Bước đầu nghiên cứu cơ chế hóa sinh và tác dụng của rau đắng biển ( bacopa monnieri (l ) wettst) trên mô hình tự kỷ thực nghiệm gây bowiri muối valproat

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM ANH TÙNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HÓA SINH VÀ TÁC DỤNG CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri (L.) Wettst) TRÊN MƠ HÌNH TỰ KỶ THỰC NGHIỆM GÂY BỞI MUỐI VALPROAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM ANH TÙNG MÃ SINH VIÊN: 1601856 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HÓA SINH VÀ TÁC DỤNG CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri (L.) Wettst) TRÊN MƠ HÌNH TỰ KỶ THỰC NGHIỆM GÂY BỞI MUỐI VALPROAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng PGS.TS Nguyễn Thị Lập Nơi thực hiện: Khoa Dược lý-Sinh hóa Viện Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, Trưởng Khoa Dược lý-Sinh hóa, Viện Dược liệu, người trực tiếp hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lập, Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội, nhận hướng dẫn tơi tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận Kế đến, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến anh chị làm việc Khoa Dược lý-Sinh hóa, Viện Dược liệu, hướng dẫn tận tình tạo điều kiện tốt cho khoảng thời gian làm thực nghiệm Khoa Nhân đây, xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu toàn thể thầy cô trường giảng dạy tận tình tạo điều kiện khoảng thời gian tơi học tập trường để tơi có tảng kiến thức để hồn thành khóa luận hành nghề sau Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè tơi động viên, chia sẻ, ủng hộ chỗ dựa tinh thần vững đường nghiên cứu khoa học Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân cịn hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Phạm Anh Tùng i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỐ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rối loạn phổ tự kỷ 1.1.1 Sơ lược rối loạn phổ tự kỷ 1.1.2 Dịch tễ 1.1.3 Nguyên nhân yếu tố nguy 1.1.4 Vai trò PTEN ASD .5 1.1.5 Dấu hiệu, triệu chứng chẩn đoán 1.1.6 Điều trị 1.1.7 Các mô hình gây tự kỷ đánh giá hành vi động vật 12 1.2 Tổng quan Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst 13 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố .13 1.2.2 Thành phần hóa học Rau đắng biển .14 1.2.3 Công dụng Rau đắng biển 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu .18 2.1.1 Nguồn gốc 18 2.1.2 Cao khô Rau đắng biển .18 2.2 Nguyên vật liệu, trang thiết bị, hóa chất 19 2.2.1 Động vật thí nghiệm 19 2.2.2 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp gây mơ hình chuột tự kỷ thực nghiệm muối natri valproat .23 ii 2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện ASD cao khô Rau đắng biển (BME) 23 2.3.3 Phương pháp đánh giá thay đổi biểu protein PTEN vùng hồi hải mã kỹ thuật Western blot 24 2.3.4 Xử lý số liệu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ 29 3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện suy giảm tương tác xã hội chuột ASD 30 ngày tuổi đánh giá tăng tương tác xã hội qua thử nghiệm ba buồng .29 3.2 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi lặp lại qua thử nghiệm tự chải chuốt 30 3.3 Đánh giá mức độ biểu protein PTEN 31 CHƯƠNG BÀN LUẬN 33 4.1 Về mơ hình nghiên cứu 33 4.1.1 Về lựa chọn mô hình chuột tự kỷ thực nghiệm muối natri valproat 33 4.1.2 Về để lựa chọn mức liều 50 mg/kg cao khô Rau đắng biển .34 4.1.3 Về lựa chọn mơ hình đánh giá hành vi 34 4.1.4 Về lựa chọn protein PTEN để tìm hiểu chế hóa sinh cao khô Rau đắng biển 34 4.2 Về kết nghiên cứu 35 4.2.1 Về tác dụng cải thiện khả tương tác xã hội qua thử nghiệm ba buồng cao khô Rau đắng biển 35 4.2.2 Về tác dụng cải thiện hành vi lặp lại qua thử nghiệm tự chải chuốt cao khô Rau đắng biển 35 4.2.3 Về tác dụng phục hồi mức độ biểu protein PTEN cao khô Rau đắng biển 36 4.3 Điểm nghiên cứu 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt 4EBP1 ABA ADHD Viết đầy đủ theo tiếng Anh Viết đầy đủ theo tiếng Việt Eukaryotic translation initiation Protein gắn yếu tố khởi đầu phiên factor 4E binding protein mã 4E sinh vật nhân chuẩn Applied Behavior Analysis Phân tích hành vi ứng dụng Attention Deficit Hyperactivity Disorder Rối loạn tăng động giảm ý AKT Protein kinase B Enzym protein kinase B APS Ammonium persulfate Ammonium persulfat ASD Autism Spectrum Disorder Rối loạn phổ tự kỷ BME Bacopa monnieri extract Cao khô Rau đắng biển BTBR Black and Tan BRachyury CARS-2 Dịng chuột có protein brachyury có màu lơng đen nâu Childhood Autism Rating ScaleSecond edition Thang đánh giá mức độ tự kỷ CT Computed tomography Chụp cắt lớp vi tính DBS Deep Brain Stimulation Kích thích não sâu Developmental individual- Liệu pháp ngồi sàn dựa mơ difference, relationship- hình quan hệ phát triển cá nhân based/floortime khác biệt DTT 1,4-Dithiothreitol 1,4-Dithiothreitol ECL Enhanced chemiluminescent Phát quang hóa học tăng cường ERK Extracellular Regulated Kinase FDA Food and Drug Administration FOX Forkhead box Yếu tố phiên mã Forkhead Group-based social skills Các can thiệp kỹ xã hội dựa interventions nhóm Guanosine triphosphate Guanosin triphosphate DIR/FT GSSIs GTP iv Kinase điều hịa tín hiệu ngoại bào Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography IRS Insulin Receptor Substrate Cơ chất thụ thể Insulin kDa kilo Dalton kilo Dalton Mitogen-activated Kinase điều hịa protein kích thích protein/Extracellular signal- nguyên phân/kinase điều regulated kinase Kinase hịa tín hiệu ngoại bào Measles, Mumps & Rubella Sởi, quai bị Rubella mammalian Target Of Phức hợp đích Rapamycin Rapamycin Complex động vật có vú 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide diphenyl tetrazolium bromid National Institutes of Health Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ N-methyl-D-aspartate Receptor Thụ thể N-methyl-D-aspartat NPCs Neural Progenitor Cells Nguyên bào thần kinh PBD PIP2 binding domain Miền gắn PIP2 PBS Phosphate Buffered Saline Đệm muối phosphat Post synaptic density protein Miền chung protein post (PSD95), Drosophila disc large synaptic density protein (PSD95), tumor suppressor (Dlg1), and Drosophila disc large tumor Zonula occludens-1 protein (zo- suppressor (Dlg1), zonula 1) occludens-1 protein (zo-1) Proline, glutamic acid, serine, Miền giàu prolin, acid glutamic, threonine serin, threonin MEK MMR mTORC1 MTT NIH NMDAR PDZ PEST Enzym phosphatidylinositol PI3K Phosphatidylinositol kinase PKC Protein Kinase C Enzym protein kinase C PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride Phenylmethylsulfonyl fluorid PSD-95 Postsynaptic density protein 95 Protein mật độ sau synap 95 Phosphatase and tensin homolog Phosphatase tensin tương đồng deleted on chromosome ten bị xóa nhiễm sắc thể 10 PTEN v kinase RAF Rapidly Accelerated Protein xuất ung thư Fibrosarcoma mô liên kết tiến triển nhanh Protein xuất ung thư RAS Rat sarcoma Rheb Ras homolog enriched in brain sarcoma chuột Protein tương đồng Ras làm giàu não RadioImmunoPrecipitation Phân tích kết tủa phóng xạ miễn Assay dịch RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic RTK Receptor Tyrosine Kinase Thụ thể Tyrosine kinase RIPA Sodium Dodecyl SulfateĐiện di gel SDS-PAGE SDS-PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis SEM SHANK Standard Error of Mean Sai số chuẩn SH3 and multiple ankyrin repeat Protein chứa miền SH3 nhiều domains miền ankyrin lặp lại Thắt tạm thời động mạch cảnh T2VO Transient Vessel Occlusion TBS-T Tris-Buffered Saline - Tween TSC Tuberous Sclerosis Complex Phức hợp Tuberous Sclerosis USV UltraSonic Vocalization Phát âm siêu âm VPA Valproic acid Acid valproic vi chung Đệm Tris-Buffered Saline Tween DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc protein PTEN [93] .6 Hình 1.2 Con đường truyền tín hiệu PI3K/AKT/mTOR vai trị PTEN [82] Hình 1.3 Cây Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst 14 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo hỗn hợp bacoside A [81] 15 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo hỗn hợp bacoside B [81] 15 Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị cao khơ Rau đắng biển [48] 18 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 22 Hình 2.3 Sơ đồ mơ tả trình thực nghiệm 22 Hình 3.1 Tác dụng tăng tương tác xã hội BME 29 Hình 3.2 Tác dụng cải thiện hành vi lặp lại cao khô Rau đắng biển 30 Hình 3.3 Sự biểu protein PTEN theo cường độ tín hiệu hóa phát quang thu 31 Hình 3.4 Tỷ lệ tín hiệu PTEN/β-actin lơ chuột 32 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ phần mềm sử dụng cho nghiên cứu .20 Bảng 2.3 Bố trí định lượng protein tổng số .25 Bảng 3.1 Kết thử nghiệm ba buồng 29 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm tự chải chuốt 30 Bảng 3.3 Kết mức độ biểu protein PTEN 31 viii ... ANH TÙNG MÃ SINH VIÊN: 1601856 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HÓA SINH VÀ TÁC DỤNG CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri (L. ) Wettst) TRÊN MƠ HÌNH TỰ KỶ THỰC NGHIỆM GÂY BỞI MUỐI VALPROAT KHÓA LUẬN TỐT... thực nghiệm Chính vậy, để tìm hiểu thêm tác dụng chế hóa sinh Rau đắng biển mở triển vọng phòng ngừa điều trị ASD, đề tài ? ?Bước đầu nghiên cứu chế hóa sinh tác dụng rau đắng biển (Bacopa monnieri. .. monnieri (L. ) Wettst) mơ hình tự kỷ thực nghiệm gây muối valproat? ?? tiến hành với hai mục tiêu sau: Đánh giá tác dụng cải thiện số hành vi thần kinh cao khô Rau đắng biển mô hình chuột nhắt trắng tự kỷ