ầ .Nghiên cứu bào chẽ niosome và liposome đàn hồi acyclovir bằng phương pháp hydrat hóa màng VŨ Thị Thu Giang*, Nguyễn Thị Hà*, Trần Thị Oanh** "'Trường Đợi học Dược Hà Nội ** Cục Kho
Trang 1ầ
Nghiên cứu bào chẽ niosome và
liposome đàn hồi acyclovir bằng
phương pháp hydrat hóa màng
VŨ Thị Thu Giang*, Nguyễn Thị Hà*, Trần Thị Oanh**
"'Trường Đợi học Dược Hà Nội
** Cục Khoa học Công nghệ & Đào tạo, Bộ Y tế
SUMMARY
The study was designed to develop aq^clovir containing elastic liposomes and niosomes by the conventional thin film hydration method The effort was made to study whether acyclovir-haded vesicles could enhance the in vitro permeability o f the drug by using artificol membrane Vesicular size distributions were good in both cases o f the niosomes and the elastic liposomes with PDI < 0.3 The percentage o f drug boding varied and the niosomal vesicles contained less drug but showed better stability than those o f elastic liposomes The results also showed that prepared liposomes could enhance acyclovir permeability through artifical membrance from 2.84 to 4.78 times compare to the free drug solution So the liposomal formulation could be a promising delivery system for acyclovir with improved permeability.
Từ khóa: acyclovir, niosome, liposome đàn hổi, hydrat hóa màng.
Đặt vấn đề
Cho đến nay, liposome thường được các nhà bào
chế nghiên cứu như một chất mang thuốc với mục
đích bảo vệ dược chất, kéo dài tác dụng, đưa thuốc
tới đích hay cải thiện tính thấm của dược chất qua
màng sinh học
Để cải thiện thấm acyclovir (AG/) qua màng
sinh học, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên
cứu bào chế các loại liposome ACV khác nhau
như liposome qui ước [5], [6], [7], ethosome [3],
liposome đàn hồi [4] và niosome [2] Liposome đàn
hổi trong thành phẩn có thêm các chất diện hoạt
không ion hóa nên màng lipid có khả năng đàn
hổi cao Các nghiên cứu cho thấy liposome đàn hồi
có hiệu suất chế tạo cao hơn và cải thiện đáng kể
khả năng thấm thuốc so với liposome qui ước [4],
Niosome có cấu trúc tưđng tự liposome (các phân tử chất diện hoạt không ion hóa được dùng thay thế các phospholipid) được nghiên cứu rộng rãi do có đắy đủ
ưu điểm của liposome, chi phí bào chế thấp và độ ổn định cao hơn Xu hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào các dạng niosome, ethosome, liposome đàn hồi
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu bào chế liposome đàn hổi và niosome chứa ACV bằng phương pháp hydrat hóa màng, đánh giá được khả năng cải thiện thấm và độ ổn định của liposome bào chế
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
Nguyên vật liệu
So 2/2013 1 Nghiên Cứu duộclhông tin th uõ c 43
Trang 2Acyclovir (Trung Quốc - BP), lecithin (Trung
Quốc - BP), phosphatidylcholin (PC, Mỹ - USP), Span
80 (TrungQuốc - BP), cholesterol, n-octanol, kali,
dihydrophosphat, natri hydroxyd (Trung Quốc -
TKHH), ethanol 96% (Việt Nam - TKHH), nước cất
(DĐVN), Triton X I00 (Mỹ - TKHH) túi thẩm tích
Spectra/Por 4 MWC012 -14 kD (Spectrum iabrotory
- Mỹ), màng cellulose acetat 0,2 ụnn (Sartorius)
Thiết bị
Máy cat quay ROTAVAPO R210 BUCHI; Hanson
Research; UV-Vis Hitachi U-1800; Hệ thống sắc ký
lỏng hiệu năng cao Shimadzu; Ultrasonic LC 60H;
Kính hiển vi điện tửtruyển qua JEOL 1010; Zetasizer
Nanoseries ZS90, pH Inolab
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp bào chế liposome
Hòa tan phospholipid và Span 80 tỷ lệ 85:15
(% kl/kl) trong hỗn hợp dung môi cloroform -
methanol (2/1, tt/tt) cất quay dưới áp suất giảm ở
nhiệt độ 40°c trong 12 giờ cho dung môi bay hơi
hoàn toàn Lớp film lipid mỏng tạo thành bám đểu
trên bình cẩu được hydrat hóa bằng dung dịch đệm
phosphat 0,1 M; pH 6,5 chứa ACV 1 mg/ml ở nhiệt
độ 50°c trong 60 phút Hỗn dịch liposome đàn hồi
ACV tiếp tục được siêu âm bằng thiết bị Ultrasonic
LC 60H với tẩn số 35 kHz trong 8 phút ở 5°c để giảm
kích thước tiểu phân Niosome ACV được bào chế
tương tự nhưng thay phosphatidylcholin bằng
cholesterol: Span 80 tỷ lệ 1:1 (|jmol/|amol)
Phương pháp phân tích
Định lượng dược chất
Acyclovir trong liposome được định lượng bằng
phương pháp HPLC pha đảo Điểu kiện sắc ký: Cột
ZORBAX SB C18 (4,6 X 150 mm, 5 |jm), bảo vệ cột
ZORBAX 300 SB C18 (4,6 X 12,5 mm, 5 |jm), nhiệt độ
phòng Pha động: hỗn hợp dung dịch acid acetic
0,02 M và methanol tỷ lệ 90:10 Detectơ uv, đo ở
bước sóng 252 nm Tốc độ dòng 1 ml/phút Thể tích
tiêm mẫu 100^1
Xử lý mẫu: lấy chính xác 1 ml liposome ACV trộn
với 1 ml Triton X I00, để yên trong 10 phút Pha loãng
tới nồng độ khoảng 10 ụg/ml bằng dung dịch đệm
phosphat 0,1 M; pH 6,5 Lọc qua màng 0,45 |jm
Xác định tỷ lệ liposome hóa
H% = 1
H : tỷ lệ liposome hoá (%) khối lượng ACV tự do : khối lượng ACV toàn phẩn Tách ACV tự do khỏi liposome ACV bằng phương pháp thẩm tách với túi thẩm tích trong 16 giờ Lượng ACV tự do được xác định bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 252 nm
Đánh giá kích thước tiểu phân
Kích thước và phân bố kích thước tiểu phân được xác định bằng thiết bị Zetasizer nanoseries ZS90 Mẳu liposome được pha loãng 80 lần trước khi đo
Đánh giá cấu trúc liposome
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 để nghiên cứu cấu trúc của liposome bằng kỹ thuật chụp nhuộm soi âm bản
Phương pháp đánh giá tính thấm
Dùng thiết bị Hanson Research:
- Ngăn cho: 1 ml hỗn dịch liposome
- Ngăn nhận: 7 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 M;pH 6,5
- Thiết bị được điều nhiệt ở 37 ± 0,5°c trong thời
gian thí nghiệm
- Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút
- Màng thử tính thấm: ngâm màng cellulose acetat0,2 |jm 1 giờ trong pha dắu (1,5%lecithin-1% Cholesterol - 97,5% n-octanol), sau đó đặt vào giữa 2
tờ giấy thấm để loại phẩn dẩu thừa [1]
- Tiến hành định lượng ACV khuếch tán qua màng bằng phương pháp HPLC pha đảo (điều kiện sắc ký như phương pháp định lượng dược chất) Mỗi thí nghiệm được làm 3 lẩn và lấy kết quả trung bình
Đánh giá độ ổn định liposome
Các mẫu liposome bào chế được bảo quản ở nhiệt độ 4-8°C và định kỳ đánh giá các chỉ tiêu: phân
bố kích thước, hàm lượng ACV còn trong liposome
Kết quả và bàn luận
Nghiên cứu bào chếniosome ACVbằng kỹ thuật bỵdrat hóa màng
Chọn tỷ lệ cholesterol/Span 80
Bào chế 3 mẫu niosome với tỷ lệ cholesterol/Span
Trang 380 (Ch/Sp) khác nhau Kết quả nghiên cứu được trình
bày trong bảng 1
Bỏng l Hiệu suất niosome hóo, kích thước niosome khi thoỵ đổi tỷ lệ Ch/Sp
Mẫu
N2
N3
Ch:Sp
(|jmol)
1:1
2:1
3:1
Hiệu
suằt
17,89
12,45
10,34
PDI
0,180 0,224 0,267
KTTB (d.nm) 124,6
120,2
142,3
KTTB trong mỗi peak (d.nm) 151,2 170,2 157,9
% theo cường độ
100 100
97,8
Độ rộng pedk (d.nm) 67,43 20,78 11,09
Khỉ tăng lượng cholesterol hiệu suất niosome
hóa giảm từ 17,89% xuống còn 1034% ở tỷ lệ 1/1
theo ịimol đạt được hiệu suất niosome hóa cao nhất
Đồng thời hệ số phân tán tăng dần, kích thước tiểu
phân trung bình (KTTB) cũng tăng Vậy tỷ lệ Ch:Sp
được chọn là 1:1 (|imol/ịamol) để tiếp tục nghiên cứu
Chọn tỷ lệ dược chât
Cổ định tỷ lệ các lỉpid, 3 công thức N4, N5, N6
được bào chế với nồng độ ACV khác nhau trong
dung dịch đệm phosphat 0,1 M; pH 6,5 Kết quả thu
được thể hiện trong bảng 2
Bỏng 2 Hiệu suẫtíìiosome hóa VQ kích thước niosome khi thoỵ đổi nông độ ẢCV
Mẫu
Nồng
độACV
(mg/
ml)
Hiệu
suằt
(%)
PDI KTTB (d.nm)
KTTB trong mỗi peak (d.nm)
% theo cường độ
Độ rộng peak (d.nm) N4 1 18,56 0,211 139,98 148,09 100 35,6
N5 1,66 11,79 0,269 143,2 159,24 100 19,1
N6 2 8,92 0,273 131,87 142,76 100 39,08
Hiệu suất niosome hóa của mẫu N4 lớn nhất là
18,56% khi càng tăng lượng ACV thì hiệu suất càng
giảm do khi ACV đã niosome hóa một cách tối đa và
đạt trạng thái bão hòa thì dù có tăng thêm dược chất
cũng không gắn vào liposome được nên hiệu suất lại
giảm đi Tỷ lệ dược chất nhìn chung ít ảnh hưởng tới
phân bố kích thước niosome
Bào chế liposome đàn hổi
Chọn tỷ lệ phosphatidylcholin/SpanSO
Các mẫu liposome đàn hổi được bào chế với tỷ lệ
phosphatidylcholin/ SpanSO (PC/Sp) khác nhau Kết
quả đánh giá hiệu suất và kích thước liposome được
trình bày trong bảng 3
4
Bẳngì Hiệu suất liposome hóo, kích thước liposome khi thúy đổi tỳ lệ PỮSp
Mẫu PC/Sp (kl/kÌ)
Hiệu suằt (%)
PDI KTTB (d.nm)
KTTB trong mỗi peak (d.nm)
% theo cường độ
Độ rộng peak (nm)
LI 95:5 33,21 0,127 140,3 179,4 88,09 13,09
88,27 11,91 191 L2 90:10 37,90 0,104 139,3 147,34 100 33,21 L3 85:15 38,98 0,099 121,6 140,09 100 27,43 L4 80:20 34,09 0,116 120,2 138,15 100 12,01 L5 75:25 32,21 0,152 105,3 129,65 100 323,19
Khi tăng Span 80 từ 5% lên 15% hiệu suất liposome hóa cũng tăng từ 33% lên 39% do tăng tính đàn hổi, linh hoạt của lớp màng liposome Nhưng tiếp tục tăng Span 80 lên 25%, hiệu suất bào chế giảm xuống 32% Nguyên nhân có thể do nồng độ chất diện hoạt cao hơn nổng độ mixen tới hạn đã hình thành các mixen trong hỗn hợp dung môi làm giảm hiệu suất bào chê' liposome Vì vậy,
tỷ lệ PC/Sp là 85/15 (% kl/kl) được chọn để tiếp tục nghiên cứu
Ảnh hưởng của loại lipid
Mẫu liposome L6, L7 được bào chế với nguyên liệu lipid lẩn lưcrt là PC, lecithin (cùng tỷ lệ) Kết quả nghiên cứu thể hiện trong bảng 4
Bâng 4 Hiệu suất lipome hóa, kích thước lipome bào ché với các lipid khác nhau
Mẫu
Hiệu suất (%)
PDI KTTB (d.nm)
KTTB trong mỗi peak (d.nm)
% theo cường độ
Độ rộng peak (d.nm) L6 39,57 0,085 59,51 74,53 100 22,01
L7 16,90 0,256 137,7 138,2 89,4 17
1838 10,6 190,16
Hiệu suất của liposome bào chế từ PC (mẫu L6)
là 39,57% cao hơn hẳn so với nguyên liệu là lecithin (mẫu L7) chỉ đạt 16,9% Mầu L7 có kích thước tiểu phân lớn, phân bố kích thước rộng, PDI lớn (0,256),
số lượng peak nhiểu hơn so với mẫu L6 Nguyên nhân do sự khác nhau vể mức độ tinh khiết của lecithin và PC Lecithin ngoài PC còn bao gồm cả thành phẩn khác như acid phosphoric, acid béo, glycerol có thể ảnh hưởng tới cấu trúc của lớp màng liposome dẫn đến ảnh hưởng tới hiệu suất
và phân bố kích thước Vậy PC được chọn để tiếp tục nghiên cứu
Trang 4Đánh giá hình thái và tính thấm của liposome
bào chế
Tiến hành bào chế hai mẫu liposome, niosome
theo các thông số kỹ thuật và thành phẩn đã chọn
sau đó đánh giá hình thái, phân bố kích thước và
khả năng cải thiện thấm ACV của liposome bào chế
Kết quả thể hiện trong hình 1 và 2 cho thấy mẫu
liposome đàn hồi có kích thước nhỏ hơn và phân bố
kích thước tương đối đổng đểu so với mẫu niosome
Mẫu niosome, tiểu phân tụ lại thành đám kích thước
lớn hơn
* 005
? r i n t M a g ; SOIOOx 9
ỉ:4 » : 5 » p 0 4 ^ 1 7 ^ 1 2
Hag: I(7«oex » Ỉ1 n
/ Ảnh chụp TEM ỉĩĩỗu liposome đàn hổi (o) vò niosomeAữ (b)
10« |W
m ^ to ak v
D irsc t Mag; toooox
BMLab-Mll«
liposome ACV niosome ACV ACV tự do
H'inh 1 Tỷ lệ ACV thấíĩì qua màng nhân tọo từ cóc mẫu nghiên cứu (n=3)
Bảng 6 Phân bố kích thước liposome ĩíong quá trình báo quỏn
Có thể nhận thấy do hiệu suất liposome hóa cao hơn cùng với khả năng đàn hổi tốt nên lượng ACV trong mẫu liposome thấm qua màng nhân tạo nhiểu nhất (13,25% sau 8 giờ), tiếp đến là mẫu niosome (7,89%) và thấp nhất là dung dịch ACV tự
do (2,78%) Như vậy liposome đàn hổi và niosome làm tăng thấm AG/ qua màng nhân tạo lẩn lượt là 4,76 và 2,84 lẩn so với dung dịch ACV tự do Kết quả này mở ra triển vọng trong việc ứng dụng liposome đàn hổi và niosome để cải thiện tính thấm của ACV qua màng sinh học
Độ ổn định của liposome bào chê'
Các mẫu liposome đàn hồi và niosome bào chê được theo dõi độ ổn định ở nhiệt độ 4 - 8“C Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 5 và 6
Sau 10 ngày, nổng độ ACV trong các mẫu hầu như không thay đổi nhưng tỷ lệ ACV liposome hóa trong mẫu liposome đàn hồi giảm từ 39 xuống 27,56% (giảm 30% so với ban đẩu) Mẫu niosome
có tỷ lệ ACV liposome hóa ổn định hơn: giảm từ 17 xuống 15,43% (giảm 10% so với ban đẩu) PDI trong
cả hai trường hợp đểu tăng nhưng vẫn duy trì ở mức nhỏ hơn 0,3 cho thấy kích thước liposome vẫn phân
bố khá đồng đều Kết quả nghiên cứu cho thấy trong phạm vi nghiên cứu, niosome ACV ổn định hơn so với liposome đàn hổi ACV
Bàng 5 Sự biễn đổi tỷ lệ lipmme hóũ khi bảo quản Ởnhiệtđộ3-5ĩ(n=3)
Mẫu % liposome hóa Ban đẩu Sau 3 ngày Sau 5 ngày Sau 10 ngày Liposome 39,06 33,41 31,14 27,56 Niosome 17,00 16,59 16,09 15,43
Thời gian
Liposome Nỉosome KTTB
(d.nm) PDI
KTTB trong mỗi peak (d.nm)
% theo cường độ
KTTB (d.nm) PDI
KTTB trong mỗi peak (d.nm)
%theo cường độ Sau khỉ BC 53,19 0,101 59,71 100 106,4 0,116 122,4 100 Sau 3 ngày 58,31 0,146 65,94 100 107,0 0,135 115,8 100 Sau 5 ngày 59,37 0,236 81,98 100 109,7 0,135 122,2 100 Sau 10 ngày 65,49 0,292 170 90,8 124,6 0,180 151,2 100
1979 9,2
Trang 5Kết luận
Chúng tôi đã nghiên cứu khảo sát và xây dựng
được công thức liposome đàn hổi và niosome bào
chế bằng phương pháp hydrat hóa màng
Kết quả nghiên cứu cho thấy lỉposome đàn hổi và
nỉosome có khả năng cải thiện thấm AG/ rất tốt qua
màng nhân tạo mô phỏng cấu trúc màng sinh học
Trong đó liposome đàn hổi làm tăng khả năng thấm dược chất lên 4,78 lần và niosome làm tăng 2,84 lẩn
so với dung dịch ACV tự do
Kết quả sơ bộ nghiên cứu độ ổn định còn cho thấy mẫu niosome có độ ổn định cao hơn liposome đàn hổi Kết quả thu được là tiền để để tiếp tục nghiên cứu ứng dụng liposome ACV trong các dạng bào chế nhằm cải thiện sinh khả dụng của chế phẩm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Vũ Thị Thu Giang, Đỗ Thu Hằng, Phạm Thị Minh Huệ, Võ Xuân Minh (2008), "Nghiên cứu biện pháp làm tăng tính thấm của acyclovir",
ĩạọ chí Dược học, 390, tr 9-14.
2 Attia lA , El-Gizawy S A , etal (2007), "Influence of a niosomal formulation on the oral bioavailability of acyclovir in rabbits", AAPS
PhơrmSciTech, 8(4), p E l06.
3 Horwitz E., PIsanty s., e t al (1999), "A clinical evaluation of a novel liposomal carrier for acyclovir in the topical treatment of recurrent herpes labialis", Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., 87(6), pp 700-705.
4 Jain S.K., Gupta Y., etal (2008), "Enhanced transdermal delivery of acyclovir sodium via elastic liposomes" Drug Del., 15(3), pp 141-147.
5 Jain S.K., Jain R.K., etal (2005), "Design and development of multivesicular liposomal depot delivery system for controlled systemic delivery of acyclovir sodium", AAPS PharmSciTech, 6(1), pp E35-41.
6 Law S L., Huang K J., etol (2000), "Acyclovir-containing liposomes for potential ocular delivery Corneal penetration and absorption",
1 ControL ReL, 63(1-2), pp 135-140.
7 Mukherjee B., Patra B., etal (2007), "Sustained release of acyclovir from nano-liposomes and nano-niosomes: An in vitro study", In tJ
Nanomed.,2{2), pp 213-225.
So 2/20131 Nghiên cứuduợcThông tin thuõc 47