Qua tham khảo các tài liệu [9], [33], [72], [86]và mô hình chuột nhắt trắng tự kỷ thực nghiệm bằng muối natri valproat đã được triển khai tại Viện Dược liệu với mức liều natri valproat là 500 mg/kg tiêm phúc mạc [2], do đó, chúng tôi áp dụng kết quả của nhóm nghiên cứu để tiếp tục tiến hành các nội dung của đề tài. Chuột nhắt trắng, mang thai 12 – 13 ngày, được tiêm phúc mạc natri valproat liều 500 mg/kg thể trọng.
Chuột mẹ được chia lô như sau:
- Lô 1: lô chứng sinh lý, chuột mẹ khỏe mạnh và được cho uống nước cất trong vòng 13 ngày đầu sau sinh.
- Lô 2: lô chứng bệnh lý, chuột mẹ được tiêm natri valproat như trên và được cho uống nước cất trong vòng 13 ngày đầu sau sinh.
- Lô 3: lô điều trị, chuột mẹ được tiêm natri valproat như trên và được cho uống BME liều 50 mg/kg thể trọng trong vòng 13 ngày đầu sau sinh.
Chuột con sau sinh được chia lô tương ứng với chuột mẹ như sau:
- Lô 1: lô chứng sinh lý, con của chuột mẹ khỏe mạnh và được cho uống nước cất từ 14 ngày tuổi đến khi kết thúc quá trình thí nghiệm.
- Lô 2: lô chứng bệnh lý, con của chuột mẹ được tiêm natri valproat như trên và được cho uống nước cất từ 14 ngày tuổi đến khi kết thúc quá trình thí nghiệm.
- Lô 3: lô điều trị, con của chuột mẹ được tiêm natri valproat như trên và được cho uống BME liều 50 mg/kg thể trọng từ 14 ngày tuổi đến khi kết thúc quá trình thí nghiệm.
2.3.2.Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện ASD của cao khô cây Rau đắng biển (BME)
2.3.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện suy giảm tương tác xã hội bằng thử nghiệm ba buồng
Tiến hành theo nghiên cứu của tác giả Nadler và cộng sự [61]. Khiếm khuyết trong tương tác xã hội cũng là một trong những triệu chứng cốt lõi của ASD. Loài gặm nhấm có đặc điểm thích dành nhiều thời gian hơn với con cùng loài và tìm hiểu các thứ mới hơn là những thứ quen thuộc. Thử nghiệm gồm có 2 pha là pha làm quen và pha kiểm tra. Thử nghiệm cần có một dụng cụ đặc biệt gồm có 3 buồng, 2 buồng hai bên có chứa hộp lưới ở chính giữa, có phiến nhựa để ngăn các các buồng khi cần. Thời gian chuột vào các buồng và tiếp xúc với các hộp lưới là thông số được quan tâm. Đặc biệt,
24
thời gian chuột khám phá hộp có chuột đồng giới và không có chuột đồng giới phản ánh khả năng tương tác xã hội của chuột.
Chuột con được 30 ngày tuổi sẽ được cho uống nước muối sinh lý hoặc BME liều 50 mg/kg 30 phút trước khi tiến hành thử nghiệm. Sau đó, chuột được đặt nhẹ nhàng vào buồng giữa. Trong giai đoạn làm quen, chuột được tự do di chuyển khám phá cả 3 buồng trong 5 phút. Sau đó, chuột lại được đưa về buồng giữa trong 1 phút và buồng giữa được ngăn cách với các buồng còn lại bằng tấm nhựa. Trong pha kiểm tra, một chuột khác cùng giới và cùng khối lượng được đưa vào một trong hai hộp lưới. Các tấm nhựa ngăn được đưa ra ngoài và chuột nghiên cứu lại được tự do khám phá cả 3 buồng trong 10 phút. Toàn bộ hoạt động của chuột được máy quay phim ghi lại. Thời gian chuột vào các buồng và tiếp xúc với các hộp lưới được lưu lại để phân tích bằng phần mềm ANY-maze.
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện hành vi lặp lại bằng thử nghiệm tự chải chuốt
Tiến hành theo nghiên cứu của tác giả Silverman và cộng sự [77]. Hành vi lặp lại là một trong những triệu chứng cốt lõi của ASD. Các loài gặm nhấm có tập tính tự chải chuốt nhằm duy trì vệ sinh và các quá trình sinh lý quan trọng khác như điều chỉnh nhiệt độ, giao tiếp xã hội và kích thích. Hành vi này được quan sát thấy thường xuyên nhất ở động vật gặm nhấm bình thường, mang tính lặp lại. Qua việc theo dõi và tính tổng thời gian chuột dành cho việc tự chải chuốt trong thời gian nhất định, ta có thể đánh giá được hành vi này của chuột.
Chuột con 20 ngày tuổi được cho uống nước muối sinh lý hoặc BME liều 50 mg/kg 30 phút trước khi tiến hành thử nghiệm. chuột con được đặt vào trong một buồng thí nghiệm cách âm, trên buồng có một camera hồng ngoại. Chuột được tự do khám phá buồng trong 10 phút. Tất cả hoạt động của chuột trong 10 phút được camera hồng ngoại ghi lại. Sau 10 phút, chuột được đưa ra ngoài và buồng được vệ sinh bằng cồn 70% trước khi tiến hành thử nghiệm với các chuột con khác. Sau đó, tổng thời gian chuột chải chuốt (gãi đầu, gãi tai, lông) được phân tích để đánh giá.
2.3.3.Phương pháp đánh giá sự thay đổi biểu hiện của protein PTEN ở vùng hồi hải mã bằng kỹ thuật Western blot
Quy trình thực hiện được tiến hành theo mô tả của các nghiên cứu trước đã từng thực hiện tại khoa Dược lý – Sinh hóa [48], [68]. Chuột con 60 ngày tuổi sẽ được gây
25
mê và tách lấy não thu lấy phần vỏ não và hồi hải mã. Các phần này được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (-86°C) cho đến khi được dùng.
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử: Ly giải protein
- Chuẩn bị dung dịch đệm ly giải protein RIPA được chuẩn bị như bảng ở Phụ lục 1 (PL-1).
- Nghiền mẫu: mỗi mẫu não được cho vào 1 ống nghiền mô 2 mL có chứa sẵn 500 μL dung dịch RIPA. Mô được nghiền trong đệm bằng máy Lab gen 125 ở mức 4 trong 1 phút trên đá lạnh.
- Để yên 30 phút trên đá lạnh để tan bọt và tăng hiệu quả ly giải protein. - Ly tâm: tốc độ 15000 vòng/phút, nhiệt độ 4°C, thời gian 15 phút.
- Hút dịch nổi sang ống ly tâm đáy nhọn 1,5 mL (không hút kiệt), bảo quản ở - 20°C cho đến khi dùng.
- Chuẩn bị dung dịch đệm PBS 10x và 1x pH 7,4 như các bảng ở Phụ lục 2 và 3 (PL-2 và PL-3).
- Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn với các nồng độ 0, 50, 100, 200, 400, 600 μg/mL bằng cách pha loãng dung dịch protein gốc có nồng độ 2 mg/mL với dung dịch đệm PBS.
- Chuẩn bị kit BCA theo tỷ lệ 25A:24B:1C với thể tích dư khoảng 5-10 giếng của đĩa ELISA.
- Định lượng protein trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn với các hóa chất như bảng sau:
Bảng 2.3. Bố trí định lượng protein tổng số.
STT Hóa chất Chuẩn Trắng (thử) Thử
1 Dung dịch protein chuẩn (μL) 75 - -
2 PBS 1x pH 7,4 (μL) - 73 73
3 Mẫu (μL) - - 2
4 Đệm ly giải RIPA (μL) - 2 -
5 Kit BCA (μL) 75 75 75
26
- Pha loãng các mẫu bằng dung dịch ly giải RIPA để thu được các mẫu có nồng độ protein tương đương nhau (khoảng 60 mg/mL) với thể tích sau cùng là 100 μL.
- Chuẩn bị dung dịch biến tính protein heo công thức 10 μL dung dịch DTT 2M cùng với 1 mL Laemil sample buffer.
- Biến tính protein: trộn dung dịch biến tính với các mẫu theo tỷ lệ 1:1, sau đó đun cách thủy ở 90°C trong 10 phút. Các mẫu được để nguội trong đá và bảo quản ở tủ -20°C cho đến khi dùng.
Bước 2: Đổ gel
- Chuẩn bị các dung dịch dùng cho chuẩn bị gel polyacrylamide được chuẩn bị như bảng ở Phụ lục 4 (PL-4).
- Pha gel vào bình nón theo bảng ở Phụ lục 5 (PL-5) cho 1 bản gel, lắc kỹ và đổ ngay vào bản kính đã được lắp để tránh bị đông vón.
Bước 3: Điện di
- Chuẩn bị dung dịch đệm chạy điện di bằng cách pha loãng 10 lần đệm Laemil buffer 10x bằng nước cất.
- Chuẩn bị hộp điện di, dây điện, nguồn điện. - Lấy mẫu và thang protein chuẩn để trong hộp đá.
- Kẹp giữ bản gel và dây cao su giữ gel được tháo ra trước khi chạy điện di. - Lắp bản gel vào bể điện di sao cho mặt có lược quay vào trong, phía đối diện bản gel được lắp miếng nhựa (nếu chỉ chạy 1 bản gel) hoặc lắp thêm bản gel nữa (nếu chạy song song 2 bản gel) để tạo thành bể kín.
- Đổ đệm chạy ngập bản gel và rút lược ra từ từ để tránh làm biến dạng giếng. - Tra từ từ thang protein chuẩn và mẫu vào các giếng theo sơ đồ định sẵn với thể tích lần lượt là 2 μL và 7 μL.
- Đậy nắp và gắn điện cực theo đúng màu.
- Chạy điện di giai đoạn 1: 40 V, khoảng 13 mA, trong 30 phút để cho mẫu chạy hết phần gel cô.
- Chạy điện di giai đoạn 2: 100 V, khoảng 30 mA, trong 120 phút để các mẫu chạy hết bản gel.
- Lấy gel ra khỏi bể và lọc đệm chạy điện di qua giấy lọc để tái sử dụng.
27
- Chuẩn bị dung dịch đệm chuyển màng theo công thức trong bảng ở Phụ lục 6 (PL-6).
- Chuẩn bị màng nitrocellulose và giấy thấm với kích thước 8,5 cm x 3,5 cm. - Hoạt hóa màng nitrocellulose bằng lắc nghiêng với methanol trong 5 phút, sau đó thu hồi methanol và ngâm màng trong đệm chuyển màng cùng với xốp và giấy lọc trong khay chứa đệm chuyển màng.
- Tách nhẹ bản gel dưới vòi nước chảy. Phần gel cô và phần gel thừa được cắt ra bằng dao nhựa, thả nhẹ phần còn lại vào khay chứa đệm chuyển màng.
- Sắp xếp theo thứ tự sau: tấm nhựa đen, xốp, giấy thấm, bản gel, màng nitrocellulose, giấy thấm, xốp, tấm nhựa đỏ.
- Xếp vào bể chuyển màng, đổ đệm chuyển màng ngập bản nhựa.
- Chạy chương trình chuyển màng: 125mA (đối với 1 màng) hoặc 250 mA (đối với 2 màng) trong 110 phút.
Bước 5: Khóa màng
- Chuẩn bị dung dịch khóa màng như các bảng ở Phụ lục 7 và 8 (PL-7 và PL-8). - Ủ màng trong dung dịch Skim milk 5%, lắc nghiêng trong 1 giờ. Thu hồi dung dịch Skim milk 5% và bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh để tái sử dụng.
- Rửa màng bằng bằng lắc ngang tốc độ 90 vòng/phút với dung dịch rửa TBS-T 0,05% (pha loãng 2 lần đệm TBS-T 0,1% bằng nước cất) trong 5 phút.
Bước 6: Ủ kháng thể
- Chuẩn bị dung dịch Skim milk 1% và các kháng thể theo các bảng ở Phụ lục 9- 13 (PL-9, PL-10, PL-11, PL-12 và PL-13).
- Ủ kháng thể sơ cấp: đặt nhẹ nhàng màng vào hộp parafilm, tra kháng thể ngập màng, lắc nghiêng ở nhiệt độ phòng 2 giờ hoặc lắc nghiêng 15 phút ở nhiệt độ phòng rồi ủ qua đêm ở 4°C.
- Rửa màng 3 lần với dung dịch rửa màng TBS-T 0,05% trên máy lắc ngang tốc độ 90 vòng/phút trong 15 phút.
- Ủ kháng thể thứ cấp: tương tự như ủ kháng thể sơ cấp, nhưng chỉ ủ bằng lắc nghiêng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa màng như trên.
Bước 7: Hiện băng protein
28
- Pha dung dịch cơ chất ECL được pha với tỷ lệ dung dịch A:dung dịch B là 1:1, tổng thể tích thu được là 600-700 μL cho mỗi màng.
- Đặt nhẹ nhàng màng lên màng bọc thực phẩm, tra dung dịch cơ chất ECL phủ đều màng, đậy màng bọc lại và ép nhẹ để đuổi hết bọt khí và dung dịch thừa. Thấm bớt dung dịch thừa bằng giấy thấm.
- Đưa màng vào máy chụp ảnh, chọn chế độ thủ công, thời gian phơi sáng là 15 phút đối với PTEN và 3 phút đối với β-actin.
- Hình ảnh được phân tích bằng phần mềm ImageJ.
2.3.4.Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê được tiến hành bằng phần mềm SPSS 20.0 (SPSS software, IBM Corp, USA). Số liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình (MEAN) ± sai số chuẩn (SEM).
- Thử nghiệm tự chải chuốt: Thời gian chuột tự chải chuốt tích lũy trong 10 phút giữa các lô được phân tích bằng phương pháp phân tích ONE-way ANOVA, tiếp theo bằng post hoc test (Dunnett 2-sided t test). Sự khác biệt giữa các mẫu đạt ý nghĩa thống kê khi giá trị p<0,05.
- Thử nghiệm ba buồng: Thời gian chuột khám phá hộp có chuột và không có chuột ở các lô được phân tích bằng phương pháp Student’s Pair T test. Sự khác biệt giữa các mẫu đạt ý nghĩa thống kê khi giá trị p<0,05.
- Western Blot: tỷ lệ thay đổi PTEN/β-actin được phân tích bằng phương pháp ONE-way ANOVA, tiếp theo bằng post hoc test (Dunnett 2-sided t test). Sự khác biệt giữa các mẫu đạt ý nghĩa thống kê khi giá trị p<0,05.
29
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ
3.1.Đánh giá tác dụng cải thiện suy giảm tương tác xã hội của chuột ASD 30 ngày tuổi được đánh giá bằng tăng tương tác xã hội qua thử nghiệm ba buồng
Thử nghiệm ba buồng để đánh giá tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác xã hội trên chuột tự kỷ của BME. Thí nghiệm được thực hiện trên 3 lô, N=8-10 con/lô bao gồm lô sinh lý, lô chuột bệnh lý (ký hiệu là VPA); lô chuột tự kỷ được điều trị bằng BME với liều 50 mg/kg (được ký hiệu là VPA-BME 50). Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1. Mỗi lô được thể hiện giá trị trung bình ± SEM.
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm ba buồng.
Lô Thời gian khám phá hộp
có chuột đồng giới (giây)
Thời gian khám phá hộp
không có chuột (giây) p
Sinh lý 97,9±10,8 33,9±5,4 0,0007
VPA 93,9±13,7 71,0±16,3 0,3150
VPA-BME 50 100,1±11,5 41,4±5,5 0,0013
Sinh lý VPA VPA-BME 50 0 20 40 60 80 100 120 T hời gia n chuộ t khá m phá (s ) Hộp có chuột đồng giới Hộp không có chuột ✱✱✱ ✱✱
Hình 3.1. Tác dụng tăng tương tác xã hội của BME. **p < 0,01; ***p < 0,001.
Kết quả ở hình 3.1 cho thấy:
- Đối với lô sinh lý, thời gian chuột khám phá hộp có chuột đồng giới cao hơn đáng kể so với thời gian khám phá hộp không có chuột. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,001.
30
- Không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê về thời gian chuột khám phá hộp có chuột đồng giới so với thời gian khám phá hộp không có chuột ở lô bệnh lý.
- Đối với lô chuột tự kỷ được điều trị bằng BME với liều 50 mg/kg, thời gian chuột khám phá hộp có chuột đồng giới cao hơn gấp 2,39 lần so với thời gian khám phá hộp không có chuột. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.
3.2.Đánh giá tác dụng cải thiện các hành vi lặp lại qua thử nghiệm tự chải chuốt
Thử nghiệm tự chải chuốt để đánh giá tác dụng cải thiện hành vi lặp lại trên chuột tự kỷ của BME. Thí nghiệm được thực hiện trên 3 lô, N=9-11 con/lô bao gồm lô sinh lý, lô chuột bệnh lý (ký hiệu là VPA); lô chuột tự kỷ được điều trị bằng BME với liều 50 mg/kg (được ký hiệu là VPA-BME 50). Kết quả của thử nghiệm tự chải chuốt, để đánh giá tác dụng cải thiện các hành vi lặp lại của BME, được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2. Mỗi lô được thể hiện giá trị trung bình ± SEM.
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm tự chải chuốt.
Lô Thời gian chuột tự chải chuốt
trong 10 phút (giây) N p
Sinh lý 32,6±7,7 9 0,007
VPA 72,4±10,7 10
VPA-BME 50 36,8±6,7 9 0,015
Sinh lý VPA VPA-BME 50 0 20 40 60 80 100 T hời g ia n chu ột t ự chả i ( s) ✱✱ ✱
Hình 3.2. Tác dụng cải thiện hành vi lặp lại của cao khô Rau đắng biển. *p < 0,05; **p < 0,01 so sánh với lô VPA.
31 Kết quả ở hình 3.2 cho thấy:
- Ở lô chuột VPA (bệnh lý), tổng thời gian chuột tự chải chuốt trong 10 phút tăng đáng kể so với lô chuột sinh lý. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).
- Tổng thời gian chuột tự chải chuốt trong 10 phút ở nhóm điều trị BME liều 50