NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ CỦA CÂY RAU ĐẮNG BIỂN BACOPA MONNIERI (LINN) WETTST TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM MANG BỆNH ALZHEIMER

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sự hình thành amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào 7 Hình 1.2 Sự hình thành đám rối thần kinh 9 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các chất ức chế cholinesteras

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÍ THỊ TUYẾT NHUNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ CỦA CÂY RAU ĐẮNG BIỂN

BACOPA MONNIERI (LINN) WETTST

TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM MANG BỆNH ALZHEIMER

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÍ THỊ TUYẾT NHUNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ CỦA CÂY RAU ĐẮNG BIỂN

BACOPA MONNIERI (LINN) WETTST

TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM MANG BỆNH ALZHEIMER

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 8720208

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng

PGS.TS Nguyễn Thị Lập

HÀ NỘI 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ chân tình, sự động viên khích lệ từ nhiều tập thể, nhiều Quý thầy cô giáo, đồng nghiệp cùng bạn bè và gia đình

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS Phạm Thị Nguyệt Hằng và PGS.TS Nguyễn Thị Lập, những người thầy tâm huyết đã định

hướng và tận tình hướng dẫn cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Tiếp theo, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Bộ môn Hóa sinh, phòng Sau Đại học – Trường Đại học Dược Hà Nội, khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Truyền, Ban chủ nhiệm

khoa, các thầy cô giáo, đồng nghiệp trong khoa Dược – Trường Đại học Kinh Doanh

và Công Nghệ Hà Nội đã tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình học tập, giúp tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng là lời tri ân sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến người thân, gia đình đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, luận văn này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè

để luận văn được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Phí Thị Tuyết Nhung

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 7

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Dịch tễ 3

1.1.3 Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di truyền học 4

1.1.4 Yếu tố nguy cơ và yếu tố bảo vệ 5

1.1.5 Cơ chế bệnh sinh 6

1.1.6 Đặc điểm lâm sàng 10

1.1.7 Thuốc điều trị 11

1.2 Tổng quan về cây rau đắng biển 20

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây rau đắng biển 20

1.2.2 Bộ phận dùng 21

1.2.3 Thành phần hóa học 21

1.2.4 Tác dụng dược lý 23

Phần 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen APP mang bệnh Alzheimer 30

2.2.2 Đánh giá tác dụng của cao tiêu chuẩn chứa 30% bacoside từ rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst) trên mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer bằng thử nghiệm hành vi 32

2.2.2.1 Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm 32

2.2.2.2 Đánh giá trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm 33

2.2.2.3 Đánh giá khả năng sống sót của ruồi trưởng thành 34

2.2.3 Tìm hiểu cơ chế tác dụng của cây rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn) Wettst thông qua việc đánh giá mức độ biểu hiện của protein APP bằng kỹ thuật Western Blot 35

Phần 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1 Đánh giá tác dụng của cao tiêu chuẩn chứa 30% bacoside từ rau đắng

biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst) trên mô hình ruồi giấm mang bệnh

Alzheimer bằng thử nghiệm hành vi 40

3.1.1 Đánh giá khả năng vận động ruồi giấm 40

3.1.2 Đánh giá trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm 42

3.1.3 Đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành 44

3.2 Tìm hiểu cơ chế tác dụng của cây rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn) Wettst thông qua việc đánh giá mức độ biểu hiện của protein tiền chất amyloid (Amyloid precusor protein –APP) trong não ruồi giấm 45

Phần 4 BÀN LUẬN 47

4.1 Về mô hình nghiên cứu 47

4.1.1 Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer 47

4.1.2 Về việc lựa chọn Amyloid precusor protein 48

4.1 Về kết quả nghiên cứu 47

4.2.1 Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm 49

4.2.2 Đánh giá trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm 49

4.2.3 Đánh giá khả năng sống sót ruồi giấm trưởng thành 51

4.2.4 Tìm hiểu cơ chế tác dụng của cây rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn) Wettst thông qua việc đánh giá mức độ biểu hiện của protein tiền chất amyloid APP 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT Viết tắt Viết đầy đủ theo Tiếng

1 AA Alzheimer's Association Hiệp hội Alzheimer

7 APP Amyloid precursor protein Protein tiền chất amyloid

Viện Lão khoa Quốc gia Hoa

Kỳ

17 OBX Olfactory bulbectomized

Phẫu thuật loại bỏ vùng khứu giác

Peroxisom prolifrator activated receptor γ

20 PVDF Polyvinyllidene difluoride

22 SDS Sodium dodecyl sulphate

23

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis

24 TBS Tris buffer saline

Bảng 2.4 Dung dịch gel, running buffer và transfer buffer 37

Bảng 2.5 Thành phần của Lower gel, upper gel 38

Bảng 3 Mức độ biểu hiện protein ở các nhóm ruồi 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sự hình thành amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào 7

Hình 1.2 Sự hình thành đám rối thần kinh 9

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các chất ức chế cholinesterase 11

Hình 1.4 Rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn ) 20

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất saponin từ rau đắng biển 27

Hình 2.3 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen APP mang bệnh

Alzheimer

31

Hình 2.4 Mô hình đánh giá trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm 34

Hình 2.5 Mô hình đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm 35

Hình 3.1 Tốc độ di chuyển của ấu trùng ruồi giấm ở các nhóm sử

dụng các cao chiết RĐB so với nhóm bệnh lý Các nhóm RĐB4, RĐB6 sử dụng cao chiết RĐB với nồng độ tương ứng 4 mg/ml và 6 mg/ml,**p<0,01 so với nhóm bệnh lý

40

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện điểm leo trèo trung bình của các nhóm

ruồi sau khi nở được 3 ngày và 7 ngày, *p<0,05 khi so sánh với nhóm bệnh lý

41

Hình 3.3-A Giá trị PREF AM kết hợp với phần thưởng Giá trị được

biểu diễn với giá trị trung vị là đường thẳng ở giữa các hộp (n=25, lặp lại 6 lần, tổng cỡ mẫu N=150)

42

Hình 3.3-B Giá trị PREF OCT kết hợp với phần thưởng Giá trị được

biểu diễn với giá trị trung vị là đường thẳng ở giữa các hộp (n=25, lặp lại 6 lần, tổng cỡ mẫu N=150)

43

Hình 3.3-C Chỉ số học tập LI được tính theo giá trị PREF AM và

PREF OCT, *p<0,05 so với nhóm bệnh lý

43

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ sống sót của ruồi theo ngày 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.5 Cường độ tín hiệu hóa phát quang thu được 45

Hình 3.6 So sánh mức độ biểu hiện APP ở các nhóm ruồi, *p<0,05

khi so sánh với nhóm bệnh lý

46

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Alzheimer là bệnh đặc trưng bởi triệu chứng suy giảm trí nhớ và chức năng nhận thức và là thể bệnh nặng nhất trong nhóm các bệnh sa sút tâm thần (còn gọi là sa sút trí tuệ, sa sút tâm trí) hiện nay, là mối quan tâm hàng đầu của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở nước ta, khi tuổi thọ trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh này ngày càng nhiều Bệnh cho đến nay, có tiên lượng nói chung là xấu, gây nhiều khó khăn, đau khổ cho người bệnh, cho gia đình họ và cả cộng đồng xã hội [6] Theo số liệu thống kê của Hiệp hội Alzheimer thế giới 2015, tỷ lệ mắc Alzheimer tăng dần theo tuổi, từ khoảng 5% của người dưới 75 tuổi lên đến 40-50% của người sau 85 tuổi Bệnh Alzheimer luôn đi kèm với một khoản ngân sách điều trị khổng lồ và một gánh nặng về thể chất cũng như tinh thần lên bệnh nhân và người thân của họ [2], [5], [48]

Các thuốc điều trị Alzheimer gồm các thuốc chính là: thuốc ức chế cholinesterase, thuốc đối kháng trên recepter N-methyl D- aspartat (NMDA), thuốc tác dụng trên amyloid bệnh lý Các thuốc này đều có giá thành cao và nhiều tác dụng không mong muốn Vì vậy, nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ và điều trị bệnh Alzheimer là rất cần thiết

Rau đắng biển, có tên khoa học là Bacopa monnieri (Linn) Wettst là cây thuốc

được sử dụng trong Y học cổ truyền Ấn Độ làm thuốc bổ thần kinh, tăng cường trí nhớ, trị bệnh động kinh [1], [7] Ở Việt Nam, cây rau đắng biển mọc hoang dại ở nhiều nơi, được người dân sử dụng làm rau ăn hàng ngày và điều trị một số bệnh như suy nhược thần kinh, động kinh, mất trương lực cơ theo kinh nghiệm dân gian Việc nghiên cứu tác dụng trên trí nhớ, khả năng học tập của cây rau đắng biển đã được nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam [4], [8] Có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rau đắng biển có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ, nhận thức bằng các mô hình gây suy giảm trí nhớ trên chuột bởi ion Ethylcholin aziridinium, colchicine, ALCL3 và trên chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer (chuột PSAPP) Ở Việt Nam, cây rau đắng biển cũng đã được nghiên cứu rất kỹ về tác dụng ngăn chặn/cải thiên suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của nó trên mô hình chuột bị gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamine, mô hình chuột bị Alzheimer Hướng

2

nghiên cứu trên ruồi giấm đang được quan tâm, tuy nhiên ở Việt Nam mô hình ruồi giấm vẫn chưa được triển khai Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác

dụng và bước đầu tìm hiểu cơ chế của cây rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn)

Wettst trên mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer” nhằm cung cấp thêm bằng chứng về tác dụng của cây rau đắng biển trên mô hình ruồi giấm

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Đánh giá được tác dụng của cao tiêu chuẩn chứa 30% bacoside từ rau đắng

biển Bacopa monnieri (Linn) Wettst trên mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer

2 Tìm hiểu được cơ chế của cao tiêu chuẩn chứa 30% bacoside từ rau đắng biển

Bacopa monnieri (Linn) Wettst thông qua mức độ biểu hiện của protein tiền chất

amyloid (Amyloid precusor protein - APP)

sử dụng để đặc trưng cho một sự suy giảm quá trình về nhận thức (ngôn ngữ, trí nhớ, cảm xúc, nhân cách, nhận thức) dẫn đến suy giảm các hoạt động nghề nghiệp, xã hội

mà trước đó vẫn diễn ra bình thường

1.1.2 Dịch tễ

Sau hơn 1 thập kỷ phát hiện, Alzheimer đã trở thành một bệnh lý rất phổ biến

trong nhóm bệnh sa sút trí tuệ Con số bệnh nhân được báo cáo có xu hướng tăng lên nhanh chóng trong hơn 1 thập kỷ qua

Theo số liệu thống kê của Hiệp hội Alzheimer thế giới 2015, tỷ lệ mắc Alzheimer tăng dần theo tuổi, từ khoảng 5% của người dưới 75 tuổi lên đến 40-50% của người sau 85 tuổi Bệnh Alzheimer luôn đi kèm với một khoản ngân sách điều trị khổng lồ và một gánh nặng về thể chất cũng như tinh thần lên bệnh nhân và người thân của họ [5], [48], [57]

Dân tộc: Các dân tộc khác nhau có tỷ lệ mắc bệnh cũng khác nhau Người da trắng ít mắc bệnh hơn người Mỹ gốc Phi hoặc Tây Ban Nha Người châu Á cũng ít mắc bệnh hơn những người ở nơi khác Một số quan điểm còn cho rằng bệnh chịu ảnh hưởng của yếu tố môi trường Ví dụ: người Nhật sống tại Mỹ có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn người Nhật sống tại Nhật [5], [57]

Tăng huyết áp tâm thu và tăng cholesterol máu sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer hơn những người bình thường [5]

Hội chứng Down: Người bị hội chứng này sẽ bị Alzheimer khi sống đến 40 tuổi

và những bà mẹ sinh con bị Down sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer [5]

Việt Nam có hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer [6]

4

1.1.3 Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di truyền học

Nguyên nhân chính xác của bệnh Alzheimer còn chưa nghiên cứu được, nhưng

một số yếu tố di truyền và môi trường được xác định gây ra bệnh Alzheimer chiếm khoảng dưới 1% số trường hợp Các trường hợp Alzheimer khởi phát sớm có liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể số 1, 14 hoặc 21, trong đó đa số các trường hợp do đột biến một gen sản xuất perseniline 1 trên nhiễm sắc thể 14 Ngoài ra còn có perseniline 2 có cấu trúc tương tự perseniline 1 được sản xuất bởi gen trên nhiễm sắc thể số 1 Cả 2 protein này đều mã hóa cho protein màng tế bào tham gia quá trình hình thành protein tiền chất amyloid (APP) Các nhà khoa học đã xác định được hơn 160 đột biến trong các gen perseniline làm giảm hoạt động của γ-secretase, hình thành Aβ APP được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể số 21 và chỉ số ít trường hợp khởi phát sớm liên quan đến đột biến gen mã hóa cho APP [70]

Các trường hợp Alzheimer khởi phát muộn chủ yếu liên quan đến Apolipoprotein E (ApoE) Có 3 loại ApoE là ApoE2, ApoE3, ApoE4 trong đó ApoE4 đóng vai trò nhiều trong Alzheimer khởi phát muộn thông qua kết hợp với các yếu tố nguy cơ khác như bất thường ty lạp thể, rối loạn chức năng thành tế bào và tiêu thụ glucose kém Nguy cơ mắc bệnh Alzheimer cao gấp 3 lần ở người có 1 ApoE4 và cao gấp 12 lần ở người có 2 ApoE4 so với người không có ApoE [9][70]

Ngoài các nguyên nhân trên, còn một số yếu tố khác dẫn đến hình thành Alzheimer:

Yếu tố nhiễm độc nhôm: tình trạng nhiễm độc nhôm dường như có liên quan đến sự tăng lắng đọng protein Aβ và số lượng các đám rối sợi thần kinh trung ương não bệnh nhân Alzheimer [5]

Yếu tố nhiễm trùng (virus chậm) giống như bệnh creutzfeld-Jakob [5]

Các rối loạn chuyển hóa: phản ứng oxy hóa quá mức dẫn đến tăng các gốc tự

do Các gốc tự do này được cho là có liên quan đến sự kết hợp và tăng lắng đọng protein Aβ gây chết tế bào thần kinh Sự giảm lưu lượng máu não, rối loạn sinh tổng hợp các yếu tố dinh dưỡng thần kinh cũng được giả định là có vai trò trong cơ chế gây bệnh Alzheimer[5]

5

1.1.4 Yếu tố nguy cơ và yếu tố bảo vệ

1.1.4.1 Yếu tố nguy cơ

Bệnh mạch máu não gồm nhồi máu xuất huyết (hemorrhagic infarcts), nhồi

máu thiếu máu (ischemic infarcts), viêm mạch máu (vasculopathies) và thay đổi chất trắng (white matter changes) làm tăng nguy cơ sa sút trí tuệ

Tăng huyết áp (40-60 tuổi) làm tăng nguy cơ suy giảm nhận thức giai đoạn cuối Tuy nhiên, tuổi càng cao nguy cơ này càng giảm

Đái tháo đường typ II tăng gần gấp đôi nguy cơ Alzheimer

Cân nặng cơ thể quá cao hoặc quá thấp đều làm tăng nguy cơ suy giảm nhận thức và Alzheimer

Nồng độ lipid máu, hội chứng chuyển hóa, hút thuốc lá và chấn thương sọ não

có thể làm tăng hoặc giảm nguy cơ sa sút trí tuệ với các bằng chứng ở nhiều nghiên cứu khác nhau [57]

Tiền sử gia đình có người bị bệnh Alzheimer: Các thành viên trong gia đình này

có thể mang những biến đổi di truyền đã được xác định rõ (ở nhiễm sắc thể 21, 14,1 ) hoặc mang các kiểu gen làm tăng cơ địa dễ bị bệnh như ApoE4 Tần số xuất hiện bệnh là 50% trong số con các bệnh nhân Alzheimer – cao gấp 4 lần so với những người không có tiền sử gia đình bị bệnh này [5]

Tuổi là yếu tố nguy cơ rất lớn với bệnh Alzheimer Ở người trên 60 tuổi, cả tỷ

lệ mắc chung và tỷ lệ mới mắc bệnh Alzheimer cứ sau 5 năm lại tăng lên gấp đôi: Ở nhóm tuổi 65-69 số người bị bệnh là 2%, ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40% [13]

Giới: Nhiều tác giả cho là phụ nữ thường sống lâu hơn so với nam giới, do vậy phụ nữ có thể được thấy nhiều hơn trong quần thể các bệnh nhân Alzheimer [5]

1.1.4.2 Yếu tố bảo vệ

Chế độ ăn nhiều rau, cá, ít thịt với dầu oliu là nguồn cung cấp chất béo chính

cùng lượng vừa phải rượu vang làm giảm nguy cơ mắc Alzheimer và sa sút trí tuệ Ngoài ra, việc cung cấp caroten, vitamin C, vitamin E làm giảm nguy cơ suy giảm nhận thức vẫn còn nhiều tranh cãi

ta đã đưa ra 1 giả thuyết để liên kết vai trò của tất cả các thành tố cơ bản trong bệnh nguyên, đó là giả thuyết Beta amyloid [3]

Giả thuyết Beta amyloid:

β - amyloid peptide (βAP) là những sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa bao gồm 36-43 acid amin, βAP42 ít phổ biến hơn so với các βAP nhưng lại dễ bị kết

tụ và hình thành mảng bám Sự mất cân bằng giữa sản xuất, thanh thải của các peptide làm cho các βAP dư thừa tích lũy và kết tụ lại gây độc cho tế bào Giả thuyết chỉ ra sự tích tụ β-amyloid peptid (βAP) được coi là độc tố làm ngăn cản quá trình cân bằng ion calci, ức chế chức năng của một số enzyme và khả năng sử dụng glucose của tế bào thần kinh đồng thời kích hoạt sự chết theo chương trình (apoptosis) [10], [21] Người

ta vẫn chưa biết chính xác sự biến đổi trong việc sản xuất βAP đến mức độ nào thì gây

ra suy giảm trí nhớ

Hơn 50 đột biến khác nhau trong gen APP có thể gây ra bệnh Alzheimer khởi

phát sớm, bắt đầu trước tuổi 65 Những đột biến này chịu trách nhiệm cho ít hơn 10 phần trăm của tất cả các trường hợp khởi phát sớm [31]

Biến đổi APP phổ biến nhất thay đổi một trong các acid amin của protein tiền chất amyloid Đột biến này thay thế valine bằng isoleucine ở vị trí protein 717

(Val717Ile hoặc V717I) Các đột biến trong gen APP có thể dẫn đến tăng lượng

amyloid β peptide hoặc tạo ra một dạng peptide dài hơn và dính hơn Khi những mảnh protein này được giải phóng khỏi tế bào, chúng có thể tích tụ trong não và tạo thành các khối gọi là mảng amyloid Những mảng này là đặc trưng của bệnh Alzheimer Sự tích tụ các mảng amyloid β peptide và amyloid độc hại có thể dẫn đến cái chết của tế bào thần kinh và các dấu hiệu và triệu chứng tiến triển của chứng rối loạn này [31]

Aβ

APP

C99 C83

Màng tế bào

và C99 Các sản phẩm C83 và C99 này bị cắt một lần nữa nhờ γ-secretase (γ-secretase

là một phức hợp đa enzyme có chứa preseniline 1,2 Đột biến preseniline được tìm thấy ở bệnh nhân Alzheimer sớm có tính chất gia đình) Riêng với C99 dưới tác dụng của γ-secretase sẽ tạo thành hai phân đoạn không hòa tan Amyloid β 40 (βAP40) và Amyloid β 42 (βAP42) βAP42 có tính chất độc hơn và nhiều hơn βAP40 Các monomer này trải qua một sự thay đổi đáng kể về cấu hình ở nồng độ cao để hình thành cấu trúc bậc ba của dạng monomer Những monomer này sau đó kết hợp lại thành các oligomer (là dimer hoặc trimer), chúng dường như là các chất độc thần kinh, không hòa tan xung quanh các tế bào thần kinh và dần dần thành các mảng beta

amyloid (hình 1.1) [10], [16], [21]

Ngoài beta amyloid, mảnh protein tiền chất vùng nội bào (fragment: amyloid precursor protein intracellular domain – AICD) cũng có tác dụng phá vỡ sự truyền tin giữa các neuron trong quá trình tiến triển của bệnh Alzheimer [10], [16], [21]

*Các giả thuyết khác

Giả thuyết đám rối thần kinh (Neurofibrilary Tangles - NFTs)

Đám rối thần kinh - NFTs thường được tìm thấy trong các tế bào vùng hải mã và

vỏ não ở người bệnh Alzheimer NFTs được hình thành từ protein tau phosphoryl hóa bất thường Protein tau có vai trò ổn định cấu trúc vi ống, giúp hệ thống vi ống thực hiện chức năng nâng đỡ tế bào, chức năng vận chuyển và vận động tế bào chất Khi sợi tau bị phosphoryl hóa bất thường tại một vị trí cụ thể, chúng không thể liên kết một cách hiệu quả với các vi ống làm chức năng của chúng bị gián đoạn dẫn tới gây chết tế bào Mật độ của các NFTs tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh mất trí nhớ

9

bởi chúng là một dấu hiệu về sự chết đi của các tế bào thần kinh NFTs cũng được tìm thấy trong bệnh sa sút trí tuệ khác ngoài bệnh Alzheimer [10], [21]

Hình 1.1: Sự hình thành đám rối thần kinh [10]

Giả thuyết cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác

Rối loạn chức năng và thoái hóa tế bào lan tỏa dẫn đến một loạt các khiếm

khuyết dẫn truyền thần kinh, trong đó, các bất thường trên hệ cholinergic là nổi bật nhất Sự mất hoạt động của hệ cholinergic tương quan thuận với mức độ nghiêm trọng của bệnh Alzheimer Vào giai đoạn muộn của bệnh Alzheimer, số lượng các tế bào thần kinh cholinergic và số lượng các thụ thể nicotinic trong vùng hải mã và vỏ não giảm xuống Thụ thể nicotinic trước synap có vai trò kiểm soát việc giải phóng của acetylcholin, cũng như các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng khác cho bộ nhớ và tâm trạng, bao gồm: glutamat, serotonin và norepinephrin Giả thuyết cholinergic lý giải việc mất tế bào cholinergic là nguyên nhân suy giảm nhận thức trong bệnh Alzheimer, do đó, việc tăng chức năng hệ cholinergic có thể cải thiện triệu chứng mất trí nhớ [10], [21]

Giả thuyết apolipoprotein E

Những nghiên cứu đã tìm thấy nhiều mối liên hệ giữa cholesterol và sự xuất hiện của bệnh Alzheimer Apolipoprotein E là một lipoprotein có nhiệm vụ vận chuyển cholesterol trong não ApoE4 có liên quan đến tăng tính lắng đọng của βAP và

Vi ống

Vi ống mất ổn định

Protein TAU phosphoryl hóa

Đám rối thần kinh

10

được cho là đóng vai trò như một chất điều hòa thúc đẩy trong quá trình bệnh sa sút trí tuệ Cholesterol được vận chuyển bằng LDL vào tế bào thần kinh và liên kết với NFTs Mức cholesterol cao trong tế bào thần kinh não có thể làm thay đổi chức năng màng tế bào, dẫn đến hình thành các βAP và các mảng bám [10], [21]

Các chất trung gian gây viêm

Giả thuyết cho rằng, khi βAP tích tụ, các thực bào tiểu thần kinh đệm (microglia) được kích hoạt và tăng cường phản ứng của các tế bào hình sao với các mảng bám Các thực bào tiểu thần kinh đệm làm giảm βAP bằng cơ chế thực bào Các

tế bào hình sao đưa βAP vào tế bào chất gián tiếp qua receptor và vận chuyển βAP vào tuần hoàn chung, do đó cũng làm giảm βAP Tuy nhiên, việc kích hoạt mạn tính các tiểu thần kinh đệm dẫn tới giải phóng các cytokin như interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử u (TNF-α), nitric oxyd, làm tổn thương các tế bào thần kinh và thúc đẩy quá trình viêm liên tục Trên thực tế, nhiều cytokin và chemokin tăng lên trong não bệnh nhân Alzheimer, và một số kiểu đa hình gen tiền viêm được báo cáo là có liên quan với bệnh Alzheimer [10], [21]

1.1.6 Đặc điểm lâm sàng

Sự bắt đầu của bệnh thường rất từ từ nên thường khó có thể ghi nhận được chính xác thời gian khởi bệnh Tiến triển chậm do vậy bệnh nhân vẫn duy trì được năng lực xã hội cho đến giai đoạn toàn phát

Bệnh cảnh lâm sàng là một hội chứng sa sút trí tuệ điển hình và tiến triển của bệnh có thể được chia thành 3 giai đoạn chính sau:

*Giai đoạn 1

Thường kéo dài 2-3 năm, được đặc trưng bởi các triệu chứng:

- Suy giảm trí nhớ

- Giảm hiệu suất trong việc giải quyết các công việc thường ngày

- Rối loạn định hướng không gian

- Có thể có các rối loạn khí sắc rõ rệt dẫn đến trạng thái bất an, bồn chồn, đứng ngồi không yên, dễ bị kích thích, hoặc ngược lại dẫn đến bàng quan, sững sờ, trầm cảm từ giai đoạn sớm của bệnh [5]

*Giai đoạn 2

- Giai đoạn cuối cùng: Bệnh nhân có thể nằm liệt giường, rối loạn đại tiểu tiện, các triệu chứng loạn thần (hoang tưởng, ảo giác ) thường xuất hiện rõ rệt trong bệnh cảnh lâm sàng

- Có thể xuất hiện các rối loạn thần kinh như liệt nhẹ nửa người co cứng, bệnh nhân nằm co quắp, run tay chân, có các phản xạ như nắm, mút

- Các cơn động kinh toàn thể (cơn lớn) gặp trong nhiều trường hợp

- Sút cân nhanh chóng, mặc dù vẫn duy trì ăn ngon miệng [5]

1.1.7 Thuốc điều trị

1.1.8.1 Chất ức chế cholinesterase

Acetylcholin là một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng cho quá trình ghi nhớ

và học hỏi Chất ức chế cholinesterase giúp ngăn ngừa sự giảm nồng độ acetylcholin Bằng cách giữ cho nồng độ acetylcholin ở mức cao, những loại thuốc này sẽ hỗ trợ cho quá trình truyền tín hiệu giữa các tế bào thần kinh

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của các chất ức chế cholinesterase

Trong số các chất ức chế cholinesterase, Tacrin là thuốc đầu tiên được sử dụng

để điều trị Alzheimer, tuy nhiên do có nhiều tác dụng phụ trên gan nên hiện nay không còn được sử dụng [5]

12

Vào đầu những năm 1980, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu đánh giá phương pháp ức chế quá trình thủy phân acetylcholin thông qua sự ức chế có hồi phục cholinesterase để tăng cường hoạt động của hệ cholinergic ở bệnh nhân Alzheimer [28]

Cho tới nay, thuốc kháng enzym cholinesterase được xem là nhóm thuốc chính trong điều trị Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác, nhóm thuốc này đã được chứng minh là có hiệu quả hơn placebo trong việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác khi được sử dụng ở giai đoạn bệnh nhẹ hay trung bình (10-24 điểm MMSE), tuy nhiên các thuốc này không ngăn chặn được diễn tiến tự nhiên của bệnh [3], [49]

1.1.7.2 Chất đối kháng trên receptor NMDA

Nhóm này có memantin là thuốc đối kháng không cạnh tranh trên thụ thể methyl D- aspartat (NMDA) của hệ thống glutamat với ái lực vừa phải, do có hiện tượng tăng hoạt hóa thụ thể NMDA làm tổn thương các neuron thần kinh trong các bệnh lý thoái hóa thần kinh Việc sản xuất glutamat quá mức khiến các receptor NMDA hoạt động quá mức, gây tăng nhập calci vào tế bào, dẫn đến trạng thái kích thích do nhiễm độc (excitotoxicity) có liên quan đến suy giảm trí nhớ trong AD Do phụ thuộc vào điện thế và có động lực học nhanh nên memantin giảm ức chế receptor NMDA ở lượng glutamat sinh lý và tăng ức chế receptor này ở lượng glutamat bệnh

N-lý, do đó cải thiện trí nhớ và chức năng nhận thức [28]

Năm 2002, memantin lần đầu tiên được chấp thuận ở châu Âu để điều trị bệnh Alzheimer mức độ nặng và đến năm 2005, được dùng để điều trị cả Alzheimer mức

độ vừa và nặng Năm 2003, memantin được phòng thí nghiệm lâm sàng (Forest Laboratories) cấp phép lưu hành ở Hoa Kỳ Các bằng chứng cho thấy mematin cải thiện đáng kể chức năng nhận thức, hành vi và các hoạt động hằng ngày ở bệnh nhân Alzheimer mức độ vừa và nặng [28]

1.1.7.3 Các chất tác dụng dinh dưỡng thần kinh

Cerebrolysin được cấp phép cho điều trị Alzheimer và các thể sa sút trí tuệ khác

ở nhiều quốc gia châu Âu và châu Á Cerebrolysin là hợp chất chứa các peptide nhỏ và acid amin đơn có thể vượt qua hàng rào máu não, được sản xuất từ protein não tinh

1.1.7.4 Các chất tác dụng trên Amyloid bệnh lý

Tuy dòng thác amyloid (amyloid cascade) là một trọng tâm nghiên cứu trong điều trị suy giảm trí nhớ nhưng đến nay vẫn chưa có thuốc đối kháng amyloid nào được phê duyệt, mặc dù nhiều chất đang ở pha cuối thử nghiệm lâm sàng [28]

- Giảm sản xuất Aβ:

+ Ức chế secretase: Amyloid được hoạt hóa bởi secretase hoặc enzym

β-site APP-cleaving 1 (BACE1) Nhóm thiazolidindion trong điều trị đái tháo đường typ

2 gồm rosiglitazon và pioglitazon được sử dụng chủ yếu đề điều chỉnh chuyển hóa glucose và lipid, cũng có thể ức chế β-secretase và tiền chất amyloid (APP) thông qua kích thích peroxisom prolifrator activated receptor γ (PPARγ) hạt nhân [28]

Những ảnh hưởng của rosiglitazon trên nhận thức đã bước đầu được nghiên cứu

và thử nghiệm ở pha II Mặc dù khuyến cáo thực hiện những thử nghiệm lớn hơn để tiếp tục kiểm tra hiệu quả của pioglitazon trong giai đoạn đầu Alzheimer, nhưng vẫn chưa có thử nghiệm pha III nào cho các chất ức chế β-secretase [28]

+ Ức chế γ-secretase: Tác động của γ-secretase lên β-secretase trong quá trình

phân cắt protein APP là bước cuối cùng trong sản xuất Aβ Semagacestat là chất ức chế γ-secretase duy nhất được nghiên cứu trong điều trị Alzheimer, có tác dụng giảm sản xuất Aβ ở hệ thần kinh trung ương phụ thuộc liều [23]

+ Hoạt hóa α-secretase: α-secretase là enzym cạnh tranh với β-secretase trong

phân cắt APP, hoạt hóa con đường không amyloid tạo ra các sản phẩm hòa tan có tác dụng bảo vệ thần kinh, cải thiện trí nhớ và giảm sự chết tế bào (anti-apotosis) Một số chất ảnh hưởng lên hoạt động của α-secretase thông qua các chất dẫn truyền thần kinh khác (glutamat, serotonin), hormon (estrogen, testosteron) và các statin đã được

14

nghiên cứu Tuy nhiên, hiện tại chưa có chất tác động lên α-secretase nào được thử

nghiệm pha III [28]

- Giảm kết tập Aβ:

Gần đây, các oligome tan được (soluble oligomer) của Aβ được biết tới có mối liên hệ chặt chẽ với độc tính trên thần kinh và synap hơn so với các sợi fibrin Aβ Các chất ức chế kết tập hoặc làm mất ổn định của oligome Aβ có thể làm thay đổi triệu chứng bệnh Liệu pháp này có thể kiểm soát các monomer để làm giảm sự hình thành các oligome và các mảng bám lão hóa(senile plaque) [28]

Trong các nghiên cứu tiền lâm sàng, tramiprosat (acid 3-amino-1- propanesulfonic (3APS) làm giảm mảng bám trong não chuột và huyết tương qua tương tác với βA40 và βA42 để hạn chế những thay đổi cấu trúc cần thiết cho oligome

và sản phẩm fibrin Mặc dù không có sự khác biệt đáng kể theo thang điểm đánh giá suy giảm nhận thức, nhưng một phân tích thăm dò của mỗi mục trong thang này cho thấy bộ nhớ, ngôn ngữ và kỹ năng thực hành được cải thiện Tuy đã được đưa ra thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng, nhưng các thử nghiệm lâm sàng đối với tramiprosat sau đó đã dừng lại [28]

Flavonoid epigallocatechin gallat (EGCG) là polyphenol chính của trà xanh, có

ái lực mạnh với βA42và có tác dụng bảo vệ thần kinh khỏi độc tính của Aβvà giảm lắng đọng tau trên mô hình chuột lành chuyển gen (transgenic mice model) của AD [28]

Một chất ức chế kết tập khác là PBT-2, làm ức chế quá trình oligome hóa qua trung gian kim loại (metal-mediated oligomerization), trong thử nghiệm pha II cho kết quả cải thiện đáng kể chức năng điều hành của não (executive function) nhưng không làm cải thiện nhận thức theo thang điểm đánh giá Một số chất chống kết tập khác như ELND-005 (scyllo inositol) và clioquinol bước đầu được thử nghiệm nhưng vẫn chưa được tiến hành thử nghiệm pha III [28]

- Tăng thải trừ Aβ:

Loại bỏ độc tính của Aβ thông qua đáp ứng miễn dịch làm giảm bớt những tác động có hại của Alzheimer với 4 cơ chế chính: (i) liên kết kháng thể và thực bào nhờ

tế bào tiểu thần kinh đệm microglia; (ii) trực tiếp hòa tan thông qua sự gián đoạn của

15

Aβ; (iii) chiết tách hòa tan từ hệ thần kinh trung ương bởi kháng thể trong huyết tương; (iv) liên kết kháng thể để ức chế oligome gây độc tính mà không ảnh hưởng tới amyloid Bapineuzumab và Solanezumab đang được nghiên cứu với cơ chế tạo ra kháng thể trung gian giải phóng Aβ [28]

1.1.7.5 Chất tác dụng trên protein tau bệnh lý

Tau là một protein liên kết với tubulin để ổn định cấu trúc vi ống sợi trục, đóng vai trò quan trọng trong bệnh Alzheimer Các protein tau tách ra khỏi vi ống khiến quá trình phosphoryl hóa bất thường, các vi ống xoắn lại hình thành các đám rối thần kinh

Vì suy giảm nhận thức liên quan đến đám rối thần kinh nên thoái hóa thần kinh có thể

do thiếu sự bảo vệ cấu trúc khung tế bào và sự tích lũy gây độc sợi thần kinh Ức chế quá trình phosphoryl hóa tau và tháo rối sợi thần kinh là 2 chiến lược trong phương pháp điều trị bệnh [28]

Nhóm này có Lithiumand valproat và methylthioninium chlorid (xanh methylen)

1.1.7.6 Thuốc chống viêm

Các chất gây viêm như cytokin và COX-2 có liên quan đến mảng bám và đám rối tìm thấy trong Alzheimer Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy NSAIDS có tác dụng bảo vệ và làm giảm tỷ lệ hiện mắc Alzheimer Tuy nhiên, thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả điều trị Alzheimer của các thuốc chống viêm không thành công [24]

1.1.7.7 Cải thiện chức năng ty thể

Rối loạn chức năng ty thể có thể xảy ra ở bệnh nhân Alzheimer giai đoạn sớm, dẫn đến sự chết tế bào (apoptosis) và tổn thương synap Ngoài ra sản phẩm hòa tan của APP và protein A𝛽 có thể làm gián đoạn qua trình sinh hóa của ty thể, làm oxy hóa và thúc đẩy quá trình thoái hóa thần kinh Do đó cải thiện chức năng chuyển hóa là cách tiếp cận để phát triển các phương pháp điều trị bệnh [28]

Ở Nga, Latrepirdin là một thuốc kháng histamin ức chế yếu AchE, BuchE và tín hiệu NMDA Tuy nhiên, Latrepirdin chủ yếu dùng để tăng cường chức năng ty thể thông qua ức chế mở các lỗ bán thấm (permeaability transition pores) dễ bị chết bởi

A𝛽 của màng trong ty thể Ngoài ra, Latrepirdin có thể bảo vệ tế bào thần kinh thông qua kiểm soát độc tính của A𝛽 và tăng cường sản xuất adenosine triphosphat [28]

16

1.1.7.8 Hạn chế của thuốc điều trị bệnh Alzheimer hiện nay

Nhóm thuốc ức chế cholinesterase chỉ định cho trường hợp bệnh nhẹ đến trung bình, ổn định nhận thức tạm thời, hoặc làm giảm rất nhỏ sự suy giảm nhận thức, 20-30% bệnh nhân đã điều trị giảm được 7 điểm trong thang điểm đánh giá nhận thức ADAS-Cog (tương đương giảm được 1 năm suy giảm nhận thức) [21], [55] Memantin được dùng cho bệnh nhân ở giai đoạn trung bình đến nặng, ở những người không dùng được thuốc ức chế cholinesterase [52] Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu quả của memantin khi đánh giá bằng thang ADAS-Cog so với giả dược ở thời điểm 12 - 24 tuần điều trị, nhưng không cho thấy lợi ích từ 24-48 tuần [49] Tuy dòng thác amyloid (amyloid cascade) là một trọng tâm nghiên cứu trong điều trị Alzheimer nhưng đến nay vẫn chưa có thuốc đối kháng amyloid nào được phê duyệt, mặc dù nhiều chất đang ở pha cuối thử nghiệm lâm sàng [28]

Tác dụng không mong muốn của nhóm ức chế cholinesterase thường do các tác dụng kích thích cholinergic quá mức và phụ thuộc vào liều như: buồn nôn, nôn, tiêu chảy, đau bụng, chóng mặt, nhức đầu, tiết nước bọt, đổ mồ hôi, nhịp chậm, chuột rút, ngất, mệt mỏi, mất ngủ, kích động, … Trong đó, buồn nôn, nôn, tiêu chảy được báo cáo nhiều nhất Tacrin gây nhiễm độc gan sau khoảng 3 tháng ở 30-40% số bệnh nhân biểu hiện bởi tăng men gan và trở lại bình thường sau khi ngừng thuốc [28]

Tương tác thuốc của các thuốc trong nhóm ức chế cholinesterase có thể gặp như: donepezil và glantamin chuyển hóa qua hệ cytochrom P450, enzym CYP3A4, nên chúng có nguy cơ gây tương tác với các thuốc ức chế hoặc gây cảm ứng trên hệ enzym này: carbamazepin, dexamethason, phenobarbital, phenytoin, rifampicin, erythromycin, … Ngoài ra, các thuốc trong nhóm còn có thể gây tương tác thuốc với các nhóm: thuốc chống loạn thần, các azol chống nấm, nhóm ức chế thụ thể H2, chẹn kênh calci, các thuốc tác dụng lên acetylcholin khác … [30]

1.1.7.9 Một số mô hình nghiên cứu

Mô hình sàng lọc đầu tiên phải kể đến là nghiên cứu các chất có tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase Đây là mô hình đơn giản, dễ làm và ít tốn kém

Về nguyên tắc có thể định lượng acetylcholin (ACh) và acetylcholinesterase (AChE) thông qua trung gian enzym cholin oxidase xúc tác các phản ứng ACh

17

sẽ bị enzym AChE chuyển thành cholin, sau đó nó bị cholin oxidase oxy hóa chuyển thành betain và H2O2 Dưới sự xúc tác của horseradish peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng với thuốc thử 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tạo chất có màu hồng Đo cường độ huỳnh quang ở 563 nm Cường độ huỳnh quang của 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tỷ lệ thuận với nồng độ ACh và AChE Từ đó

có thể định lượng được nồng độ ACh và hoạt tính của AChE Hoặc có thể đánh giá

khả năng ức chế hoạt tính của enzym AChE ex vivo theo nguyên tắc của Ellman và

cộng sự: cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân bởi AChE tạo thành thiocholin và acid acetic Thiocholin thu được cho phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) tạo ra accid 5-thio-2-nitro benzoic (RS) có màu vàng, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 412 nm Chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến hành định lượng hoạt tính enzym AChE theo phương pháp của tác giả Ellman và cộng sự Có thể đánh giá

khả năng ức chế hoạt tính của AChE in vitro với nguyên tắc tiến hành theo phương

pháp của Ellman và cộng sự nhưng sử dụng AChE có sẵn [42], [72]

Hệ thống tế bào, như các dòng tế bào thần kinh (NG 108-15) hoặc tế bào thần kinh vỏ não được nuôi cấy nguyên phát cũng được sử dụng để đánh giá thuốc điều trị Alzheimer, bằng cách gây độc các tế bào này bởi protein beta-amyloid hoặc glutamat,

sử dụng mẫu nghiên cứu để bảo vệ tế bào thần kinh đó, định lượng lượng tế bào sống sót [39], [40], [44], [74] Thuốc điều trị Alzheimer sẽ được sử dụng để ngăn chặn hoặc làm giảm bớt độc tính của protein beta-amyloid hoặc glutamat trên tế bào thần kinh

NG 108-15 nuôi cấy, có khả năng phục hồi tổn thương hoặc làm tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh

Trên mô hình động vật, người ta sử dụng một số loại chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer như chuột Tg2576, PSAPP (hiện nay đang được sử dụng trên thế giới) Nghiên cứu trên mô hình động vật chuyển gen mang bệnh ở người là cần thiết để hiểu rõ về cơ chế phân tử và thúc đẩy nghiên cứu tiền lâm sàng Bệnh Alzheimer đã được gây trên mô hình chuột chuyển gen thế hệ đầu tiên (Tg), trên chuột chuyển gen này có sự biểu hiện quá mức của protein có liên quan đến bệnh Alzheimer có tính chất gia đình, hoặc sử dụng mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 là APP mang đột biến protein tiền thân amyloid (APP), hoặc đột biến cả APP và presenilin (PS) Các chủng

18

chuột chuyển gen này thể hiện bệnh lý Alzheimer nhưng mô hình biểu hiện quá mức

có thể dẫn tới các kiểu hình bổ sung không liên quan đến Alzheimer Mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 APP chứa các trình tự gen người và đột biến gen APP nội sinh trên lâm sàng Những chuột này cho thấy sự tích tụ β-amyloid không có kiểu hình liên quan đến biểu hiện quá mức nhưng chưa phải là biểu hiện Alzheimer trên lâm sàng

của người [29], [41]

Một số mô hình gây mất trí nhớ cho chuột bằng hóa chất như tiêm scopolamin bằng đường phúc mạc, hoặc truyền colchicin vào não chuột cống cũng được sử dụng [22], [59], [66], [73]

Bên cạnh đó, các mô hình phẫu thuật gây mất trí nhớ cho chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Mô hình gây mất trí nhớ do thiếu máu não cục

bộ (ischemia induced learning and memory deficit) bằng cách thắt 2 động mạch cảnh đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút máu đuôi chuột đã được giáo sư Kinzo Matsumoto sử dụng để nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer từ năm 2000 [74] Trong

mô hình này, chuột sẽ được gây mê, sau đó bộc lộ 2 động mạch cảnh một cách cẩn thận, thắt 2 động mạch cảnh này bằng chỉ kẹp động mạch trong 30 phút, đồng thời lấy máu đuôi chuột trong quá trình gây thiếu máu cục bộ Đây cũng là mô hình đã triển khai thành công tại Viện Dược liệu

Một mô hình mới cũng được sử dụng hiện nay là mô hình gây suy giảm học và nhớ trên chuột mất vùng khứu giác (learning and memory deficit in olfactory bulbectomized mice) của giáo sư Kinzo Matsumoto áp dụng từ năm 2011 [74] Chuột được gây mê và cố định trên hệ thống định vị chuột Sau đó, rạch da bộc lộ phần hộp

sọ bao phủ vùng khứu giác (OBX) rồi khoan thủng 1 lỗ đường kính 1 mm, phá hủy vùng khứu giác của chuột, lấp đầy vùng này bằng bọt cầm máu gelatin Chuột sau khi

bị loại bỏ vùng khứu giác sẽ bị suy giảm khả năng học tập và trí nhớ

Mô hình ruồi giấm: Ruồi giấm có tên khoa học là Drosophila melanogaster, đã

được giải trình tự toàn bộ hệ gen, và nó cho thấy có hơn 70% gen tương đồng với bộ gen của người [53], [54] Với ưu thế vòng đời ngắn, dễ nuôi trong phòng thí nghiệm và

có thể cung cấp số lượng nhiều trong cùng một thời điểm, do đó ruồi giấm là nguồn gen thuận lợi cho việc nghiên cứu bệnh liên quan đến yếu tố di truyền cũng như có

bố của nhóm nghiên cứu Parsa Kazemi-Esfarjani, Seymour Benzer trong việc ức chế độc tính của polyglutamine trên mô hình ruồi giấm [53], [54] Nhóm tác giả của John

M Warrick (năm 2005) thì ứng dụng mô hình tương tự cho nghiên cứu tác dụng ức chế polyglutamine của Ataxin-3 [35] Nhóm Botella và cộng sự năm 2009 và 2011 đã dùng ruồi giấm làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson [13], [34] Các nhà nghiên cứu Nhật Bản, nhóm tác giả Hideya Mizuno (năm 2011) cũng đã dùng mô hình ruồi giấm chuyển gen alpha-synuclein làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson và các yếu

tố liên quan [27] Nhóm tác giả Masamitsu Yamaguchi (2017) và một số nhóm nghiên cứu khác đã dùng mô hình ruồi giấm đột biến gen ATP binding cassette subfamily A member 13 (ABCA13) làm mô hình nghiên cứu bệnh tự kỷ [23], [33]

Hiện nay trên thế giới có ba trung tâm lưu giữ đầy đủ nguồi gen ruồi giấm là Mỹ,

Ấn độ và Nhật Bản, là những cơ sở luôn sẵn sàng cung cấp trao đổi nguồn gen sẵn có cho các nhà nghiên cứu ở bất kỳ đâu trên thế giới, cần nhấn mạnh hơn là hầu hết các trường y-dược lớn tại Nhật Bản, Châu Âu và Mỹ đều có các phòng thí nghiệm dùng

mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu y sinh Ở Việt Nam, chưa có một nghiên cứu nào

đi sâu vào mức độ phân tử về bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh tự kỷ, Parkinson, bệnh Alzheimer, và Huntington cũng như chưa có phòng thí ngiệm nào tạo lập được các mô hình động vật chuyển gen để nghiên cứu bệnh và sàng lọc thuốc Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tỷ lệ mắc bệnh biểu hiện lâm sàng và các biến chứng của bệnh

Trong dự án FIRST “Hợp tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ngăn ngữa/ hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng” do TS Phạm Thị

Nguyệt Hằng làm chủ nhiệm với mục tiêu ứng dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer để sàng lọc dược liệu GS Masamitsu Yamaguchi, Giám đốc trung tâm ruồi giấm, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản là một trong

20

những thành viên của dự án, đã cung cấp một số chủng ruồi giấm chuyển gen phục vụ công tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng hỗ trợ/ điều trị bệnh Alzheimer

1.2 Tổng quan về cây rau đắng biển

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây rau đắng biển

Rau đắng biển (sam trắng) có tên khoa học là Bacopa monnieri (Linn) Các

tên đồng danh là Bacopa monniera (L.) Pennell yes; Bacopa monniera (L.) Wettst;

Lysimachia monnieri (L.) Cent; Glaticola monnieri (L.); Monniera cunefolia

Michaux; Herpestis monniera (L.) Kunth [7]

Hình 1.3: Rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn ) [32]

*Vị trí phân loại của loài Bacopa monnieri (Linn) trong hệ thống phân loại thực

21

lá, có cuống dài 1 cm Năm lá đài không đều, dài 5-6 mm, 5 cánh hoa có màu tím nhạt, dính nhau ở thành ống Bốn nhị, bầu không lông Quả nang, hình trứng, nằm trong đài,

có múi nhẵn, có vòi tồn tại Hạt nhiều, rất nhỏ, mùa hoa tháng 4-6 [7] Rau đắng biển

là loài cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, ven bờ ruộng, bãi cỏ, bờ mương, cây ra hoa quả hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt

Phân bố: Loài thực vật này sống rộng rãi ở Ấn Độ, Pakistan, Afghanistan, Nepal, Sri Lanka, vùng cận nhiệt đới ở Mỹ, vùng nhiệt đới ở châu Á trong đó có Việt Nam, châu Phi và châu Úc Tại Việt Nam, cây được trồng nhiều ở khắp các vùng đồng bằng

và trung du miền Bắc và miền Nam [7]

1.2.2 Bộ phận dùng

Phần trên mặt đất, dùng tươi hay phơi khô [7]

1.2.3 Thành phần hóa học

Một số thành phần hóa học có tác dụng dược lý trong rau đắng biển gồm

alcaloid, saponin và sterol Trong đó, saponin là thành phần có hoạt tính chính Saponin trong rau đắng biển được xác định là các saponin triterpenoid nhóm drammaran có các sapogenin chính là jujubogenin và pseudojujubogenin

Bacoside A và bacoside B

Trong nhóm các saponin, thành phần hóa học có tác dụng lên hoạt động của hệ thần kinh, tác dụng hướng thần hoặc chống lại chứng mất trí nhớ là bacoside A, có tên khoa học là 3-(α-L-arabinopyranosyl)-O-β-glucopyranosid-10,20-dihydroxy-16-keto-drammar-24-en [63]

Gần đây, các nghiên cứu về bacoside A bằng phương pháp HPLC đã cho thấy bacoside A là hỗn hợp của 4 saponin được đặt tên là bacoside A3, bacoside II, một jujubogenin là đồng phân của bacopasaponin C là 3-O-[α-L-arabinofuronosyl-(1-2)-{β-D-glucopyranosyl}] jujubogenin (còn được gọi là bacopasid X) và bacopasaponin

C [36]

22

Hình 1.4: Aglycol của bacoside

Bacoside B được phát hiện cùng lúc với bacoside A, ban đầu được phát hiện chỉ

khác với bacoside A ở phần đường thể hiện năng suất quay cực và có thể là một đồng phân với bacoside A Tuy nhiên, gần đây các nhà khoa học đã xác định bacoside B là một hỗn hợp các saponin có các aglycon là các jujubogenin hoặc pseudojujubogenin như: bacopasid N1, bacopasid N2, bacopasid IV, bacopasid V [24]

Các bacopasaponin tiếp theo là các bacopasaponin D, E, F, G:

• Bacopasaponin D: 3-O[α-L-arabinopyranosyl (1→2)- β-D-glucopyranosyl] pseudojujubogenin [26]

• Bacopasaponin E: 3-O[β-D-glucopyranosyl (1→3){α- L-arabinofuranosyl (1→2)} α- L-arabinopyranosyl]-20-O- (α-L-arabinopyranosyl) jujubogenin

• Bacopasaponin F: 3-O[β-D-glucopyranosyl (1→3){α- L-arabinofuranosyl (1→2)} β-D-glucopyranosyl]-20-O- (α-L-arabinopyranosyl) jujubogenin

23

• Bacopasaponin G: Hou và cộng sự đã phân lập được một saponin mới năm

2002 đặt tên là bacopasaponin G, một dẫn xuất được Matsutaka đặt tên là octan-3yl-(6-O-sufonyl)-β-D-glucopyranosid [60]

và nhiều hợp chất hữu cơ khác như acid brahmic, acid ascorbic [24]

1.2.4 Tác dụng dược lý

1.2.4.1 Theo y học cổ truyền

Rau đắng biển có vị đắng tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim,

thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng Toàn cây rau đắng biển được dùng để chữa suy nhược thần kinh, mất trương lực cơ, động kinh, mất tiếng, khản tiếng, viêm phế quản cấp, ho, hen, chữa bí tiểu, viêm gan, thấp khớp, rắn cắn và bệnh ngoài da như da sừng dày lên như da voi, lở, mụn nhọt, ghẻ Ngày 6-12 gam dạng thuốc sắc, dùng ngoài không kể liều lượng Ngoài ra, rau đắng biển còn được dùng như rau sống hoặc nấu chín ăn [7]

1.2.4.2 Theo y học hiện đại

Theo các nghiên cứu trên thế giới, rau đắng biển có một số tác dược lý chính

như sau:

• Tác dụng chống vi khuẩn: Tác dụng chống vi khuẩn của dịch chiết Bacopa

monnieri trong các dung môi khác nhau đã được đánh giá bởi Sampathcumar và cộng

sự năm 2018 Kết quả cho thấy dịch chiết trong diethyl ether có tác dụng chống lại vi

khuẩn gram dương (Staphylococus aureus), trong khi dịch chiết trong ethyl acetat chống được vi khuẩn gram âm (Proteus vulgaris) Ngoài ra, dịch chiết cồn có tác dụng diệt các loại nấm Aspergillus niger, Candida albicans [39]

• Tác dụng chống ung thư: Dịch chiết cồn của cây rau đắng biển có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào nuôi cấy sarcoma – 180 bằng cách tác động lên quá trình

Tác dụng chống lo âu, trầm cảm: Các thành phần bacoside A, bacoside B,

bacoside I, bacoside II và bacopasaponin C đã được chứng minh là có hoạt tính chống trầm cảm trên mô hình chuột bơi cưỡng bức và mô hình đuôi chuột trong nghiên cứu của Zhon và cộng sự năm 2007 [64] Ngoài ra, hersaponin – một loại glycosid được

phân lập từ Bacopa monnieri, đã được chứng minh là có tác dụng an thần, chống lo âu

[17]

Tác dụng chống động kinh: Nghiên cứu lâm sàng được thực hiện bởi

Dhanasekaran và cộng sự năm 2007 cho kết quả về hiệu quả của dịch chiết Bacopa

monnieri trong việc làm giảm các triệu chứng của động kinh Một thí nghiệm khác

25

nghiên cứu về động kinh thùy thái dương (một hội chứng động kinh thường gặp) cho

thấy hiệu quả điều trị của Bacopa monnieri và bacoside A trên chuột bị động kinh

[47]

Tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng nhận thức và học hỏi: Bacopa monnieri có

tác dụng cải thiện trí nhớ có thể là do khả năng làm tăng tuần hoàn não bằng cách ức chế quá trình oxy hóa ở não, đồng thời tăng nồng độ serotonin ở não Nghiên cứu việc

sử dụng sản phẩm từ Bacopa monnieri trong điều trị rối loạn khả năng tập trung ở trẻ

em (ADHD- Attention deficit hyperactivity disorder) được tiến hành kiểm soát ở đại học Y Dược BRD tại Gorakhpur, kết quả thu được cho thấy sự gia tăng đáng kể trong việc nhắc lại câu văn, tư duy logic và học tập theo cặp trong cả 19 trẻ được sử dụng

Bacopa [64]

Tác dụng trên hệ nội tiết: Dịch chiết cồn của lá Bacopa monnieri tăng nồng độ

hormon tuyến giáp T4 (tới 41%) ở chuột đực thông qua tác dụng cường giáp theo kết quả nghiên cứu của Kar và cộng sự năm 2002 [38]

Tác dụng trên hệ hô hấp: Dịch chiết của Bacopa monnieri đã được chứng minh

có tác dụng giãn phế quản trên chuột bị gây mê [14]

Tác dụng trên hệ tiêu hóa: Dịch chiết của Bacopa monnieri sạch có tác dụng bảo

vệ và chữa lành vết loét đường tiêu hóa trên nhiều mẫu động vật khác nhau Cơ chế tác dụng được cho là gia tăng các yếu tố bảo vệ niêm mạc (bài tiết chất nhầy, tuổi thọ của

tế bào niêm mạch, chống oxy hóa ), giảm các yếu tố tấn công (sự bài tiết acid,

pepsin) [62] Dịch chiết của Bacopa monnieri có khả năng chống loét đại tràng bằng cách ức chế sự phát triển của Helicobacter pylori, tăng nồng độ prostaglandin E và

prostaglandin I2 ở đại tràng [25] Ngoài ra, khi uống dịch chiết cồn của Bacopa

monnieri sẽ tạo ra tác dụng bảo vệ gan bằng cách chống lại sự suy giảm các enzyme

chống oxy hóa ở gan (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase) theo nghiên cứu của Sumathy và cộng sự năm 2001 [67]