Nghiên cứu này đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao cồn rễ đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trên mô hình thiếu máu não cục bộ tạm thời bằng mô hình thắt tạm thời 2 động mạch cảnh chung (T2VO), đồng thời bước đầu đánh giá cơ chế tác dụng của cao cồn rễ đinh lăng.
www.vanlongco.com Tài liệu tham khảo Viện Dược liệu (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm, Nhà Xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 69-234 Matsumoto K., Ojima K., Watanabe H (1996), Neurosteroidal modulation of social isolation-induced decrease in pentobarbital sleep in mice, Brain Research, 708(1-2), 1-6 Nguyen T T., Matsumoto K., Yamasaki K., Nguyen M D., Nguyen T N., Watanabe H (1996), Effects of majonoside-R2 on pentobarbital sleep and gastric lesion in psychologically stressed mice, Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 53(4), 957-963.4 Nguyen T T., Matsumoto K., Yamasaki K., Watanabe H (1997), Majonoside-R2 reverses social isolation stress-induced decrease in pentobarbital sleep in mice: possible involvement of neuroactive steroids, Life Sciences, 61(4), 395-402 Cha H Y., Park J H., Hong J T., Yoo H S., Song S., Hwang B Y., Eun J S., Oh K W (2005), Anxiolytic-like effects of ginsenosides on the elevated plus-maze model in mice, Biological Pharmaceutical Bulletin, 28(9), 1621-1625 Lee S H., Jung B H., Kim S Y., Lee E H., Chung B C (2006), The antistress effect of ginseng total saponin and ginsenoside Rg3 and Rb1 evaluated by brain polyamine level under immobilization stress, Pharmacological Research, 54(1), 46–49 Bae M Y., Cho J H., Choi I S., Park H M., Lee M G., Kim D H., Jang IS (2010), Compound K, a metabolite of ginsenosides, facilitates spontaneous GABA release onto CA3 pyramidal neurons, Journal of Neurochemistry, 114(4), 1085-1096 Kim H S., Hwang S L., Nah S Y., Oh S (2001), Changes of [3H]MK-801, [3H] muscimol and [3H] flunitrazepam binding in rat brain by the prolonged ventricular infusion of ginsenoside Rc and Rg1, Pharmacological Research, 43(5),473-479 Noh J H., Choi S., Lee J H., Betz H., Kim J I., Park C S., Lee S M., Nah S Y (2003), Effects of ginsenosides on glycine receptor alpha1 channels expressed in Xenopus oocytes, Molecular Cells, 15(1), 34-39 10 Choi S., Jung S Y., Lee J H., Sala F., Criado M., Mulet J , Valor L M., Sala S., Engel A G., Nah S Y (2002), Effects of ginsenosides, active components of ginseng, on nicotinic acetylcholine receptors expressed in Xenopus oocytes, European Journal of Pharmacology, 442(1-2), 37-45 11 Wu H F., Zhu C H , Guo J Y (2012), Effect of ginsenoside Rg1 on behaviors and hippocampal amino acids in depressive-like rats, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi Chinese, 37(20), 3117-3121.12 Lee B H., Lee J H., Lee S M., Jeong S M., Yoon I S., Lee J H., Choi S H., Pyo M K., Rhim H., Kim H C , Jang C G , LeeB C., Park C S., Nah S Y (2007), Identification of ginsenoside interaction sites in 5-HT3A receptors Neuropharmacology, 52(4), 11391150 13 Wang J., Flaisher-Grinberg S., Li S., Liu H., Sun L., Zhou Y., Einat H (2010), Antidepressant-like effects of the active acidic polysaccharide portion of ginseng in mice, Journal of Ethnopharmacology, 132(1), 65-69 14 Wang J., Sun C., Zheng Y., Pan H., Zhou Y., Fan Y (2014), The effective mechanism of the polysaccharides from Panax ginseng on chronic fatigue syndrome, Archives of Pharmacal Research, 37(4), 530-538 Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 (Trang 113 - 119) TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MƠ HÌNH GÂY THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ TẠM THỜI VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CAO CỒN RỄ ĐINH LĂNG Phạm Thị Nguyệt Hằng*, Nguyễn Minh Khởi Viện Dược liệu *Email: pnhang2004@yahoo.com (Nhận ngày 03 tháng năm 2017) Tóm tắt Nghiên cứu đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao cồn rễ đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) mơ hình thiếu máu não cục tạm thời mơ hình thắt tạm thời động mạch cảnh chung (T2VO), đồng thời bước đầu đánh giá chế tác dụng cao cồn rễ đinh lăng Chuột nhắt trắng uống cao chiết cồn rễ đinh lăng với liều tương đương 300 mg dược liệu/kg trước tiến hành phẫu thuật gây suy giảm trí nhớ tuần suốt thời gian làm thí nghiệm Tacrin (liều 2,5 mg/kg; i.p) sử dụng làm đối chứng dương Kết cho thấy cao chiết cồn rễ đinh lăng có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ mơ hình T2VO, đánh giá thử nghiệm nhận diện đồ vật thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến Mức độ biểu số gen liên quan bao gồm gen ChAT, muscarinic M3, M5 (M3, M5) đánh giá nghiên cứu Kết cho thấy cao cồn rễ đinh lăng (liều tương đương 300 mg dl/kg) có tác dụng tăng biểu gen ChAT muscarinic M5 so với nhóm chứng bệnh lý (T2VO) Nghiên cứu chứng minh cao chiết cồn rễ đinh lăng với liều tương đương 300 mg dl/kg có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ thơng qua chế tăng cường biểu gen ChAT muscarinic M5 Từ khóa: T2VO, Cao chiết rễ đinh lăng, Ch ng trí, Cholin acetyltransferase, Muscarinic M3, -M5, RT-PCR Summary Study on the Anti-dementia Effect of Ethanol Root Extract from Polyscias fruticosa (L.) Harms and its Mechanisms This study evaluated the anti-dementia effects of Polyscias fruticosa (L.) Harms ethanol root extract, using transient vessels occlusion (T2VO)-induced cognitive deficits in mice, and its mechanisms underlying the action T2VO mice were Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 113 www.vanlongco.com treated daily with ethanol root extract of Polyscias fruticosa (300 mg dried root/kg body weight, p.o) week before and continuously a day after surgery Administration of the reference drug tacrine (2.5 mg/kg/day, i.p.) to T2VO mice was started a day after T2VO Cognitive performances of the animals was analyzed using the novel object recognition test, modified Y maze test, to elucidate non-spatial short term memory and spatial working memory, respectively After completing the behavioral experiments, the expression level of cholinergic marker genes, including choline acetyltransferase (ChAT), muscarinic M3 and M5 T2VO caused impairment of non-spatial short term memory and spatial working memory T2VO induced memory deficits were reversed by Polyscias fruticosa extract and tacrine Polyscias fruticosa extract attenuated T2VO-induced down-regulation of choline acetyltransferase and muscarinic M5 genes expression without affecting muscarinic M3 gene These finding demonstrate that Polyscias fruticosa extract improves memory deficits caused by T2VO and that the effect of Polyscias fruticosa extract may be mediated by enhancement gene expression of central cholinergic systems, such as ChAT and muscarinic M5 Keywords: T2VO, Root extract of Polyscias fruticosa, Dementia, Choline acetyltransferase, Muscarinic M3, -M5, RT-PCR Đặt vấn đề Thiếu máu não cục nguyên nhân dẫn đến bệnh đột quỵ Bên cạnh đó, thiếu máu não cục làm tổn thương tế bào thần kinh số vùng vỏ não bao gồm vùng vỏ não đồi đóng vai trị quan trọng trình học nhớ, đặc biệt dễ bị tổn thương có chọn lọc thiếu máu não Tổn thương vùng não nhạy cảm thiếu máu não cục dẫn thiếu hụt nghiêm trọng việc học nhớ [1], [2] Dựa đặc điểm này, nhà khoa học giới sử dụng mơ hình để nghiên cứu thuốc tăng cường/phục hồi/cải thiện trí nhớ nói chung thuốc điều trị bệnh Alzheimer nói riêng từ năm 1980, mơ hình ngày sử dụng rộng rãi ngày Đinh lăng có tên khoa học Polyscias fruticosa (L.) Harms, họ Nhân sâm (Araliaceae) [3], thuốc sử dụng từ lâu y học phương Đông vị thuốc bổ, giải độc, kích thích tiêu hóa, tiêu viêm, tăng thể lực sức bền [4,5] Nghiên cứu Nguyễn Thị Thu Hương cs cho thấy đinh lăng có tác dụng bảo vệ gan thơng qua chế chống oxy hóa [6] Thêm vào đó, Nguyễn Thị Thu Hương cs chứng minh cho chuột nhắt uống liều cao chiết cồn rễ đinh lăng 180mg/kg có tác dụng chống trầm cảm mơ hình chuột bơi cưỡng [7] Khi cho chuột uống cao chiết đinh lăng thời gian - ngày với liều 45 mg/kg thể tác dụng chống trầm cảm đạt ý nghĩa thống kê mơ hình Cũng nghiên cứu này, tác giả chứng minh cao chiết rễ đinh lăng với liều khác từ 45 – 180 mg/kg có tác dụng chống stress mơ hình chuột lập thử 114 [1,7] Trong nghiên cứu khác, tác giả Trần Tý Yên chứng minh cao chiết rễ đinh lăng phục hồi khả học nhớ chuột cống độ tuổi khác uống với liều 10 mg/kg/ngày -4 tuần [8] Tuy nhiên, chế cải thiện trí nhớ đinh lăng mơ hình thực nghiệm chưa làm sáng tỏ Do vậy, mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ mơ hình gây thiếu máu não cục tạm thời bước đầu nghiên cứu chế tác dụng cao cồn rễ đinh lăng Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Động vật thí nghiệm: Động vật sử dụng nghiên cứu chuột nhắt trắng chủng Swiss, giới, trọng lượng trung bình 25 – 27 g cung cấp Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương Chuột chăm sóc ni phịng thí nghiệm với nhiệt độ trì 22 ± 1°C, ăn uống đầy đủ, chu kỳ sáng tối 12/12 h (chu kỳ sáng từ 7:00 - 19:00) Chuột nuôi ổn định ngày trước tiến hành thí nghiệm 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu: Rễ đinh lăng 4-5 năm tuổi thu hái Tiền Hải, Thái Bình (2015) Điều chế cao chiết thực Khoa Hóa Phân tích, Viện Dược liệu Quy trình chiết cao cồn rễ đinh lăng mơ tả tóm tắt sau: Rễ rửa sạch, phơi khô, thái lát mỏng xay nhỏ thành bột Bột làm ẩm ethanol 70% Chiết hồi lưu lần: Lần lấy 250g bột dược liệu làm ẩm trên, thêm L ethanol 70%, chiết hồi lưu giờ, thu dịch chiết Lần 2: tiếp tục thêm 1,5 L ethanol 70%; chiết hồi lưu 2,5 giờ; thu dịch chiết Lần 3: Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 www.vanlongco.com tiếp tục thêm 1,5 L ethanol 70%; chiết hồi lưu giờ, thu dịch chiết Gộp dịch chiết cất thu hồi dung mơi dịch đặc, sau cạn bát sứ bếp cách thủy với nhiệt độ 80oC đến khối lượng thay đổi không đáng kể thu 22,86g cao Mẫu cao chiết hòa tan nước chuột uống suốt q trình nghiên cứu [4], [6], [9] 2.1.3 Hóa chất, thuốc đối chiếu: - Thuốc đối chiếu: Tacrin (Sigma - Aldrich, USA) hòa tan nước muối sinh lý để sử dụng theo đường tiêm phúc mạc (i.p.), liều sử dụng 2,5 mg/kg - Hóa chất tách chiết ARN phản ứng RTPCR: Kit Trisure (Bioline, Đức), cloroform (Sigma), isopropanol (Sigma), M-MLV Reverse Transcriptase® (In vitrogen, Rockville, MD, USA), RNase inhibitor (In vitrogen, Mỹ), dNTPs (Thermo scientific, Mỹ), taq polymerase (Promega, Mỹ) - Trình tự cặp mồi: · β-actin (219 bp): mồi xuôi: 5’- GTGACAG CATTGCTTCTGTG-3’; mồi ngược: 5’- AACG GTCTCACGTCAGTGTA-3’ · ChAT (372 bp): mồi xuôi: 5’-CCTGTACA AGCTTCTCTAGCTGTGAG-3’; mồi ngược: 5’GTAGCTAAGCACACACCAGAGATGAG-3’ · M3 (289 bp): mồi xuôi: 5’-ACATCCTTGT CATTGTGGCC-3’; mồi ngược: 5’-TAGGTGA GTGGCCTAGTGAT-3’ · M5 (451 bp): mồi xuôi: 5’-CTCATCATTG GCATCTTCTTC-3’; mồi ngược: 5’- GGTCCTT GGTTCGTTTCTCTG-3’ 2.2 Phương pháp nghiên c u 2.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn rễ đinh lăng mơ hình thiếu máu não cục tạm thời: Chuột chia làm nhóm: Nhóm chứng sinh lý (n=8) chứng bệnh lý (n=9): uống nước 0,1 ml/10 g Nhóm uống cao rễ đinh lăng (n=9): T2VO+ uống cao rễ đinh lăng liều tương đương 300 mg dl/kg Nhóm chứng dương (n=9): T2V0+tacrin liều 2,5 mg/kg (i.p) Chuột uống mẫu nghiên cứu/nước tuần trước tiến hành phẫu thuật T2VO suốt trình nghiên cứu Thuốc đối chứng Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 tacrin tiêm phúc mạc 30 phút trước phẫu thuật suốt trình nghiên cứu Phẫu thuật T2VO: Chuột lô uống nước mẫu nghiên cứu liên tục vòng ngày Ngày thứ 7, sau uống mẫu nghiên cứu 1h (với lô tacrin sau tiêm 30 phút), chuột gây mê pentobarbital (liều 50 mg/kg tiêm màng bụng) Sau chuột mê hoàn toàn, tiến hành gây thiếu máu não cục cách bộc lộ kẹp động mạch cảnh 20 phút đồng thời lấy khoảng 0,2 ml máu đuôi chuột (riêng lô sinh lý bộc lộ động mạch không kẹp) Đánh giá tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ tiến hành sau ngày phẫu thuật thử nghiệm nhận diện đồ vật sau 12 ngày phẫu thuật thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến · Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ thử nghiệm nhận dạng đồ vật (Object Recognization Test – ORT) [10] Một ngày trước tiến hành thử nghiệm ORT, chuột làm quen với mơi trường thí nghiệm hộp kích thước 100x100x50 cm Ngày tiếp theo, thử nghiệm ORT tiến hành Thử nghiệm ORT gồm có giai đoạn, bao gồm giai đoạn luyện tập giai đoạn kiểm tra Trong giai đoạn luyện tập, chuột đặt vào hộp có bổ sung thêm đồ vật giống nhau, đặt tên O1 O2 Chuột phép khám phá tự đồ vật phút Giai đoạn kiểm tra tiến hành sau thực giai đoạn luyện tập 30 phút Ở giai đoạn này, hai đồ vật hình trụ thay đồ vật có kích thước hình dáng khác với đồ vật giai đoạn luyện tập, đặt tên O3 Chuột phép khám phá đồ vật phút giống giai đoạn luyện tập Thời gian chuột khám phá đồ vật ghi lại phân tích phần mềm ANY-MAZE (Mỹ) · Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ thử nghiệm mê lộ chữ Y (Y-maze) [11] Mê lộ chữ Y: làm gỗ với cánh A, B, C tạo thành mê cung hình chữ Y, cánh có chiều dài 40 cm, chiều rộng 12 cm phía cm đáy, chiều cao 18 cm để ngăn cánh tay ngăn trung tâm Mê cung đặt phòng kín, có đặt sẵn hình ảnh định hướng khơng gian, hình ảnh 115 www.vanlongco.com khơng thay đổi suốt q trình thí nghiệm Thử nghiệm Y-maze gồm có giai đoạn, bao gồm giai đoạn luyện tập giai đoạn kiểm tra Trong giai đoạn luyện tập, chuột đặt vào mê lộ, cánh mở, cánh cịn lại đóng Chuột phép khám phá tự cánh mở phút Giai đoạn kiểm tra tiến hành sau thực giai đoạn luyện tập 30 phút Ở giai đoạn này, cánh mở Chuột phép khám phá phút giống giai đoạn luyện tập Thời gian chuột khám phá cánh bị đóng giai đoạn kiểm tra phân tích phần mềm ANY-MAZE (Mỹ) 2.2.2 Đánh giá thay đổi mức độ biểu số gen liên quan phản ứng RT-PCR [10]: Sau kết thúc thí nghiệm hành vi, tách vùng vỏ não hồi hải mã, bảo quản -80oC tiến hành thí nghiệm Tách ARN từ hồi hải mã vỏ não dung dịch Trisure (Đức) theo hướng dẫn nhà sản xuất cDNA tổng hợp phản ứng phiên mã ngược bao gồm μg ARN tổng số; 0,4 µM oligo (dT); 160 units M-MLV Transcriptase; units RNase inhibitor tổng phản ứng 20 µl Hỗn hợp phản ứng ủ theo chu trình nhiệt 37oC/1h, 98oC/5 phút trước; 4oC/∞ [12] Phản ứng PCR d ng để khuếch đại gen ChAT, M3 M5 theo quy trình sau: Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: mM mồi, 250 mM dNTPs units Taqpolymerase, đệm chứa 2,5 mM MgCl2 Chu kỳ nhiệt: - Đối với gen β-actin: 94oC/3 phút, 28 chu kỳ bao gồm: 94oC/30 giây, 57oC/1 phút, 72oC/1 phút; 72oC/3 phút; 4oC/∞ - Đối với gen ChAT M3: 94oC/3 phút;35 chu kỳ (đối với gen ChAT) 27 chu kỳ gen M3) bao gồm: 94oC/30 giây, 59oC/1 phút, 72oC/1 phút; 72oC/phút; 4oC/∞ - Đối với gen M5: 94oC/3 phút, 35 chu kỳ bao gồm: 94oC/30 giây, 60oC/1 phút, 72oC/1 phút; 72oC/3 phút; 4oC/∞ Sản phẩm PCR điện di gel polyacrilamid 12% Băng quan sát đèn tử ngoại, chụp ảnh phân tích phần mềm ImageJ 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± SE xử lý thống kê phần mềm SPSS Kết nghiên cứu 3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn rễ đinh lăng mơ hình thiếu máu não cục tạm thời 3.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ thử nghiệm nhận dạng đồ vật: Thử nghiệm nhận dạng đồ vật ORT nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ tạm thời (trí nhớ ngắn hạn khơng liên quan đến vị trí khơng gian) cao cồn rễ đinh lăng Thí nghiệm thực qua giai đoạn luyện tập giai đoạn kiểm tra Thời gian chuột khám phá vật thể O1 O2 giai đoạn luyện tập, O1 O3 giai đoạn kiểm tra thể Hình A- Giai đoạn mẫu B- Giai đoạn kiểm tra 35 Vật 30 Vật Vật * Vật thay đổi 30 25 25 20 * 20 15 * 15 10 10 05 05 00 Sinh lý Bệnh lý Rễ đinh lăng 300 mg/kg 00 Tacrin 2,5 mg/kg Sinh lý T2VO Bệnh lý Rễ đinh lăng 300 mg/kg Tacrin 2,5mg/kg T2VO Hình Tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ cao chiết cồn rễ đinh lăng thử nghiệm ORT A) Giai đoạn mẫu; B) Giai đoạn kiểm tra *p < 0,05; **p < 0,01 so với thời gian khám phá đồ vật giai đoạn kiểm tra 116 Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 www.vanlongco.com Kết Hình cho thấy: ● Ở giai đoạn luyện tập: thời gian khám phá vật thể O1 O2 tất lơ khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) ● Ở giai đoạn kiểm tra: Lô chứng sinh lý: thời gian khám phá đồ vật (O3) lớn (gần gấp lần) so với thời gian khám phá vật thể cũ (O1) khác biệt có ý nghĩa thống kê với (p = 0,032); kết cho thấy lô chuột chứng sinh lý bình thường, đủ điều kiện để dùng cho thử nghiệm Lơ chứng bệnh lý: Khơng có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê thời gian chuột khám phá vật thể O1 O3 Như vậy, áp dụng gây suy giảm trí nhớ mơ hình gây thiếu máu não cục thành công Lô uống cao chiết cồn rễ đinh lăng liều tương đương 300 mg/kg: thời gian khám phá O3 kéo dài so với thời gian khám phá O1 đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,045