Ảnh hưởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân nano artesunat .... Công nghệ nano ứng dụng trong y dược học bao gồm các tiểu phân nano được sử dụng để vận chuyển dược
Trang 1MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1 Đại cương về hệ tiểu phân nano 2
1.1.1 Khái niệm 2
1.1.2 Phân loại 2
1.1.3 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano 5
1.2 Đại cương về Eudragit RS PO 8
1.2.1 Giới thiệu về Eudragit RS PO 8
1.2.2 Một số nghiên cứu về nano sử dụng Eudragit RS PO 9
1.3 Đại cương về Artesunat 9
1.3.1 Công thức hóa học 9
1.3.2 Tính chất lý hóa 10
1.3.3 Đặc điểm dược động học 10
1.3.4 Chỉ định 10
1.3.5 Tác dụng chống ung thư 11
1.3.6 Một số nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa artesunat 12
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1 Nguyên liệu, thiết bị 14
2.1.1 Nguyên liệu 14
2.1.2 Thiết bị 14
2.2 Nội dung nghiên cứu 15
2.3 Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1 Phương pháp bào chế tiểu phân nano artesunat 15
2.3.2 Các phương pháp đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân artesunat 17
Trang 22.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của quy trình bào chế tới đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 23
3.1.1 Khảo sát trình tự phối hợp hai pha 23
3.1.2 Khảo sát tốc độ phối hợp hai pha 23
3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong công thức tới đặc tính lý hóa của tiểu phân nano Artersunate 24
3.2.1 Khảo sát nồng độ chất diện hoạt 24
3.2.2 Khảo sát nồng độ Eudragit RS PO 26
3.2.3 Khảo sát tỉ lệ pha nước và pha dầu 27
3.2.4 Khảo sát nồng độ artesunat 28
3.3 Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano astesunat 29
3.3.1 Về KTTP, PDI, Thế Zeta, hiệu suất mang thuốc, khả năng nạp thuốc 30
3.3.2 Hình thái học của tiểu phân nanoartesunat 31
3.3.3 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro 31
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 33
4.1 Về tiêu chuẩn lựa chọn công thức và quy trình bào chế 33
4.2 Về ảnh hưởng của trình tự phối hợp và tốc độ phối hợp 34
4.3 Về ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt 35
4.4 Về ảnh hưởng của nồng độ Eudragit RS PO 36
4.5 Về ảnh hưởng của tỉ lệ pha nước và pha dầu 36
4.6 Về ảnh hưởng của nồng độ ART 38
4.7 Về khả năng giải phóng dược chất in vitro 38
KẾT LUẬN 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 3DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN Acetonitril
HPLC High-performance liquid chromatography – sắc kí lỏng hiệu
năng cao
RS PO Edragit RS PO PLGA Poly(lactic-co-glycolic) acid DHA Dihydroartemisinin
DLS Dynamic Light Scattering DĐVN Dược điển Việt Nam PDI Polydispersity index- Hệ số đa phân tán KTTP Kích thước tiểu phân
SEM Scanning Electron Microscope - Kính hiển vi điện tử quét
EE Hiệu suất mang thuốc MWCO Trọng lượng phân tử giới hạn NIBS Non-Invasive Back-Scatter optics - Hiệu ứng quang học tán xạ
ngược không xâm lấn
Trang 4DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 So sánh hiệu suất bao gói của tiểu phân nano Cucurbitacin I của hai phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và phương pháp kết tủa 7 Bảng 2.1 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm 14 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của trình tự phối hợp hai pha đến đặc tính cảm quan của nhũ tương artesunat 23 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tốc độ phối hợp hai pha đến đặc tính hóa lý của tiểu phân nano artesunat 24 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân nano artesunat 25 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ Eudragit RS PO đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 26 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha nước và pha dầu đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 27 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 29 Bảng 3.7 Phần trăm giải phóng tích lũy của tiểu phân nano ART 32 Bảng 4.1 Điều kiện của công thức tối ưu 34
Trang 5DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Một số hạt nano thường gặp 3
Hình 1.2 Cấu trúc hạt nano 4
Hình 1.3 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano bằng phương pháp kết tủa 6
Hình 1.4 Công thức hóa học Eudragit RS PO 8
Hình 1.5 Công thức hóa học artesunat 9
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phương pháp kết tủa 16
Hình 2.2 Bề mặt của một hạt nano mang điện tích và thế năng zeta 19
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân nano artesunat 25
Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ Eudragit RS PO đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 26
Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha nước và pha dầu đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 28
Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa và hiệu suất bao gói của tiểu phân nano artesunat 29
Hình 3.5 Hình ảnh phân bố kích thước tiểu phân của CT M15 30
Hình 3.6 Hình ảnh thế Zeta của CT M15 30
Hình 3.7 Hình ảnh SEM của tiểu phân nanoartesunat 31
Hình 3.8 Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng tích luỹ của ART theo thời gian từ tiểu phân nano trong môi trường đệm phosphate pH 7,4 32
Trang 6ĐẶT VẤN ĐỀ
Artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ
artemisinin- một dẫn chất được phân lập từ cây Thanh hao hoa vàng Artemsia annua L., có tác dụng chính thường được biết đến là điều trị sốt rét [48] Gần đây
ART được chứng minh là có tác dụng chống tăng sinh tế bào khá mạnh và tiêu diệt được các tế bào ung thư Do đó, một số công trình đang mở ra nhiều hướng nghiên cứu nhằm đưa ART đến đích tác động - các tế bào ung thư [20], [22] Tuy nhiên, khi sử dụng đường uống, sinh khả dụng của ART tương đối thấp do đặc tính phân
tử nhạy cảm với môi trường đường tiêu hóa, khả năng hấp thu qua niêm mạc hoặc các kênh riêng trong đường tiêu hóa không tốt Hơn nữa, ART có thời gian bán thải ngắn và bị chuyển hóa qua gan lần đầu khá nhiều
Để cải thiện dược động học của ART, cần thiết phải đưa ART vào một hệ chất mang, tạo ra các tiểu phân có kích thước nano nhằm đảm bảo sự ổn định, cải thiện sinh khả dụng và khả năng giải phóng dược chất so với các dạng bào chế thông thường [13], [14] Hệ vi tiểu phân nano polyme hiện nay được đánh giá là giải pháp tiềm năng cho việc đưa thuốc đến đích là các khối u hay tế bào bệnh đồng thời giải phóng kiểm soát dược chất khó tan và thấm tốt như ART Trong các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano polyme, phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi là kĩ thuật đơn giản nhất không phải sử dụng thiết bị máy móc hiện đại, có thể áp dụng
để nâng cấp quy mô sản xuất [42]
Vì các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat
bằng phương pháp kết tủa” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1 Bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phương pháp kết tủa
2 Đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat
Trang 7CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về hệ tiểu phân nano
1.1.1 Khái niệm
Hệ vận chuyển thuốc kích thước nano là hệ được cấu tạo như các hạt nano có kích thước từ 1-1000 nm, với thiết kế thích hợp có vai trò như một phương tiện vận chuyển chuyên biệt, đảm bảo vận chuyển các hoạt chất đến đích tác dụng Công nghệ nano ứng dụng trong y dược học bao gồm các tiểu phân nano được sử dụng để vận chuyển dược chất đến các bộ phận mong muốn trong cơ thể với liều lượng thích hợp và theo đúng thời gian mong muốn, đảm bảo được 3 yếu tố góp phần tạo nên tính an toàn và hiệu quả của thuốc: đúng nơi, đúng lúc và đúng liều [18] Các hệ vận chuyển thuốc có nhiều triển vọng là polyme-micelle, dendrimers, các hạt nano có nguồn gốc kim loại polyme, ceramic, protein, virus, và các hạt nano liposome Tiểu phân nano polyme thường gồm 2 loại là siêu vi cầu (nanospheres) và siêu
vi nang (nanocapsules) Siêu vi cầu là tiểu phân nano có cấu trúc hình thành từ polyme tạo nên nang bao lấy dược chất Siêu vi nang là tiểu phân nano có cấu trúc hình thành từ polyme tạo nên lõi cầu, và dược chất được tóm giữ trên bề mặt hoặc phân tán đều với chất mang Dược chất (DC) có thể được hòa tan, nang hoá (encapsulated), bẫy (entrapped), tạo liên kết hóa học hoặc được hấp phụ lên bề mặt tiểu phân nano polyme [23], [38]
1.1.2 Phân loại
Hiện nay các hạt nano vận chuyển thuốc thường được phân loại theo thành phần cấu tạo, cấu trúc và đặc tính bề mặt của hạt nano Thành phần cấu tạo của các hạt nano chủ yếu là polyme, lipid và các hợp chất vô cơ, do vậy có thể phân thành 3 lớp lớn [4]:
• Hạt nano polyme (polymeic nanoparticles)
• Hạt nano lipid (lipid nanoparticles)
Trang 8• Hạt nano vô cơ(inorganic nanoparticles)
Hình 1.1 Một số hạt nano thường gặp
Ngoài ra, còn có những hạt nano có cấu trúc hỗn hợp giữa polyme, lipid và hợp chất vô cơ Các polyme có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học thường được sử dụng là polylactid, polyglycolid, poly(lactid-co-glycolid), poly(ε-caprolactone), poly(alkyl-cyanoacrylat), gelatin, chitosan… Các lipid thường được
sử dụng là các lipid không độc với cơ thể, có cấu tạo khá tương đồng với lipid sinh học như phospholipid, cholesterol, glycerid… và dẫn xuất của các lipid này Các hạt nano vô cơ thường được sử dụng trong chẩn đoán và điều trị như: hạt nano từ tính (magnetic nanoparticle), chấm lượng tử (quantum dots)
Phân loại theo cấu trúc, các hạt nano có thể chia thành 3 dạng :
• Hạt nano dạng màng bao: cấu tạo giống như túi (vesicle) hoặc nang (capsule), gồm một thành phần polyme hoặc một màng đơn hay màng kép lipid bao quanh một lõi có thể ở trạng thái rắn, rắn-lỏng hoặc lỏng ưa nước hoặc ưa dầu
• Hạt nano cấu trúc dạng khung xốp (matrix): khung xốp polyme, lipid hoặc các hợp chất vô cơ phân bố đều bên trong hạt nano thường có dạng hình cầu
Hạt nano cấu trúc dạng phức hợp (complex): thường là một phức hợp đa thành phần giữa polyme hoặc lipid tích điện dương và hoạt chất tích điện âm (protein, peptide và acid nucleic) kết hợp với nhau nhờ tương tác điện tích
Trang 9Phân loại theo tính chất bề mặt của hạt nano, dựa trên các thay đổi bề mặt hạt nano như: tính ưa dầu, hiệu ứng cản trở không gian và thành phần cấu tạo bề mặt nhằm hướng hạt nano đến đích tác dụng Các hạt nano này có thể được chia làm 3 loại [3]:
• Hạt nano thụ động (pasive nanoparticles): bề mặt không có sự cản trở về mặt không gian và thường ưa dầu Các hạt nano này dễ dàng bị opsonin hóa bởi các protein huyết tương trong tuần hoàn và sau đó bị bắt giữ bởi tế bào thực bào đơn nhân có các receptor bề mặt nhận biết đặc hiệu protein huyết tương, rồi di chuyển chủ yếu đến vùng gan, lách, vì vậy các hạt nano này thường được gọi là hạt nano hướng gan lách
• Hạt nano Stealth ® (Stealth ® nanoparticles): bề mặt hạt nano được bao phủ bởi lớp polyme ưa nước và linh động như polyethylenglycol (PEG), polysaccharid, poloxame, poloxamin Các hạt nano này thường liên kết cộng hóa trị với PEG trên
bề mặt lên có thể gọi là hạt nano ghép PEG Nhờ thay đổi cấu trúc bề mặt, các hạt nano này hầu như không bị opsonin và bắt giữ thực bào Do vậy thường được áp dụng để điều trị bệnh ngoài vùng gan lách
• Hạt nano chủ động (active nanoparticles): Các hạt nano được gắn kết với các ligand trên bề mặt nhằm nhận biết đặc hiệu các receptor ở mô và tế bào đích Các hạt nano này còn được gọi là hạt nano hướng đích
Hình 1.2 Cấu trúc hạt nano
Trang 101.1.3 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano
Dựa theo quy trình bào chế, có thể chia các phương pháp bào chế nano polyme làm 2 loại: 1 giai đoạn và 2 giai đoạn Các phương pháp 1 giai đoạn dựa trên sự kết tủa của polyme từ một dung dịch hoặc dựa trên sự kết tập tự phát của các đại phân
tử để hình thành các nanogel hoặc các phức hợp của các chất “đa điện tích” (polyelectrolyte)
Các phương pháp 2 giai đoạn bao gồm giai đoạn đầu chung cho các phương pháp là bào chế một nhũ tương và giai đoạn 2 là giai đoạn hình thành nên tiểu phân nano Giai đoạn 2 có thể được thực hiện dựa trên phản ứng polyme hoá các monome hoặc các quá trình kết tủa, gel hoá của các polyme Các polyme được sử dụng có thể là polyme tự nhiên, các polyme tổng hợp, có sẵn hoặc tạo thành từ các monome Tuy vậy, do các polyme tạo thành từ phản ứng polyme hoá thường ít phân huỷ sinh học, các monome tồn dư và chất diện hoạt được dùng với lượng lớn có thể gây độc và đòi hỏi quá trình tinh chế phức tạp [47] Do vậy, hiện các nghiên cứu sử dụng chủ yếu phương pháp đi từ các polyme có sẵn (các eudragit, các polyme phân huỷ sinh học như PLGA, PLA, PCL,….)
Dưới đây là một số phương pháp thông dụng trong điều chế tiểu phân nano polyme từ các polyme tổng hợp có sẵn:
- Phương pháp nhũ tương hóa/bốc hơi dung môi
Polyme được hòa tan vào dung môi không đồng tan với nước, sau đó dung dịch này sẽ được nhũ tương hóa vào nước bằng lực khuấy từ hay lực siêu âm Tiếp theo dung môi hữu cơ sẽ được bốc hơi hết để các hạt tiểu phân được hình thành do
sự rắn hóa polyme
- Phương pháp nhũ tương hóa/ khuếch tán dung môi
Polyme được hòa tan vào dung môi tan một phần trong nước và sau đó cho bão hòa với nước để đảm bảo cân bằng nhiệt động Sau đó, hỗn hợp này được phân tán vào nước có chứa chất ổn định để tạo các tiểu phân nano Cuối cùng dung môi được loại bỏ theo cách bốc hơi hoặc lọc, tùy theo nhiệt độ sôi của dung môi
Trang 11- Phương pháp tạo muối kết lắng với polyme
Polyme cùng dược chất được hòa tan trong dung môi tan trong nước, sau đó dung dịch này được phân tán vào gel nước có các tác nhân tạo muối (ví dụ: magnesi clorid, calci clorid hay sucrose) và các chất ổn định tao gel Sau đó, hỗn hợp này được hòa loãng với một lượng nước vừa đủ để tăng sự khuếch tán của tiểu phân vào nước, từ đó hình thành tiểu phân nano Cuối cùng, tác nhân tạo muối cũng như dung môi được loại đi sau khi lọc
- Phương pháp thay đổi dung môi/kết lắng bề mặt
Các polyme được hòa tan trong một dung môi có thể trộn lẫn với nước dẫn đến sự kết tủa của các tiểu phân nano Polyme lắng đọng trên bề mặt phân cách pha giữa các pha nước và pha dầu hữu cơ, gây ra bởi sự khuếch tán nhanh chóng của dung môi, dẫn đến sự hình thành hệ keo
Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi là kĩ thuật kết tủa đơn giản nhất, trong đó polyme và dược chất được hoà tan vào một dung môi đồng tan với nước (như aceton, ethanol,…) sau đó được chia thành từng giọt và phối với hợp pha ngoại có thể chứa hoặc không chứa chất ổn định, sử dụng thiết bị khuấy trộn phù hợp Dung môi có thể được loại đi bằng nhiều cách như khuấy từ, nâng nhiệt độ pha nước khi phối hợp hoặc bay hơi trong chân không
Hình 1.3 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano bằng phương pháp kết
tủa