Nghiên cứu tác dụng và bước đầu tìm hiểu cơ chế của cây rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn) Wettst trên mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÍ THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ CỦA CÂY RAU ĐẮNG BIỂN BACOPA MONNIERI (LINN) WETTST TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM MANG BỆNH ALZHEIMER LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÍ THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ CỦA CÂY RAU ĐẮNG BIỂN BACOPA MONNIERI (LINN) WETTST TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM MANG BỆNH ALZHEIMER LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 8720208 Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng PGS.TS Nguyễn Thị Lập HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình hồn thành luận văn này, tơi nhận giúp đỡ chân tình, động viên khích lệ từ nhiều tập thể, nhiều Quý thầy cô giáo, đồng nghiệp bạn bè gia đình Trước tiên tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Phạm Thị Nguyệt Hằng PGS.TS Nguyễn Thị Lập, người thầy tâm huyết định hướng tận tình hướng dẫn cho tơi q trình thực luận văn Tiếp theo, muốn gửi lời cảm ơn đến Bộ mơn Hóa sinh, phòng Sau Đại học – Trường Đại học Dược Hà Nội, khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu tận tình giúp đỡ tơi q trình làm thực nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Truyền, Ban chủ nhiệm khoa, thầy cô giáo, đồng nghiệp khoa Dược – Trường Đại học Kinh Doanh Công Nghệ Hà Nội tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ q trình học tập, giúp tơi hồn thành luận văn Cuối lời tri ân sâu sắc nhất, tơi xin gửi đến người thân, gia đình ln bên cạnh, động viên, khích lệ giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, luận văn có nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cô, bạn bè để luận văn hoàn thiện Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Phí Thị Tuyết Nhung MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Phần TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Dịch tễ 1.1.3 Nguyên nhân gây bệnh yếu tố di truyền học 1.1.4 Yếu tố nguy yếu tố bảo vệ 1.1.5 Cơ chế bệnh sinh 1.1.6 Đặc điểm lâm sàng 10 1.1.7 Thuốc điều trị 11 1.2 Tổng quan rau đắng biển 20 1.2.1 Vị trí phân loại đặc điểm thực vật rau đắng biển .20 1.2.2 Bộ phận dùng 21 1.2.3 Thành phần hóa học .21 1.2.4 Tác dụng dược lý 23 Phần ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nguyên liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .26 2.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen APP mang bệnh Alzheimer 30 2.2.2 Đánh giá tác dụng cao tiêu chuẩn chứa 30% bacoside từ rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst) mơ hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer thử nghiệm hành vi 32 2.2.2.1 Đánh giá khả vận động ruồi giấm .32 2.2.2.2 Đánh giá trí nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm 33 2.2.2.3 Đánh giá khả sống sót ruồi trưởng thành 34 2.2.3 Tìm hiểu chế tác dụng rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn) Wettst thông qua việc đánh giá mức độ biểu protein APP kỹ thuật Western Blot 35 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 3.1 Đánh giá tác dụng cao tiêu chuẩn chứa 30% bacoside từ rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst) mơ hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer thử nghiệm hành vi 40 3.1.1 Đánh giá khả vận động ruồi giấm .40 3.1.2 Đánh giá trí nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm .42 3.1.3 Đánh giá khả sống sót ruồi giấm trưởng thành .44 3.2 Tìm hiểu chế tác dụng rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn) Wettst thông qua việc đánh giá mức độ biểu protein tiền chất amyloid (Amyloid precusor protein –APP) não ruồi giấm .45 Phần BÀN LUẬN 47 4.1 Về mơ hình nghiên cứu .47 4.1.1 Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer 47 4.1.2 Về việc lựa chọn Amyloid precusor protein 48 4.1 Về kết nghiên cứu .47 4.2.1 Đánh giá khả vận động ruồi giấm 49 4.2.2 Đánh giá trí nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm .49 4.2.3 Đánh giá khả sống sót ruồi giấm trưởng thành 51 4.2.4 Tìm hiểu chế tác dụng rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn) Wettst thông qua việc đánh giá mức độ biểu protein tiền chất amyloid APP .51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ theo Tiếng Anh Viết đầy đủ theo Tiếng Việt AA Alzheimer's Association AchE Acetylcholin esterase AD Alzheimer disease Bệnh Alzheimer Agency for Healthcare Cơ quan nghiên cứu chăm sóc sức khỏe chất lượng AHRQ Research and Quality AM n- Amyl acetat ApoE Apolipoprotein E APP Amyloid precursor protein ATCI Acetylthiocholin iodid Aβ β-amyloid 10 BACE1 β-site APP-cleaving 11 BPB Bromophenol blue 12 BuchE Butyrylcholinesterase 13 HRP Horseradish peroxidase 14 LDL Low-density lipoprotein 16 NMDA N-methyl D- aspartat OCT tử thấp Kỳ Institute of Gerontology 18 Lipoprotein trọng lượng phân Viện Lão khoa Quốc gia Hoa NIA OBX Protein tiền chất amyloid American National 15 17 Hiệp hội Alzheimer Olfactory bulbectomized Phẫu thuật loại bỏ vùng khứu giác 1-octanol Peroxisom prolifrator 19 PPARγ activated receptor γ 20 PVDF Polyvinyllidene difluoride 21 RĐB Rau đắng biển 22 SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE 23 polyacrylamide gel electrophoresis 24 TBS Tris buffer saline 25 βAP β-amyloid peptid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Hóa chất 28 Bảng 2.2 Dụng cụ, thiết bị 29 Bảng 2.3 Các dung dịch xử lý mẫu 36 Bảng 2.4 Dung dịch gel, running buffer transfer buffer 37 Bảng 2.5 Thành phần Lower gel, upper gel 38 Bảng 2.6 Dung dịch block màng 39 Bảng 2.7 Kháng thể 39 Bảng Mức độ biểu protein nhóm ruồi 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sự hình thành amyloid beta mảng bám ngồi tế bào Hình 1.2 Sự hình thành đám rối thần kinh Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo chất ức chế cholinesterase 11 Hình 1.4 Rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn ) 20 Hình 1.5 Aglycol bacoside 22 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất saponin từ rau đắng biển 27 Hình 2.2 Thiết kế nghiên cứu 30 Hình 2.3 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen APP mang bệnh 31 Alzheimer Hình 2.4 Mơ hình đánh giá trí nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm 34 Hình 2.5 Mơ hình đánh giá khả sống sót ruồi giấm 35 Hình 3.1 Tốc độ di chuyển ấu trùng ruồi giấm nhóm sử 40 dụng cao chiết RĐB so với nhóm bệnh lý Các nhóm RĐB4, RĐB6 sử dụng cao chiết RĐB với nồng độ tương ứng mg/ml mg/ml,**p