Bài viết nhằm nghiên cứu cơ chế phân tử của sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên vi khuẩn streptococcus nhóm B phân lập tại Hàn Quốc. Nghiên cứu được tiến hành trên 1075 mẫu vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm của các bệnh nhân tại các bệnh viện ở Hàn Quốc.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH NHÓM FLUOROQUINOLONE TRÊN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS NHÓM B PHÂN LẬP TẠI HÀN QUỐC Đặng Nguyễn Đoan Trang*, Usha Srinivasany**, Zachary Britt**, Carl F Marrs**, Lixin Zhang**, Moran Ki***, Betsy Foxman** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus, GBS) nguyên nhân nhiễm trùng trẻ sơ sinh nguyên nhân thường gặp nhiễm trùng người lớn có tổn thương miễn dịch.Sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone GBS báo cáo nhiều nước giới Đối tương phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành 1075 mẫu vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân bệnh viện Hàn Quốc Đột biến gene mã hóa enzyme gyrase topoisomerase xác định kỹ thuật PCR giải mã trình tự chuỗi DNA đặc hiệu Hoạt động bơm đẩy xác định thông qua thay đổi nồng độ ức chế tối thiểu norfloxacin ethidium bromide GBS với có mặt reserpine (20 µg/mL) Kết quả: Sự đề kháng ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin có liên quan đến đột biến gene mã hóa enzyme gyrase topoisomerase Bằng chứng hoạt động bơm đẩy phát 52,2 % vi khuẩn đề kháng với norfloxacin khơng có đột biến Từ khóa: Fluoroquinolones, norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, đột biến, bơm đẩy, MIC ABSTRACT MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE TO FLUOROQUINOLONES AMONG CLINICAL STRAINS OF GROUP B STREPTOCOCCUSFROM SOUTH KOREA Dang Nguyen Doan Trang, Usha Srinivasan, Zachary Britt, Carl F Marrs, Lixin Zhang, Moran Ki, Betsy Foxman * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 78 - 82 Introduction: Group B Streptococcus (GBS) is a major cause of neonatal sepsis and an emerging cause of infection in immune-compromised adult populations GBS resistance to fluoroquinolones has been reported in many countries worldwide Materials and methods: The study collection included 1075 clinical strains of GBS isolated from South Korea Mutations in genes encoding gyrase and topoisomerase were identified by PCR with specific primers followed by sequencing Evidence of efflux-mediated resistance to norfloxacin was identified by changes in MIC of norfloxacin and ethidium bromide in the presence of reserpine (20 µg/mL), an efflux pump inhibitor Results: Mutations were detected in strains resistant to ciprofloxacin, levofloxacin and moxifloxacin Evidence of the efflux phenotype was found in 52,2% of GBS strains resistant only to norfloxacin with no known mutations Keywords: Fluoroquinolones, norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, mutations, efflux, MIC * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ** Khoa Dịch tễ, Đại học Michigan, Hoa Kỳ *** 3Khoa Y học Dự phòng, Trường Đại học Y khoa Eulji, Daejeon, Hàn Quốc Tác giả liên lạc: DS Đặng Nguyễn Đoan Trang ĐT: 0909907976 Email: dtrangpharm@yahoo.com 78 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus, Streptococcus agalactiae, GBS) nguyên nhân nhiễm trùng trẻ sơ sinh nguyên nhân thường gặp nhiễm trùng người lớn có tổn thương miễn dịch(3) Sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone GBS báo cáo nhiều nước giới (4,9,11,12) Trong nghiên cứu Mỹ (12), tỷ lệ đề kháng levofloxacin GBS 4,4% Theo nghiên cứu Savoia D cộng Ý, tỷ lệ đề kháng norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, pefloxacin levofloxacin GBS 6,8%, 2,7%, 6,8%, 10,9% 1,3% (11) Trong nhiều nghiên cứu báo cáo, đề kháng fluoroquinolone số vi khuẩn gram dương bao gồm GBS liên quan đến đột biến gene mã hóa enzyme gyrase topoisomerase làm giảm khả gắn kết giảm hoạt tính fluoroquinolone Sự đề kháng fluoroquinolone vi khuẩn gram dương giải thích chế bơm đẩy Staphylococcus aureus(5), Streptococcus pneumonia (8), Streptococcus pyogenes (8) Streptococcus suis (8) chưa có báo cáo GBS Trên nghiên cứu 1075 mẫu GBS phân lập từ bệnh phẩm bệnh viện Hàn Quốc, tỷ lệ đề kháng fluoroquinolones cao, đặc biệt norfloxacin (tỷ lệ đề kháng với norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin 93%, 8,9%, 8,1% 0,8%) (7) Tỷ lệ đề kháng đặt vấn đề cần xác định chế đề kháng mức độ phân tử vi khuẩn phân lập nhằm góp phần vào việc lựa chọn kháng sinh hiệu trị liệu nghiên cứu cơng thức thuốc có hiệu cao GBS ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nghiên cứu Y học Việc xác định đột biến gene mã hóa gyrase topoisomerase tiến hành 95 mẫu GBS lựa chọn ngẫu nhiên từ 1075 mẫu GBS phân lập từ nước tiểu, âm đạo, trực tràng, vết thương bệnh nhân nhập viện từ bệnh viện Hàn Quốc từ năm 2006 đến 2008 Sau xác định đột biến, 146 mẫu GBS tiếp tục thử nghiệm để xác định hoạt động bơm đẩy bao gồm 88 mẫu đề kháng với norfloxacin (20 số qua xác định đột biến) 58 mẫu đề kháng với fluoroquinolone khác qua xác định đột biến Phân lập GBS GBS phân lập từ mẫu bệnh phẩm cách nuôi cấy môi trường chọn lọc Thử nghiệm catalase phản ứng ngưng kết latex (Streptex; Murex Biotech Ltd., Dartford, Anh) sử dụng để phát xác định GBS Xác định tính nhạy cảm GBS kháng sinh nhóm fluoroquinolone Tính nhạy cảm GBS kháng sinh nhóm fluoroquinolone(norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin) xác định máy kháng sinh đồ tự động VITEK II (thực Seoul Clinical Laboratories Seoul Medical Science Institute) dựa tiêu chuẩn EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) 2009 2011 Trên 1075 mẫu GBS nghiên cứu, tỷ lệ đề kháng với norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin phát 93%, 8,9%, 8,1% 0,8% Xác định đột biến vùng QRDR (Quinolone Resistance Determining Region) Chọn mẫu nghiên cứu Các bước xác định đột biến vùng QRDR gene gyr par (mã hoá enzyme gyrase topoisomerase): Chuyên Đề Dược Học 79 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 - Vùng QRDR khuếch đại kỹ thuật PCR với đoạn mồi đặc hiệu gyrA, gyrB, parC parE (12) Phản ứng PCR tiến hành điều kiện sau: biến tính chuỗi DNA 94oC phút, 30 chu kỳ nhiệt bao gồm giai đoạn bắt cặp nhiệt độ 45oC 30 giây giai đoạn kéo dài 68oC phút, giai đoạn kéo dài cuối 68oC phút Sản phẩm PCR tiếp tục phân tích kỹ thuật điện di gel agarose 1% đệm Trisacetic acid/EDTA (pH 7.5) với chất nhuộm gel an toàn GelRed soi nguồn sáng đèn UV - Sản phẩm PCR giải mã trình tự DNA (sequencing) Trung tâm Giải mã DNA, Đại học Michigan, Hoa Kỳ phân tích phần mềm Lasegene DNA STAR Các chủng vi khuẩn GBS ATCC 12403 and A909 sử dụng làm đối chứng âm phân tích Xác định hoạt động bơm đẩy (efllux pump) norfloxacin Hoạt động bơm đẩy norfloxacin xác định dựa thay đổi MIC norfloxacin (giảm lần) ethidium bromide (giảm lần) với có mặt reserpine (20 µg/mL), chất ức chế bơm đẩy (6,10) Mỗi kết MIC báo cáo trung bình lần thử nghiệm lặp lại Norfloxacin dùng thử nghiệm cung cấp Sigma Aldrich, Co., Missouri, Hoa Kỳ; reserpine cung cấp MP Biomedicals, LLC, Ohio, Hoa Kỳ ethidium bromide cung cấp Fisher Scientific, New Jersey, Hoa Kỳ Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus 1199B cấy bơm đẩy norA sử dụng làm đối chứng dương; chủng GBS ATCC 12403 A909 sử dụng làm đối chứng âm thử nghiệm Xử lý số liệu Các số liệu thu được xử lý thống kê phần mềm SAS (SAS Version 9.2 for Windows; SAS Institute Inc., Cary, NC) 80 KẾT QUẢ Đột biến gene mã hoá gyrase topoisomerase Việc xác định đột biến tiến hành tiểu đơn vị gyrA, gyrB gyrase parC, parE topoisomerase Chỉ có đột biến làm thay đổi acid amin đưa vào phân tích Khơng có trường hợp đột biến phát chủng vi khuẩn nhạy cảm với tất bốn fluoroquinolone chủng vi khuẩn đề kháng với norfloxacin Đột biến gyrA parC phát chủng đề kháng với ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin theo tỷ lệ khác (Bảng 1) Chỉ có ba trường hợp đề kháng với ciprofloxacin có đột biến gyrB khơng có trường hợp đột biến parE phát Đột biến đồng thời parC gyrA phát 90% chủng vi khuẩn đề kháng với levofloxacin 100% chủng vi khuẩn đề kháng với moxifloxacin Tất trường hợp đề kháng chéo với norfloxacin ciprofloxacin (Bảng 1) Bảng 1: Tỷ lệ đột biến gene gyrA parC 95 mẫu Streptococcus nhóm B (GBS) đề kháng với fluoroquinolone phân lập từ Hàn Quốc (2006 – 2008) Tỷ lệ đột biến Đề kháng Đề kháng Đề kháng Đề kháng LF MF NF NF CF Số lượng mẫu 20 37 29 Đột biến 0% 86% 90% 100% parC hay gyrA Đột biến 0% 4% 7% 0% parC hay gyrA Khơng có đột 100% 1% 0% 0% biến NF: norfloxacin, CF: ciprofloxacin, LF: levofloxacin, MF: moxifloxacin Mối liên quan đột biến gene gyrA parC MIC Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê diện đột biến hai gene par gyr MIC trường hợp đề kháng Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 với ciprofloxacin (p=0,001), levofloxacin (p=0,001) moxifloxacin (p=0,001) Khơng có mối liên quan có ý nghĩa thống kê đột biến gene (par hay gyr) MIC Bằng chứng hoạt động bơm đẩy norfloxacin Trên mẫu GBS đề kháng với norfloxacin khơng có đột biến, MIC trung bình norfloxacin có reserpine giảm khoảng lần so với khơng có reserpine cho thấy có hoạt động bơm đẩy (Bảng 2) Trên mẫu GBS có đột biến gene (parC hay gyrA), hoạt động bơm đẩy yếu (MIC trung bình giảm 1,6 lần có mặt reserpine) Trên mẫu GBS có đột biến gene gyrA parC, hồn tồn khơng có thay đổi MIC có mặt reserpine chứng tỏ bơm đẩy khơng tồn hay không hoạt động (Bảng 2) Bảng 2: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) norfloxacin có khơng có reserpine 146 mẫu Streptococcus nhóm B (GBS) phân lập từ Hàn Quốc (2006-2008) Phân loại Không có đột biến Nhạy cảm với FQ Đề kháng trung gian với NF Đề kháng NF Đột biến parC hay gyrA Đột biến parC gyrA Giá trị MIC trung Tỷ lệ có bình (µg/mL) hoạt động Số bơm + lượng Reserpin Reserpin đẩy (%) e e 88 13.3 33.9 7.6 12.8 33.3 52.2 17 41 31.5 18.8 30 128 128 NF: Norfloxacin, FQ: fluoroquinolone Khi sử dụng ethidium bromide làm chất nền, chứng hoạt động bơm đẩy phát 54,1% chủng GBS đề kháng với norfloxacin đột biến Tuy nhiên, tỷ lệ đồng thuận hai phương pháp phát bơm đẩy (sử dụng norfloxacin ethidium bromide) mức Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học trung bình (kappa=0,6, khoảng tin cậy 95%: 0,45 – 0,78) MIC norfloxacin chủng GBS ATCC 12403 and A909 (đối chứng âm) µg/mL Khơng có khác biệt MIC norfloxacin chủng thêm reserpine BÀN LUẬN Tỷ lệ đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone, đặc biệt đề kháng norfloxacin, nghiên cứu cao kết nghiên cứu trước (1,6,11) Kết nghiên cứu cho thấy đề kháng ciprofloxacin levofloxacin liên quan đến đột biến gene gyrA hay parC đề kháng moxifloxacin đòi hỏi phải có diện đồng thời hai đột biến gyrA parC Sự khác biệt lý giải dựa cấu trúc phân tử cồng kềnh moxifloxacin Kết nghiên cứu thu tương đồng với kết nghiên cứu trước vị trí ưu tiên tác động fluoroquinolone vi khuẩn gram dương: quinolone không thân nước moxifloxacin ưu tiên công vào gyrase quinolone thân nước ciprofloxacin levofloxacin ưu tiên công vào topoisomerase (7,10) Tỷ lệ đề kháng norfloxacin 1075 mẫu GBS nghiên cứu 93% Tuy nhiên, khơng có đột biến phát mẫu lựa chọn ngẫu nhiên từ trường hợp đề kháng với norfloxacin Kết thử nghiệm cho thấy có chứng hoạt động bơm đẩy 52,2% trường hợp đề kháng với norfloxacin Như vậy, bơm đẩy nguyên nhân dẫn đến đề kháng norfloxacin GBS Trên GBS, hoạt động bơm đẩy dẫn đến đề kháng macrolide(2) tetracycline(1) báo cáo chưa có nghiên cứu hoạt động bơm đẩy fluoroquinolones Kết nghiên cứu phát hoạt động bơm đẩy dẫn đến đề kháng norfloxacin GBS Tuy nhiên, bước khởi đầu Trong tương lai, cần tiến hành thêm 81 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 nhiều nghiên cứu khác để xác định rõ chế đề kháng fluoroquinolone GBS nhằm góp phần vào việc lựa chọn kháng sinh hiệu điều trị phát triển hoạt chất phối hợp thuốc hiệu GBS (Ví dụ: phối hợp chất có tác dụng ức chế hoạt động bơm đẩy fluoroquinolone) Lời cám ơn: Xin chân thành cám ơn TS Glenn W Kaatz, Đại học Wayne State, Detroit, Michigan cung cấp mẫu đối chứng cho nghiên cứu; Quỹ Nghiên cứu Korea Research Foundation, Hàn Quốc Trung tâm MAC-EPID (The Center for Molecular and Clinical Epidemiology of Infectious Diseases), Đại học Michigan, Hoa Kỳ tài trợ cho nghiên cứu 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 Brown MG, Mitchell EH, Balkwill DL (2008) Tet 42, a novel tetracycline resistance determinant isolated from deep terrestrial subsurface bacteria Antimicrob Agents Chemother., 52: 4518–4521 Cai Y, Kong F, Gilbert GL (2007).Three new macrolide efflux (mef) gene variants in Streptococcus agalactiae J Clin Microbiol , 45: 2754–2755 GIBBS RS, SCHRAG S, SCHUCHAT A (2004) Perinatal infections due to group B streptococci Obstet Gynecol ,104: 1062-1076 Gonzalez JJ, Andreu A (2005) Multicenter study of the mechanisms of resistance and clonal relationships of Streptococcus agalactiae isolates resistant to macrolides, lincosamides, and ketolides in Spain Antimicrob Agents and 11 12 Chemother., 49: 2525–2527 Kaatz GW, Mcaleese F, Seo SM (2005) Multidrug resistance in Staphylococcus aureus due to overexpression of a novel multidrug and toxin extrusion (MATE) transport protein Antimicrob Agents Chemother , 49: 1857–1864 Kaatz GW et al (2000) Evidence for the existence of a multidrug efflux transporter distinct from NorA in Staphylococcus aureus Antimicrob Agents Chemother , 44: 1404-1406 KI M et al (2012) Emerging fluoroquinolone resistance in Streptococcus agalatiae from South Korea Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 31: 3199-205 Li X-Z, Nikaido H (2009) Efflux-mediated drug resistance in bacteria: an update Drugs, 69: 1555–1623 MAEDA K et al (2008) Fluoroquinolone-resistant group B streptococci in acute Exacerbation of Chronic Bronchitis Emerging Infect Diseases,14: 349-350 Patel D et al.(2010) Ethidium bromide MIC screening for enhanced eflux pump gene expression or efflux activity in Staphylococcus aureus Antimicrob Agents Chemother 2010; 54: 5070-5073 Savoia D et al (2008) Streptococcus agalactiae in pregnant women: phenotypic and genotypic characters J Infect., 56: 120-125 Wehbeh W et al (2005) Fluoroquinolone-resistant Streptococcus agalactiae: Epidemiology and mechanism of resistance Antimicrob Agents Chemother., 49: 2495-2497 Ngày nhận báo: 13.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 Chuyên Đề Dược Học ... Streptococcus suis (8) chưa có b o cáo GBS Trên nghiên cứu 1075 mẫu GBS phân lập từ b nh phẩm b nh vi n Hàn Quốc, tỷ lệ đề kháng fluoroquinolones cao, đặc biệt norfloxacin (tỷ lệ đề kháng với norfloxacin,... (7) Tỷ lệ đề kháng đặt vấn đề cần xác định chế đề kháng mức độ phân tử vi khuẩn phân lập nhằm góp phần vào vi c lựa chọn kháng sinh hiệu trị liệu nghiên cứu công thức thuốc có hiệu cao GBS ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP... khác biệt MIC norfloxacin chủng thêm reserpine B N LUẬN Tỷ lệ đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone, đặc biệt đề kháng norfloxacin, nghiên cứu cao kết nghiên cứu trước (1,6,11) Kết nghiên cứu