Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phương pháp tự nhũ hóa

Tóm tắt Hệ tiểu phân nano artesunat được hình thành bằng phương pháp tự nhũ hóa khi sử dụng hệ chất mang gồm Chất diện hoạt - Chất đồng diện hoạt - Dầu.. Các khảo sát trên nhiều chất man

NGHIÊN CỬU BÀO CHÉ TIẺU PHÂN NANO ARTESUNAT

BẰNG PHƯƠNG PHÁP T ự NHŨ HÓA

ĐănR Tuấn A nh‘ HDKH: ThS Nguyễn Hạnh Thủy^ PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến^

‘hớp M1K64 - Trường Đại học Dược Hà Nội

^Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường Đại học Dược Hà Nội

Từ khóa: artesunat, tiểu phân nano artesunat, tự vi nhũ tương hóa, SMEDDS.

Tóm tắt

Hệ tiểu phân nano artesunat được hình thành bằng phương pháp tự nhũ hóa khi sử dụng hệ chất mang gồm Chất diện hoạt - Chất đồng diện hoạt - Dầu Các khảo sát trên nhiều chất mang phổ biến dùng cho nhũ tương cho thấy hệ Transcutol

HP - Labrasoỉ - Labrafil cho kết quả khả quan nhất dựa trên các đặc tính được xem xét: khả năng hình thành nhũ tương, độ ổn định nhũ tương, độ tan - độ ổn định của dược chất, kích thước tiểu phân.

Đặt vấn đề

Artesunat (ART) là một dược chất được bán tổng họp từ Artemisinin, tác dụng chính được biết đến là điều trị sốt rét [7] Nghiều nghiên cứu cho thấy ART có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt được các tế bào ung thư, và đang mở ra nhiều hướng nghiên cứu nhằm đưa ART đến đích tác dụng là các tế bào ung thư [4, 6] Khi sử dụng đường uống sinh khả dụng của ART khá thấp do đặc tính cấu tạo phân tử nhạy cảm với môi trường đường tiêu hóa, do khả năng hấp thụ qua niêm mạc hoặc các kênh riêng trong đưòng tiêu hóa không tốt Để cải thiện các đặc tính dược động học của ART, việc đưa ART vào một hệ chất mang tạo ra các siêu vi nang có kích thước nano đảm bảo sự ổn định, cải thiện sinh khả dụng và khả năng giải phóng dược chất

so với các dạng bào chế đường uống thông thường là một việc cần thiết [2, 3]

Có nhiều chất mang, hệ chất mang có những đặc tính phù hợp: hòa tan tốt - nâng cao độ ổn định của dược chất, không độc, dễ sử dụng và cải thiện khả năng giải phóng dược chất như Transcutol p/ HP, Labrasol, Labraíĩl, Tween 80, Cremophor RH40 [1, 5],

Nghiên cứu này đề cập tới việc lựa chọn chất mang, hệ chất mang phù họfp tạo ra một hệ tự nhũ hóa vi nhũ tương ưu việt khắc phục các điểm yếu dược động học của dược chất Các tiêu chí lựa chọn sẽ được đánh giá dựa trên; Khả năng hòa tan dược chất, khả năng duy trì độ ổn định dược chất, khả năng giải phóng dược chất, kích thước tiểu phân

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu

Artesunat (ART) từ Sao Kim Pharma (Hà Nội, Việt Nam), Transcutol HP, Transcutol p, Labrafil M 1944 c s , Labrasol, Acrysol K-100, Plurol từ SapharChem (Sài Gòn, Việt Nam), Tween 80, Tween 60, Span 80 từ Trung Quốc, Cremophor RH

40 từ Dow Com Methanol, acetonitril (ACN), ethanol đạt tiêu chuẩn HPLC, các hóa chất khác đạt tinh khiểt hóa học

Phương phảp nghiên cứu

Đánh giả độ tan, độ ổn định của artesunat trong các chất mang: Thêm từ từ

ART vào microtube 2 ml chứa chính xác khoảng Ig chất mang Hỗn họp được votex trong 15 phút ART không tan thêm, rồi để cân bằng quá trình hòa tan trong 12 giờ ở điều kiện phòng Sau đó đem ly tâm hỗn hçfp, lọc qua màng 0,45)im, pha loãng dịch trong bằng ACN định lượng ART bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký như ở dưới Các thành phần cho hệ chất mang được lựa chọn dựa vào độ tan, độ ổn định của ART trong đó Phần còn lại của dịch trong để ở điều kiện phòng, theo dõi

độ ổn định của ART

Định lượng hàm lượng dược chất trong hệ tự nhũ hỏa bằng HPLC: Cân

chính xác khoảng 100,0 mg mẫu thử, hòa tan ừong 10,0 ml ethanol rồi tiêm vào hệ thống sắc ký Các điều kiện sắc kí sử dụng: Cột Agilent C l 8-150 mm X 4,5 mm, 5

^m, pha động: Đệm phosphat pH 3:acetonitril - 50:50; tốc độ dòng; 1 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 20 ^1; bước sóng: 216 nm

Xây dựng giản đồ pha: Hệ gồm 3 thành phần: Chất diện hoạt - chất đồng diện

hoạt - dầu sẽ được thử khả năng tạo thành vi nhũ tưofng Hỗn hợp 0,2 ml 3 thành phần trên theo các tỉ lệ khác nhau được nhỏ vào 300 ml nước trong cốc thủy tinh ở 37°c, khuấy nhẹ bàng khuấy từ Quan sát xu hướng tạo thành vi nhũ tương Vi nhũ tương được coi là “tốt” nếu các giọt phân tán nhỏ trong nước, dịch tạo thành trong hoặc trong mờ; và được coi là “xấu” nếu tạo thành dịch sữa hoặc các giọt bị tụ lại Các hệ tạo thành sau đó được thêm dược chất ở lượng vừa đủ, tiến hành nhũ hóa vào môi trường nước sau đó đem đo kích thước tiểu phân Giản đồ pha được xây dựng từ các vùng hệ cho kích thước tiểu phân nhỏ hơn 1000 nm

Khả năng tự nhũ hóa và độ ổn định của các hệ chất mang: Trên giản đồ pha,

các hệ tạo vi nhũ tương được chọn để thử khả năng tự nhũ hóa và đánh giá độ ổn định 0,2 ml hệ được nhỏ vào cốc 300 ml nước trong 2 điều kiện; có sử dụng lực khuấy và không sử dụng lực khuấy So sánh thời gian hình thành vi nhũ tương của

các hệ Đồng thời, quan sát sự biến đổi về màu sắc, sự phân lớp của các hệ được chọn trên Hệ có khả năng tự nhũ hóa tốt nhất và ổn định nhất sẽ được lựa chọn tiến hành các khảo sát tiếp theo

Kết quả

Đánh giá độ tan của artesunat trong chất mang:

Bảng 1 Ket quả tính toán độ tan của artesunat trong chất mang

-hòa tan artesunat tốt nhất nên được lựa chọn là chất đồng diện hoạt trong hệ tự vi nhũ tương; Labrafil M l 944 cs làm pha dầu và chất diện hoạt có thể là Labrasol, Tween 80 hoặc Cremophor RH 40

Giản đồ pha

M I ! jim>ci!tol I IP - 1 abrasnl - I ahralll M2: I ỉ l l ’ - R IU O - t.abratìl

VranvHI’

M3, i í^iiNCiiioị H I '- ! uccn XO - l.abraftl

\1J I fiinsciiu»! í‘ - I iibr-jsol -1 thMliH M.v I nnvoiiiol I' - RIMÍ) - 1 ahwsol

Hình 1 Giản đồ pha các hệ tự nhũ hóa M l, M2, M3, M4, M5, M6.

Trong đó: M I là: Trasnscutol HP - Labrasoỉ - Labrafil; M2 là Trasnscutol HP- Cremophor RH40 - Labrafil; M3 là Tmnscutol HP - Tweeen 80 - Labrafil; M4 là Transcutol p - Labrasol - Labrafil; M5 là Transcutol p - Cremophor RH40 - Labrafil; M6 là Transcutol p

- Tween 80 - Labrafil.

Ket quả Ở hình 1 frên cho thấy rằng, 6 hệ được tạo thành từ 6 chất mang đều

có khả năng tạo vi nhũ tương, trong đó hệ M 1 và M4 vùng tạo vi nhũ tương giống nhau Vùng tạo vi nhũ tương của các hệ khá rộng, đặc biệt là hệ có chứa Cremophor

RH 40 (M2 và M5), điều này đem lại nhiều lựa chọn cho việc xây dựng và xác định công thức để tiến hành thử nghiệm, tuy nhiên có khả năng trong vùng đó có những vùng tạo micell Việc đo kích thước tiểu phân sẽ xác định rõ ràng phân vùng vi nhũ tương và vùng tạo micell của các hệ Kết quả đo kích thước tiểu phân (ở bảng 5) của các hệ đã được ghi nhận, kết quả cho thấy không có sự hình thành micell

Bảng 2 cho thấy kích thước tiểu phân hệ M5 trước khi cho thêm dược chất, ở các điểm mà dịch nhũ hóa khi tạo thành quan sát bằng mẳt thường thấy trong suốt

Bảng 2: Kết quả đo kích thước tiểu phân hệ

M5: Transcutol p - Cremophor RH 40 - Labrafil (nm)

Khä năng tự nhũ hóa và độ ỗn định của các hệ chất mang

Các tỉ lệ khác nhau của các hệ chất mang M1-M6 được theo dõi ở điều kiện thường và quan sát sự biến đổi về màu sắc, thể chất trong 4 tuần Đánh giá các hệ ở

tỉ lệ dầu là 30%, tỉ lệ chất diện h o ạ t: đồng diện hoạt thay đổi theo tỉ lệ từ 3:7 đến 7:3

Bảng 3 Kết quả theo dõi độ ổn định của hệ chất mang

Sau 28 ngày 100% các tỉ 100% các tỉ Sau 28 ngày, 100% các tỉ 100% các tỉ các hệ vẫn lệ có sự phân lệ có sự phân các hệ vẫn lệ có sự tách lệ có sự phân ổnđịrứi lóp sau 7 lóp sau 25 ổn định lớp sau 14 lớp sau 28

Các quan sát cụ thê cho thây, ở hệ M2 và M5, hỗn hợp chât mang càng sử dụng nhiều Cremophor RH 40 thì tách lớp càng sớm Các hệ M3 và M6 ổn định hơn, nhưng sau 28 ngày, cả 2 hệ đề có sự tách lóp, sự tách lóp của các hệ cũng như

hệ M2 và M5, nghĩa là hỗn họp sử dụng nhiều Tween 80 sẽ tách lớp trước Hệ MI

và M6 ổn định nhất khi không có sự biến đổi về thể chất, màu sắc Khả năng tự nhũ hóa của các hệ cũng được đánh giá thực nghiệm trên các tỉ lệ cụ thể, tỉ lệ pha dầu là 30%, tỉ lệ chất diện h o ạ t: đồng diện hoạt thay đổi từ 3:7 đến 7:3

Bảng 4 Khả năng tự nhũ hóa của các hệ

Tôc độ tạo VNT Ngay lập Khuây Khuây Ngay lập Khuây Khuây

tức khi mạnh nhẹ 20s tức khi nhỏ mạnhlp 30s

nước

Các hệ M2, M3, M5, M6 khi không sử dụng lực khuấy, pha dầu vẫn phân tán vào nước nhưng tạo ra các giọt lớn, quan sát rõ bằng mắt thường và có xu hướng kết

tụ lại với nhau Với 4 hệ chất mang này, chỉ khi có lực khuấy thì mới có sự hình thành vi nhũ tương ở các tỉ lệ xác định Theo quan sát cường độ và biên độ lực khuấy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành nhũ tương, vi nhũ tương của các hệ này Hệ M I và M4 hình thành vi nhũ tương ngay trong điều kiện không sử dụng lực khuấy với tốc độ nhanh, gần như ngay lập tức khi có sự tiếp xúc của hỗn họp chất mang với nước.Theo các kết quả của các thí nghiệm này, có thể thấy rằng hệ chất mang MI và M4 cho những kết quả khả quan nhất Các thử nghiệm tiếp theo của nghiên cứu sẽ tiến hành trên hệ M I và M4

Độ tan của artesunat trong hệ chất mang

Các thử nghiệm về độ tan của artesunat trong M I đã được tiến hành với các tỉ

lệ chất mang khác nhau, dựa trên các điểm tỉ lệ trên giản đồ pha Kết quả xác định

độ tan theo bảng 5 cho thấy rằng, lượng ART được hòa tan bởi hệ hỗn hợp các chất mang nhiều hơn khi sử dụng đơn chất mang Tại tỉ lệ Transcutol HP:Labrasol:Labrafil - 63:27:10 độ tan của ART là lớn nhất - đạt 31,83% kl/kl (xấp

xỉ 2 lần so với đơn chất mang có khả năng hòa tan ART tốt nhất là Transcutol HP - đạt 15,74% kl/kl

Bảng 5 Độ tan của Artesunat trong hệ

M l; Transcutol HP - Labrasol - Labrafil (%kl/kl)

Tỉ lệ s-mix

TransHP :

Labrasol

Tỉ lệ S-mix:Labrafil

Bàn iuận

- về ảnh hưởng của chất đồng diện hoạt: Trong các thí nghiệm trên, Transcutol p và Transcutol HP đóng vai trò là chất đồng diện hoạt Có thể nhận thấy rằng, tỉ lệ của 2 chất này quyết định nhiều đển khả năng hòa tan dược chất của hệ chất mang Độ tan của dược chất ART trong 2 chất này cũng là lớn nhất (lần lượt là 15.47 và 15.74 %kl/kl với Transcutol p và Transcutol HP), do đó các kết quả thử nghiệm với hệ chất mang thấy rằng, tỉ lệ 2 chất này càng cao, thì khả năng hòa tan dược chất của hệ cũng cao hơn

- về độ tan của dược chất trong hệ: Khi sử dụng hệ chất mang, độ tan của dược chất có thay đổi, đa số các trường hợp là tăng lên so với việc sử dụng đơn chất mang Một số kết quả ghi nhận, độ tan của dược chất tăng 100% so với việc sử dụng đơn chất mang Vậy iệc sử dụng hệ chất mang cải thiện khả năng hòa tan dược chất,

thông qua đó làm tăng lượng dược chất vào cơ thể mà không làm tăng quá lớn lưọng

chất mang

- Theo sự đánh giá kích thước tiểu phân sơ bộ ở bảng 2, tất cả các điểm hệ quan sát bằng mắt thường thấy trong suốt hoặc trong mờ đều đạt kích thước tiểu

phân trong khoảng từ 1-1000 nm (chủ yếu từ 150-350 nm) Như vậy có thể nhận

định rằng, với cấu trúc gồm chất diện hoạt - chất đồng diện hoạt - dầu, hệ sẽ hình

thành vi nhũ tương ở các tỉ lệ nhất định Khoảng phân bố kích thước tiểu phân của

các hệ chất mang tại các tỉ lệ khác nhau là khác nhau, do đó cần xem xét tỉ lệ có

khoảng phân bố hẹp nhất, để đảm bảo sự đồng đều kích thước của tiểu phân nano và

đảm bảo tính chính xác trong các thử nghiệm có mặt của dược chất, tác dược và các

tác động môi trường về sau

Kết luận

Kết quả các thử nghiệm cho thấy rằng việc đưa artesunat vào chất mang là

khả thi Đặc biệt trong việc cải thiện nồng độ dược chất đưa vào cơ thể, với cùng

lượng như nhau, hệ hỗn họp chất mang có khả năng đưa được nhiều dược chất vào

cơ thể hơn Các nghiên cứu về độ ổn định và đưa ra công thức, dạng bào chế cuối

cùng sẽ tiếp tục được nghiên cứu Theo các tài liệu tham khảo, hiện nay vẫn chưa có

phương pháp chính xác và tối ưu nào xác định rõ được cấu trúc của vi nhũ tương tạo

thành, do đó việc kết luận dạng, cấu trúc của các vi nhũ tương hiện vẫn dựa trên các

lý thuyết khoa học về bào chế

Tài liệu tham khảo

1. Ajeet K Singh, Akash Chaurasiya, Manish Singh, Satish c Upadhyay, Rama

Mukherjee, and Roop K Khar Exemestane Loaded Self-Microemulsifying Drug

Delivery System (SMEDDS): Development and Optimization AAPS PharmSciTech,

Vol 9, No 2 (2008).

2 Chadha, R., Gupta, s., and Pathak, N Artesunat-loaded chitosan/lecithin

nanoparticles: Preparation, characterization, and in vivo studies D rug Development

and Industrial Pharmacy, 38, 1538-1546 (2012).

3 Chen, Y., Lin, X., Park, H., and Greever, R Study o f artemisinin nanocapsules as

anticancer drug delivery systems Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and

Medicine, 5, 316-322 (2009).

4 Efferth, T Willmar Schwabe Award 2006: antiplasmodial and antitumor activity

o f artemisinin-from bench to bedside Planta medica, 73, 299-309 (2007)

5 Medha Joshia, Sulabha Pathakb, Shobhona Sharmab, Vandana Patravalea Solid microemulsion preconcentrate (NanOsorb) o f artemether for effective treatment of

malaria International Journal o f Pharmaceutics 362, 172-178(2008)

6 Thomas Efferth, Armin Olbrich, Rudofl Bauer mRNA expression profiles for the response o f human tum or cell lines to the antimalarial drugs artesunat- arteether- and

artemether Biochemical Pharmacology, 64, 617 - 623 (2012).

7 Xiao, X.-C., and Hong, Z.-G Firstborn microcrystallization method to prepare

nanocapsules containing artesunat International journal o f nanomedicine, 5, 483

(2010)