọ, đem sấy khô rồi cân khối lượng lọ để tính toán lượng thuốc có trong lọ ban đầu.
2.4. Điều kiện thí nghiệm
ABM bị mất hoạt tính khi tiếp xúc với ánh sáng, do đó quá trình bào chế và đánh giá cần thiết được tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả bào chế L-AMB bằng phương pháp hydrat hóa film và khảo sát các phương pháp làm giảm KTTP các phương pháp làm giảm KTTP
3.1.1. Kết quả liposome thu được sau khi hydrat hóa
- Bố trí thí nghiệm: Tiến hành bào chế mẫu theo công thức và quy trình mô tả ở mục 2.3.1. được trình bày trong bảng 3.1.
- Đánh giá sơ bộ mẫu L-AMB sau khi hydrat hóa:
+ Về hình thức: sau hydrat hóa thu được hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, không có lắng cặn tinh thể, có các tiểu phân có kích thước lớn, có thể quan sát bằng mắt thường.
+ Về hình thái : Quan sát ảnh chụp TEM cho thấy các tiểu phân có cấu trúc hình cầu, đa số là nhiều lớp, KTTP to, phân bố KTTP không đồng nhất (Hình 3.1).
+ KTTP, phân bố KTTP được đánh giá theo phương pháp ở mục 2.3.3.1. Kết quả đánh giá được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. KTTP và phân bố KTTP của các mẫu L-AMB sau khi hydrat hóa
Mẫu KTTP (d.nm) PDI 1 738,8 0,495 2 750,0 0,556 3 761,6 0,686 4 952,9 0,540 5 1026,0 0,532 6 928,8 0,590 7 911,0 0,490 8 996,3 0,438 9 973,9 0,406 10 882,6 0,508 11 842,3 0,489 12 845,4 0,484
13 853,5 0,520
14 848,4 0,505
15 864,2 0,451
Trung bình 878,4 ± 87,7 0,513 ± 0,067
Nhận xét:
Mẫu L-AMB thu được sau khi hydrat hóa có KTTP lớn từ 738,8 đến 1026,0 nm và chỉ số PDI cao từ 0,451 đến 0,686 cho thấy phân bố KTTP rất không đồng nhất. Chính vì vậy cần thiết phải tiến hành nghiên cứu các biện pháp làm giảm và đồng nhất KTTP.
3.1.2. Khảo sát các phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP
Liposome có KTTP > 200 nm nhanh chóng bị opsonin hóa và bắt giữ bởi hệ thống đại thực bào (RES) nên thời gian lưu thông trong máu ngắn. Khi KTTP liposome giảm thì tỷ lệ tiểu phân bị opsonin hóa và bắt giữ ít đi [19]. Liposome với kích thước từ 70 đến 200 nm có khả năng lớn thoát khỏi RES, lưu thông lâu hơn trong máu để đến được đích cần tác dụng [13]. Chính vì vậy nghiên cứu đặt mục tiêu sẽ làm giảm được KTTP của L-AMB xuống < 200 nm.
3.1.2.1. Phương pháp đùn qua màng
- Bố trí thí nghiệm: Tiến hành bào chế các mẫu theo mô tả ở mục 2.3.1 rồi làm giảm KTTP bằng thiết bị đùn tay mini extruder theo phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.3.
- KTTP, phân bố KTTP trước và sau đùn được đánh giá theo phương pháp ở mục 2.3.3.1. Kết quả đánh giá được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. KTTP và phân bố KTTP trước và sau khi đùn tay.
Trước đùn Sau đùn
KTTP (d.nm) PDI KTTP (d.nm) PDI
738,8 0,495 207,5 0,122
750,0 0,566 211,6 0,111
Nhận xét: Hỗn dịch L-AMB sau đùn có KTTP nhỏ từ 207,5 đến 233,5 nm, chỉ số PDI thấp từ 0,111 đến 0,227 cho thấy phân bố KTTP khá đồng nhất. Tuy nhiên, thể tích mỗi lần đùn tay chỉ được 1 ml và KTTP (> 200 nm) vẫn chưa đạt đến kích thước mong muốn. Vì vậy cần tiếp tục nghiên cứu các phương pháp khác để làm giảm KTTP.
3.1.2.2. Phương pháp siêu âm
- Mục đích của phương pháp này là : Làm giảm KTTP của liposome xuống kích thước có thể đùn ép trực tiếp qua màng polycarbonat 400 nm bằng máy đùn áp suất cao, giúp rút ngắn thời gian so với đùn ép tuần tự qua các màng polycarbonat 1000- 400-200 nm và tránh hiện tượng tắc màng khi đùn. Việc đùn ép sau siêu âm là cần thiết để làm cho hỗn dịch liposome trở nên đồng nhất hơn.
- Bố trí thí nghiệm: Tiến hành bào chế các mẫu theo mô tả ở mục 2.3.1 rồi làm giảm