Nghiên cứu bào chế liposome amphotercin B phương pháp bốc pha đẳo Trần Thị Hải Yến, Ngô Thị Bích Phượng, Đào Thị Thùy Dung, Phạm Thị Minh Huệ TrườngĐại họcDượcHàNội SUMMARY Amphotericin B (AMB) is a polyene antifungal drug used intravenously for systemic fungal infection because o f its broad spectrum However its conventional formulation Fungizon (complex o fAMB and sodium deoxycholate) has serious nephrotoxycity To reduce in vivo toxicity o f amphotericin B, various lipid formulations (Ambisome® - unilamellar liposome, Abelcet® - lipid complex and Amphocil/ Amphotec® - colloidal dispersion), have been developed In this study we investigated liposomal formulation o f amphotericin B with soy phosphatidylcholine and cholesterol by reverse-phase evaporation Different formulations with variable content o f cholesterol to total lipid (from 10 to 50 mol%) in different aqueous media (phosphate buffer pH 4.0 and 7.4) were carried out Formulation with 50 mol% cholesterol to total lipid and phosphate buffer pH 7.4 had highest entrapment efficiency (77%), and were the most stable suspension during storage for week (minimum change in size distribution and entrapment efficiency) When AMB content to total lipid was changed from - mol%, encopsulotion efficiency increased up to 89% in formulation with mol% AMB and decreased to 67% in formulation with mol% Từ khóa: liposome, amphotericin B, bốc pha đảo Đặtvấn đề Amphotericin B thuộc nhóm kháng sinh chống nấm polyen, định trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân hoạt tính kháng nấm mạnh phổ tác dụng rộng Cơ chế tác dụng thuốc liên kết với ergosterol màng tế bào nấm để làm tăng tính thấm màng với ion hóa trị Na+, K'", Cl‘, H+ gây chết tế bào nấm Tuy nhiên AMB có lực với cholesterol người nên thể người AMB liên kết với cholesterol màng tế bào, gây tăng tính thấm màng tế bào với ion hóa trị Do chế phẩm tiêm Fungizone (phức hợp AMB với natri deoxycholat) thường gây tác dụng phụ cho bệnh nhân như: tăng K+ huyết, độc thận Vì để giảm độc tính AMB đường tiêm, thị trường dược phẩm xuất số dạng thuốc như: phức hợp với lipid (Amphocel, Amphotec, Abelcet) hay liposome (Ambisome) [1] Liposome có cấu trúc hình cẩu, cấu tạo gổm vỏ bao quanh lõi nước, vỏ cấu tạo từ màng kép phospholipid cholesterol AMB dược chất thân dầu, nằm lớp màng kép phospholipid Hơn nữa, amphotericin B liên kết với cholesterol thành dạng phức hợp bền, tiêm vào thể, dược chất nằm trạng thái liên kết với cholesterol liposome nên giảm độc tính Khi gặp tế bào nấm, lực amphotericin Bvới ergosterol tế bào nấm cao cholesterol nên dược chất lúc liên kết với ergosterol nấm phát huy tác dụng chống nấm [3] Trên giới, có số công trình nghiên cứu vể liposome AMB [2], [4], [6] Việt Nam chưa có thông tin công bố Do vậy, bước đầu nghiên cứu tiến hành bào chế liposome AMB phương pháp bốc pha đảo, đánh giá ảnh hưởng số yếu tố thuộc công thức ảnh hưởng đến đặc tính liposome AMB Nguyên liệu, th iế t bị phưorng pháp Nguyên liệu thiết bị Amphotericin B (USP32) - Ningbo Honor Chemtech Co., Ltd, Trung Quốc; phosphatidyl choline đậu tương (SPC) - Avanti Polar Lipid (Mỹ), cholesterol - Trung Quốc; cloroform - Labscan (Thái Lan); methanol -Trung Quốc Acetonitril methanol dùng cho HPLC - Baker, Mỹ Máy cất quay Evaporator (Buchi, Đức); bình thủy tinh đáy tròn 1000 ml (Buchi, Đức); thiết bị đùn liposome (Eastern Scientific, US); máy sắc ký lỏng hiệu cao (Agilent, Mỹ); Zetasizer ZS90 (Malvern; Anh); Metier Toledo (Thụy Sỹ) Phương pháp nghiên cứu Phương pháp bào chếliposome amphotericin B Liposome amphotericin B bào chế phương pháp bốc pha đảo [9] Hòa tan phosphatidyl cholin đậu tương, cholesterol 15 ml cloroform, AMB 50 ml methanol Phối hợp dung dịch trên, khuấy trộn để thu dung dịch đồng Chuyển dung dịch lipid AMB vào bình cẩu dung tích 1000 ml hệ thống cất quay Tiến hành cất quay điểu kiện nhiệt độ 40 - 41“C, tốc độ quay 150 vòng/phút (v/ph) Sau 30 phút, lớp màng film phospholipid AMB hình thành, tiếp tục cất quay để loại dung môi cách hoàn toàn Hòa tan trở lại lớp màng film lipid AMB 30 ml ether Chuyển hỗn hợp sang bình thủy tinh cổ hẹp có nắp đậy, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat Siêu âm liên tục bể siêu âm (có làm lạnh) 15 phút, nhiệt độ: 10 - 20“Ctạo nhũ tương N/D Cho nhũ tương vào bình cất quay Tiến hành cất quay áp suất giảm để loại ether với điểu kiện: tốc độ quay bình cẩu 100 v/ph, nhiệt độ phòng Sau 15 phút, phẩn lớn ether bay hơi, hệ chuyển sang trạng thái gel Tiếp tục bốc dung môi, sau 10 phút trạng thái gel bị phá vỡ tạo thành hổn dịch liposome Chuyển hỗn dịch sang lọ thủy tinh, tiến hành sục khí nitơ vào hỗn dịch liposome để loại bỏ hoàn toàn vết dung môi lại Hỗn dịch liposome thu đem ép qua màng polycarbonat với kích thước lỗ màng lẩn lượt 400 - 200 - 100 nm sử dụng thiết bị đùn liposome, màng ép 29 lẩn nhiệt độ 50®c, thu hỗn dịch liposome có kích thước nhỏ đồng Liposome AMB đóng lọ thủy tinh, đậy kín, tránh ánh sáng bảo quản - 8“C Đánh giá KĨĨP thếZeta Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP), phân bố KTTP, Zeta phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động với thiết bị đánh giá Zetasizer ZS90 (Malvern, Anh) Mẳu thử pha loãng 100 lán nước tinh khiết lọc qua màng cellulose acetat 0,2 |jm , đo KTTP, phân bố KTTP Zeta Phương pháp định lượng amphoterícin B Amphotericin B hỗn dịch liposome định lượng phương pháp sác ký lỏng hiệu cao với điểu kiện sau: cột Cosmosil 5C18 - MS - II, kích thước cột 250 X 4,6 mm, đường kính hạt nhồi |jm; pha động: hỗn hợp acetonitril (ACN) dinatri edetat 0,02 M (pH 5,0) với tỷ lệ 40:60 (v/v); tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 20 |jl; Detector uv đo bước sóng 405 nm Dung dịch chuẩn AMB: hòa tan dược chất vào methanol, sau pha loãng hỗn hợp acetonitril dinatri edetat 0,02M (pH 5,0) với tỉ lệ 60:40 (v/v) Dung dịch thử: hòa tan hỗn dịch liposome vào hỗn hợp dung môi methanol:cloroform (3:1), sau pha loãng hỗn hợp dung dịch acetonitril: dinatri edetat 0,02M (pH 5,0) với tỉ lệ 60:40 (v/v) Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa Đánh giá hiệu suất liposome hóa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (điểu kiện phẩn định lượng dược chất) Định lượng AMB toàn phẩn: hỗn dịch liposome AMB thô (trước ép qua màng polycarbonat) Định lượng AMB toàn phẩn hỗn dịch liposome thô phương pháp HPLC mô tả thu diện tích pic SI Định lượng AMB gắn lớp vỏ lipid kép liposome: để đánh giá lượng AMB gắn lớp lipid cần loại bỏ phán AMB tự AMB tự không tan môi trường phân tán bị kết tủa bị loại trình ép qua màng polycarbonat (độ tan AMB đệm phosphat pH 4,0 7,4 nhỏ giới hạn định lượng giới hạn phát phương pháp HPLC sử dụng - kết không công bố) Liposome linh động qua màng kết tuả AMB tự lớn lỗ màng bị giữ lại màng [9] Định lượng AMB hỗn dịch liposome sau loại dược chất tự lượng dược chất liposome hóa, thu diện tích peak S2 Hiệu suất liposome hóa xác định công thức: H % = S2/ SI X 100% Phương pháp phân tích nhiệt vi sai (DSC) liposome amphotericin B Li tâm hỗn dịch liposome, tốc độ 12.000 v/ph 45 phút, nhiệt độ 5“C, loại bỏ phẩn dịch phía trên, hỗn dịch liposome đặc phía làm nước bình hút ẩm ngày Cân khoảng - mg liposome nước, đặt đĩa nhôm tích 40 |jL, hàn nắp đĩa nhôm Quét nhiệt khoảng từ 250°c, tốc độ gia nhiệt 5°c/phút Kết nghiên cứu KTTP, phân bố KTTP thê Zeta Để khảo sát ảnh hưởng thành phẩn lipid, pH môi trường phân tán đến kích thước tiểu phân (KTTP) liposome, Zeta, hiệu suất liposome hóa, tiến hành bào chê' liposome AMB có tỉ lệ cholesterohtổng lượng lipid biến đổi từ 10 - 50%, sử dụng hệ đệm phosphat pH 7,4 (Công thức A) pH (Công thức B) làm môi trường phân tán, cố định tỉ lệ dược chất:tổng lượng lipid mol% Đánh giá KTTP, phân bố KTTP Zeta hỗn dịch sau bào chế sau tuẩn bảo quản Kết trình bày bảng Bòng l KĨTP, phân bổKĨĨP thếừta liposome AMB Sau tuần Sau bào chế SPC: Choi (tỉ lệ mol) Công thức KTTP(d.nm) PDI Thế Zeta Zaverage (d.nm) PDI 0,324 -38,3 273,5 0,377 -38,4 259,0 0,292 A552 5:5 273,3 A642 6:4 253,2 A732 7:3 246,5 0,249 -37,2 253,2 0,284 A822 8:2 200,4 0,23 -33,6 214,1 0,263 9:1 167,3 0,24 -30,6 203,1 0,250 B552 5:5 246,1 0,262 -17 249,5 0,270 B642 6:4 168,7 0,247 -16,8 172,7 0,282 B732 7:3 166,4 0,232 -15,9 170,1 0,230 B822 8:2 159,8 0,177 -13,2 168,4 0,202 9:1 143,7 0,140 -123 146,2 0,183 A912 B912 Ị 0,284 vể hình thức: hỗn dịch liposome sau bào chế có màu vàng đục, không quan sát thấy kết tủa dược chất tiểu phân có kích thước lớn Sau bảo quản ngày - s^c không thấy tượng lắng cặn Kết cho thấy hỗn dịch liposome thu có kích thước từ 143,7 - 273,3 nm, số PDI nằm khoảng 0,1 - 0,4, công thức có khoảng phân bố KTTP tương đối hẹp (chỉ số PDI < 0,3) trừ công thức A552 Về Zeta: sử dụng môi trường đệm phosphat pH 7,4 thu liposome có giá trị tuyệt đối Zeta cao (>30 mV) so với sử dụng dung dịch đệm phosphat pH 4,0 Đối với hệ dị thể giá trị tuyệt đối thê' Zeta > 30 cho độ ổn định vật lý tốt Sau tuẩn bảo quản - s^c, không thấy có kết tụ tiểu phân kích thước lớn lắng xuống đáy lọ Tuy nhiên, KTTPvà giá trị PDI mẫu liposome có xu hướng tăng, cho thấy có tượng kết tụ tiểu phân để tạo thành tiểu phân có kích thước lớn Hiệu suất liposome hóa Các mẫu liposome thu có hiệu suất liposome hóa từ 50,0 - 77,7% Trong đó, mẫu cho hiệu suất cao công thức A552 với tỷ lệ choi: tổng lipid 50%, môi trường phân tán dung dịch đệm phosphat pH 7,4 Bỏng Hiệu suát liposome hóa cũa liposome AMB Công thức SPCChol (tỷ lệ mol) Hiệu suất sau bào chế Hiệu suất sau tuần A552 5:5 77,7 77,2 A642 6:4 77,1 76,7 A732 7:3 75,4 73,1 A822 8:2 73,7 71,4 A912 9:1 71,7 67,6 B552 5:5 67,7 67,5 B642 6:4 60,8 60,1 B732 7:3 59,0 56,7 B822 8:2 57,9 54,5 B912 9:1 50,0 45,5 Tỉ lệ DC: tổng lượng lipid Chúng chọn tỉ lệ Choi: SPC 5:5, môi trường phân tán đệm phosphat pH 7,4 để tiếp tục nghiên cứu khả nạp dược chất vào liposome Tiến hành tăng tỷ lệ dược chất: tổng lượng lipid lên mol% (cr A553) mol% (CT A554) nhằm giảm hàm lượng lipid sử dụng làm chất mang dược chất Bảng Liposome AMB với tỉ lệ Dữống lượng lipidkhác Công thức Nổngđộlỉpid (mM) AMB:tổng lipid (% mol) KTTP (d.nm) PDI Hiệu suất liposome hóa (o/o) A552 50,0 273,3 0,324 77,65 A553 33,3 288,0 0,262 89,5 A554 25,0 220,5 0,261 60,8 Bàn luận VểKTTP,phânbốKĨJP Màng liposome amphotericin B cấu tạo từ phospholipid đậu tương, cholesterol dược chất Khi tăng tỷ lệ SPC, giảm tỷ lệ cholesterol hỗn dịch liposome thu có KTTP nhỏ đồng (giá trị PDI có xu hướng giảm) Nguyên nhân tượng có mặt cholesterol làm cho lớp màng lipid kép trở nên cứng hơn, giảm tính linh động lớp màng khiến cho tiểu phân liposome khó qua màng polycarbonat trình đùn ép giảm KTTP Điểu dẫn đến việc tăng tỷ lệ cholesterol tính rắn lớp màng lipid tăng lên, lực nén tác động để đẩy hỗn dịch liposome qua màng tăng, làm giảm tính chất nguyên vẹn lớp màng polycarbonat, KTTP công thức liposome đểu lớn kích thước lỗ màng polycarbonat Mặt khác, AMB tự không liposome hóa, không tan đệm phosphat pH 4,0 - 7,4 (kết thử độ tan nghiên cứu) nên tồn dạng kết tủa Những kết tủa cản trở trình đùn làm bít tắc lỗ màng ảnh hưởng đến kết đo 1 / Phổ DSCcủa phosphQtidỵlcholin đậu tương LigoaiOMC ầmB AHP, KJ0A2QD ISJL3B AMP i.74m m i c » ■ Cnahatơol 16W.aai3 17^2535“ Cfiab5te.al 5.-S«» mọ I'Ceqsjl ^ ra'm ềKứ Qmtĩ, Iitagiđi iQondit«! Oflset ^Ũ5 47.Ỉ 16 :S :1 - i Diugui ... Anh); Metier Toledo (Thụy Sỹ) Phương pháp nghiên cứu Phương pháp b o ch liposome amphotericin B Liposome amphotericin B b o chế phương pháp b c pha đảo [9] Hòa tan phosphatidyl cholin đậu tương,...giới, có số công trình nghiên cứu vể liposome AMB [2], [4], [6] Việt Nam chưa có thông tin công b Do vậy, b ớc đầu nghiên cứu tiến hành b o chế liposome AMB phương pháp b c pha đảo, đánh giá ảnh... sử dụng phương pháp b c pha đảo để b o chế liposome amphotericin B, sử dụng phương pháp ép qua màng polycarbonat kích thước 100 nm để loại kết tủa AMB tự Nghiên cứu liposome AMB có tỉ lệ cholesterol,