Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư

ĐẶT VẤN ĐỀ Artemisinin (ATN) và các dẫn chất như artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L.. Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư [26]. Tuy nhiên, ART là dược chất không bền, độ ổn định phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng như dung môi trong quá trình bào chế và bảo quản. Do đó, nhằm tăng độ ổn định cũng như sinh khả dụng, công nghệ nano có thể được áp dụng. Các dạng bào chế chứa TP nano có khả năng giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lượng và khoảng thời gian như dự kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, kết quả làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể người bệnh [58]. Bên cạnh liposome, TP nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế nano thu hút được khá nhiều nghiên cứu. Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học được sử dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [116]. Ngoài ra, các polyme thân nước như chitosan (CS) hay PEG có thể được sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các tiểu phân nano (viết tắt là TP nano) PLGA như tăng cường sự bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44]. Trên cơ sở đó, luận án đã được thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm: 1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 3. Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat; 4. Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu phân nano artesunat.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ HOÀNG NHÂN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ HOÀNG NHÂN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 62720402 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến GS TS Chul Soon Yong HÀ NỘI, NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả NCS Hồ Hồng Nhân LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập nghiên cứu thực luận án, nhận nhiều hướng dẫn, giúp đỡ quý báu từ thầy, cô, nhà khoa học, anh chị em, bạn bè đồng nghiệp gia đình Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến, GS TS Chul Soon Yong, hai người thầy nhiệt tình hướng dẫn, hết lòng giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Đại học Y Dược – Đại học Huế tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu thời gian vừa qua Lời cảm ơn tiếp theo, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tồn thể thầy cơ, cán nhân viên, anh chị học viên, bạn sinh viên Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Công nghiệp dược, Bộ môn Vật lý – Hóa lý, Phòng Sau đại học – Trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô, đồng nghiệp Khoa Dược, Bộ môn Bào chế - Công nghiệp dược thuộc Trường Đại học Y Dược – Đại học Huế tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin cám ơn thầy cô, bạn bè thuộc Khoa Dược - Trường Đại học Yeungnam - Hàn Quốc, đặc biệt TS Trần Tuấn Hiệp, TS Nguyễn Hạnh Thủy, GS TS Jong Oh Kim, thầy cô, bạn bè thuộc Viện Dược – Trường Đại học Tartu - Estonia, đặc biệt GS TS Jyrki Heinamaki, PGS TS Karin Kogermann, GS TS Ain Raal giúp đỡ hướng dẫn tơi tận tình q trình làm thực nghiệm hai sở nói Góp phần không nhỏ để đạt kết luận án, xin cảm ơn giúp đỡ quý báu cô chú, anh chị thuộc công ty cổ phần Dược phẩm TW 1, công ty cổ phần Dược phẩm Sao Kim, công ty cổ phẩn Dược phẩm Pymepharco, cơng ty cổ phần Dược TW Medipharco, Phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử Vi phân tích thuộc Viện Tiên tiến Khoa học Công nghệ - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Khoa Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, thực phẩm mỹ phẩm Thừa Thiên Huế, Trung tâm phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học, Phòng Hiển vi điện tử - Viện Khoa học vật liệu, Phòng Thử nghiệm sinh học - Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ nguyên liệu, hóa chất trang thiết bị, kỹ thuật giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cám ơn đến nhà xuất Taylor & Francis, Hidawi, Bộ Y tế, Trường Đại học Dược Hà Nội xét duyệt đăng tải kết nghiên cứu sử dụng luận án tạp chí Drug Development and Industrial Pharmacy, Journal of Nanomaterials, Tạp chí Dược học, Tạp chí Nghiên cứu Dược Thơng tin thuốc Lời cám ơn cuối muốn dành tặng cho người thân gia đình bạn bè, đặc biệt gia đình bố mẹ nội ngoại, vợ hai bên cạnh động viên, giúp đỡ hy sinh nhiều để tơi học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2019 NCS Hồ Hoàng Nhân MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng artesunat 1.1.1 Công thức 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định artesunat 1.1.4 Các phương pháp định lượng artesunat 1.1.5 Tác dụng ức chế tế bào ung thư 1.1.6 Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thư 1.2 Tiểu phân nano polyme 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 10 1.2.3 Vài nét việc cải thiện đặc tính bề mặt tiểu phân nano PLGA chitosan PEG 11 1.2.4 Phương pháp đánh giá số đặc tính lý hóa tiểu phân nano 14 1.2.5 Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm 18 1.2.6 Một số nghiên cứu tiểu phân nano PLGA chức hóa bề mặt cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa 19 1.3 Ứng dụng công nghệ nano điều trị bệnh ung thƣ 25 1.3.1 Đặc điểm sinh học khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc nano 25 1.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư tiểu phân nano 26 1.3.3 Một số chế phẩm nano sử dụng điều trị bệnh ung thư 27 1.3.4 Một số nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư tiểu phân nano chứa dẫn chất artemisinin 28 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 33 2.1.1 Nguyên liệu 33 2.1.2 Tế bào động vật thí nghiệm 34 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 34 2.2 Địa điểm nghiên cứu 35 2.3 Nội dung nghiên cứu 36 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 36 2.4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat 36 2.4.2 Đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 41 2.4.3 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 46 2.4.4 Đánh giá đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 47 2.4.5 Theo dõi độ ổn định 52 2.4.6 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro in vivo 53 2.4.7 Xử lý số liệu 56 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 Kết bào chế tiểu phân nano artesunat 57 3.1.1 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS phương pháp nhũ hóa bốc dung môi hấp phụ vật lý 57 3.1.2 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS phương pháp phun điện trường 64 3.1.3 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG 69 3.2 Kết đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 80 3.2.1 Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS 80 3.2.2 Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG 84 3.3 Kết bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 88 3.3.1 Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat 88 3.3.2 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg 93 3.4 Kết đánh giá đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 95 3.4.1 Một số đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 95 3.4.2 Hình thái tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đông khô 96 3.4.3 Phổ nhiễu xạ tia X 96 3.4.4 Phân tích phổ hồng ngoại 97 3.4.5 Phân tích nhiệt vi sai 98 3.4.6 Khả giải phóng hoạt chất in vitro 98 3.5 Kết đề xuất tiêu chuẩn sở độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 99 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn sở bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 99 3.5.2 Độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 100 3.5.3 Độ ổn định hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau phân tán lại 105 3.6 Kết đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro tác dụng ức chế khối u in vivo tiểu phân nano artesunat 106 3.6.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro tiểu phân nano artesunat 106 3.6.2 Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo tiểu phân nano artesunat 110 CHƢƠNG BÀN LUẬN 113 4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat .113 4.1.1 Đối với trường hợp sử dụng PLGA chitosan 113 4.1.2 Đối với trường hợp sử dụng PLGA PEG 119 4.2 Đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 124 4.2.1 Đối với trường hợp sử dụng PLGA chitosan 124 4.2.2 Đối với trường hợp sử dụng PLGA PEG 126 4.3 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 128 4.4 Đánh giá đặc tính lý hóa, vi sinh bột đơng khơ 133 4.5 Độ ổn định bột đông khô pha tiêm .136 4.6 Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro in vivo 138 4.6.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro 138 4.6.2 Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo 141 4.7 Đóng góp luận án 146 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 147 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AFM Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscopy) ART Artesunat ATN Artemisinin ATNs Artemisinin dẫn chất C6 Coumarin CD Cyclodextrin CS Chitosan DCM Dicloromethan DHA Dihydroartemisinin DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Acid deoxyribonucleic DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry) EPR Hiệu ứng tăng tính thấm lưu giữ (Enhanced Permeability and Retention effect) FDA Cục quản lý Dược phẩm Thực phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration) FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform Infrared Spectroscopy) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) i.p Đường tiêm màng bụng (Intraperitoneal injection) i.v Đường tiêm tĩnh mạch (Intravenous injection) KTTP Kích thước tiểu phân trung bình theo cường độ (Z-Average, Intensity Distribution) LC-MS Sắc ký lỏng, khối phổ (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) LLC Ung thư phổi Lewis chuột (Lewis Lung Cancer) để khơ ngồi khơng khí, phun lên mỏng dung dịch vanilin % acid sulfuric (TT) Sấy 105 oC 10 phút quan sát sắc ký đồ ánh sáng ban ngày Đọc kết quả: - Trên sắc ký đồ dung dịch thử, ngồi vết tương ứng với vết ART dung dịch đối chiếu (3), vết DHA phải không đậm màu vết DHA dung dịch đối chiếu (1) - Và sắc ký đồ dung dịch thử, khơng q vết phụ ngồi vết ứng với DHA có màu đậm màu vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2) 2.9 Định lượng Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng với pha động gồm hỗn hợp ACN dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (45:55, thay đổi tỉ lệ cần cách giảm lượng ACN) (cách pha dung dịch đệm phosphat pH 3,0: hoà tan 1,36 g kali dihydrophosphat 1000 ml nước, điều chỉnh dung dịch tới pH 3,0 acid phosphoric đậm đặc) Dung dịch thử: Bột đông khô sau phân tán lại nước cất lần bình định mức 10 ml, tiếp tục pha loãng 10 lần ACN Lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45μm Dung dịch chuẩn: Cân xác 20,0 mg artesunat chuẩn Hòa tan bình định mức 10 ml hỗn hợp ACN nước (tỉ lệ 9:1, tt/tt) đến vạch Tiếp tục pha loãng 10 lần hỗn hợp ACN nước (tỉ lệ 9:1, tt/tt) để có dung dịch artesunat chuẩn với nồng độ xác khoảng 200 µg/ml Điều kiện s c ký: Cột sắc ký C18 (25 cm  4,6 cm, hạt nhồi m; Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 210 nm; Tốc độ dòng: ml/phút; Thể tích tiêm: 50 l Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn thử Tính hàm lượng artesunat, C19H28O8, có đơn vị chế phẩm dựa vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng C19H28O8 artesunat chuẩn 2.10 Tỉ lệ dược chất nano hóa Tiến hành phân tán bột đông khô pha tiêm chứa nano ART/PLGA-PEG ml nước cất Sau đó, chuyển hỗn dịch thu vào bình định mức 10 ml, bổ sung nước cất đến vạch Hút xác ml hỗn dịch nano, ly tâm 4500 vòng/phút (2332 g) 30 phút ống ly tâm gắn màng 10kDa (MWCO 10 kDa, Millipore, Mỹ) Lấy phần dịch bên màng lọc, sau tiến hành sắc ký HPLC với điều kiện phần định lượng Hàm lượng dược chất tổng định lượng cách pha PL-6 loãng mẫu với ACN, lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau tiến hành sắc ký với điều kiện tương tự Hiệu suất mang thuốc (EE) tính theo công thức sau: ( ) 2.11 Khả giải phóng dược chất in vitro Tiến hành phân tán bột đông khô pha tiêm chứa nano ART/PLGA-PEG ml nước cất hai lần Sau đó, chuyển hỗn dịch thu vào bình định mức 10 ml, bổ sung nước cất đến vạch Khả giải phóng dược chất in vitro bột đông khô pha tiêm tiến hành với túi thẩm tích (10kDa – Membra-Cel, Mỹ) chứa ml hỗn dịch nano ART/PLGA-PEG Túi thẩm tích giữ cố định hai kẹp nhựa đặt ống ly tâm 50 ml chứa 20 ml dung dịch salin đệm phosphat pH 7,4 Ống ly tâm đặt bể lắc điều nhiệt nhiệt độ 37 ± 0,5oC với tốc độ 100 vòng/phút Sau thời điểm định, thể tích mơi trường bên ngồi túi thẩm tích hút để định lượng hàm lượng dược chất giải phóng thay thể tích môi trường tương ứng Tiến hành định lượng tương tự đề cập phần định lượng HPLC - Nồng độ ART thời điểm t tính theo cơng thức Ct = St Cc Sc Trong đó: Ct, Cc nồng độ ART dung dịch thử dung dịch chuẩn (µg/ml); St, Sc diện tích pic mẫu thử mẫu chuẩn (mAu.s) Khối lượng ART giải phóng mơi trường thời điểm thứ t tính theo cơng thức: t-1 mt = Ct × + ∑ Ci i=1 Trong đó: mt: Tổng lượng ART giải phóng mơi trường hòa tan thời điểm t (μg) Ct: Nồng độ ART môi trường thử thời điểm t (μg/ml) V: Thể tích mơi trường khuếch tán (ml) V‘: Thể tích lần lấy mẫu thử (ml) Phần trăm giải phóng thời điểm t xác định công thức: mt % ART giải phóng = x100% mo Trong đó: mt khối lượng dược chất giải phóng thời điểm t (μg) PL-6 mo khối lượng dược chất ban đầu đưa vào túi thẩm tích (μg) 2.12 Độ vô khuẩn Thử theo phương pháp cấy trực tiếp (theo chuyên luận ―Thử vô khuẩn‖ ghi phụ lục 13.7 Dược điển Việt Nam IV) Cụ thể, tiến hành phân tán bột đông khô ml nước cất pha tiêm Hút xác ml hỗn dịch sau phân tán cấy trực tiếp vào 200 ml môi trường Fluid Thioglycolat môi trường Soyabean Casein Digest chuẩn bị sẵn, lắc Tiến hành ủ môi trường, theo dõi đánh giá kết sau 14 ngày [1] 2.13 Tồn dư dung môi Tiến hành phương pháp sắc khí khí với kỹ thuật tiêm pha tĩnh detector ion hóa lửa theo chuyên luận ―Xác định dung môi tồn dư‖ ghi phụ lục 10.14 Dược điển Việt Nam IV) Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản - Bột đơng khơ đóng lọ thủy tinh, nút cao su, chụp nhơm kín - Bảo quản nhiệt độ 2-8oC - Nhãn quy chế Hà Nội, ngày PL-6 tháng năm 2017 PHỤ LỤC Kết đánh giá số tiêu bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm thực phẩm Thừa Thiên Huế PL-7 PHỤ LỤC Kết đánh giá độ ổn định bột đông khô pha tiêm Một số hình ảnh cảm quan mẫu thử nghiệm đánh giá độ ổn định Hình Hình ảnh tính chất mẫu bột đông khô trƣớc đánh giá độ ổn định (tháng thứ 0) tháng ± 3oC tháng ± 3oC tháng ± 3oC Hình Hình ảnh mặt đáy lọ mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện ± 3oC PL-8 tháng ± 3oC Hình Hình ảnh trƣớc sau phân tán lại mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện ± 3oC 12 tháng ± 3oC 12 tháng ± 3oC 12 tháng ± 3oC Hình Hình ảnh mặt đáy lọ mẫu bột đông khô sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC 12 tháng ± 3oC Hình Hình ảnh trƣớc sau phân tán lại mẫu bột đông khô sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC PL-8 tháng ĐK thực tháng ĐK thực tháng ĐK thực Hình Hình ảnh mặt đáy lọ mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực tháng ĐK thực Hình Hình ảnh trƣớc sau phân tán lại mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực Hình Kích thƣớc tiểu phân PDI mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực PL-8 Hình Hình ảnh mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực Hình 10 Hình ảnh sau phân tán lại mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực (hình khoanh tròn: bơng lơ lửng) Về khả giải phóng dƣợc chất Bảng Phần trăm giải phóng dƣợc chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC Thời gian (giờ) Tỷ lệ giải phóng (%) Ban đầu (t=0) Sau 12 tháng (5 ± 3oC) 12,08 ± 1,19 8,81 ± 0,27 22,37 ± 2,12 17,19 ± 1,43 29,51 ± 3,82 27,31 ± 1,32 44,45 ± 3,05 38,80 ± 4,36 48,01 ± 1,77 43,33 ± 4,60 10 51,90 ± 2,15 47,28 ± 3,93 PL-8 24 66,93 ± 1,65 64,10 ± 1,64 32 70,07 ± 1,07 67,55 ± 1,36 48 72,89 ± 1,52 72,32 ± 2,51 Hình 11 Sắc ký đồ ART giải phóng sau từ bột đông khô pha tiêm chứa nano ART sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC Hình 12 Sắc ký đồ ART giải phóng sau từ bột đông khô pha tiêm chứa nano ART sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC PL-8 Hình 13 Sắc ký đồ mẫu bảo quản 12 tháng điều kiện ± 3oC Hình 14 Phổ XRD ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý (PM_S), DHA bột đông khô chứa tiểu phân nano ART/PLGA-PEG thời điểm điều kiện bảo quản khác (NPs_S (t=3t, room): sau tháng điều kiện thực, NPs_S (t=12t, 5oC): sau 12 tháng điều kiện ± 3oC) PL-8 PHỤ LỤC Kết đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro in vivo tiểu phân nano artesunat Bảng Tỉ lệ ức chế phát triển tế bào ung thƣ LLC in vitro Tỉ lệ ức chế thời điểm 24 (%) Nồng độ (μg/ml) 100 50 25 12,5 6,25 3,125 Nồng độ (μg/ml) 100 50 25 12,5 6,25 3,125 PLGAPEG ART nguyên liệu Nano ART/PLGAPEG Nồng độ (μg/ml) Paclitaxel 15,86 11,06 4,96 3,71 97,63 52,86 29,82 25,19 15,21 3,02 108,62 107,56 105,29 92,19 56,55 28,79 20 10 2,5 1,25 41,41 10,15 6,93 2,63 0,52 Tỉ lệ ức chế thời điểm 48 PLGAPEG 16,95 12,14 7,21 5,11 ART nguyên liệu 96,37 80,92 57,08 47,10 24,98 10,75 Nano ART/PLGAPEG 104,30 103,33 102,10 101,91 66,55 46,39 Nồng độ (μg/ml) 20 10 2,5 1,25 Hình Hình ảnh chuột ngày thứ 15 (trái: nhóm tiêm ART nguyên liệu, phải: nhóm đối chứng) PL-9 Paclitaxel 109,96 49,36 21,70 3,06 0,28 Bảng Kết xử lý thống kê so sánh tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro cơng thức dòng tế bào MCF-7 nồng độ ART 100 µg/ml Overall ANOVA DF Model Error Total Tukey test AP100 AS100 AA100 AS100 AA100 AP100 Sum of Squares Mean Square F Value Prob>F 0,06165 0,03082 33,643 6,65E-05 0,00825 9,16E-04 11 0,06989 MeanDiff SEM q Value Prob Alpha Sig LCL UCL 0,10725 0,0214 7,08663 0,00188 0,05 0,04749 0,16701 0,17400 0,0214 11,4972 5,17E-05 0,05 0,11424 0,23376 0,06675 0,0214 4,41056 0,03005 0,05 0,00699 0,12651 AP: TP nano ART/PLGA; AS: TP nano ART/PLGA-CS, AA: ART nguyên liệu Bảng Kết xử lý thống kê so sánh tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro công thức dòng tế bào A549 nồng độ ART 100 µg/ml Overall ANOVA DF Model Error Total Tukey test AP100 AS100 AA100 AS100 AA100 AP100 Sum of Squares Mean Square F Value Prob>F 49,21892 24,60946 41,98434 5,73E-05 4,68926 0,58616 10 53,90818 MeanDiff 0,54392 4,99292 4,44900 SEM q Value Prob Alpha Sig LCL UCL 0,54137 1,42089 0,59455 0,05 -1,00301 2,09085 0,58474 12,07547 7,10E-05 0,05 3,32205 6,66380 0,58474 10,75999 1,62E-04 0,05 2,77812 6,11988 AP: TP nano ART/PLGA; AS: TP nano ART/PLGA-CS, AA: ART nguyên liệu PL-9 Bảng Kết xử lý thống kê so sánh khối lƣợng chuột thời điểm trƣớc sau tiêm thuốc nhóm tiêm nguyên liệu ART Normality Test - Shapiro-Wilk DF Statistic p-value Decision at level(5%) NL Ngày 0,76206 0,02607 Reject normality NL Ngày 0,77266 0,03290 Reject normality NL Ngày 10 0,75122 0,02047 Reject normality NL Ngày 15 0,76985 0,03094 Reject normality NL Ngày 20 0,76115 0,02556 Reject normality Friedman ANOVA Descriptive Statistics N Min Q1 Median Q3 Max Ngày 23,70 23,75 25,09 26,39 26,46 Ngày 24,06 24,09 25,58 27,06 27,10 Ngày 10 25,10 25,18 26,00 26,83 26,90 Ngày 15 24,31 24,34 25,08 25,81 25,83 Ngày 20 23,63 23,66 24,26 24,82 24,87 Test Statistics Chi-Square DF Prob>Chi-Square 9,46667 0,05044 Nhận xét: - Như vậy, khối lượng chuột thời điểm nhóm tiêm nguyên liệu ART không tuân theo phân bố chuẩn (p0,05) PL-9 Bảng Kết xử lý thống kê so sánh thể tích khối u nhóm thời điểm ngày Normality Test - Shapiro-Wilk Thời điểm Nhóm DF Statistic p-value Decision at level(5%) Ngày Bệnh lý 0,82880 0,10499 Can't reject normality Ngày Nano 0,78111 0,03948 Reject normality Ngày NL 0,75541 0,02249 Reject normality Kruskal-Wallis ANOVA Descriptive Statistics N Min Q1 Median Q3 Ngày Bệnh lý 462,80 464,52 565,56 723,04 Ngày Nano 535,63 537,92 575,49 619,76 Ngày NL 469,55 475,23 592,08 725,01 Test Statistics Chi-Square Ngày DF 0,04678 Prob>Chi-Square 0,97688 Nhận xét: - Như vậy, thể tích khối u nhóm Nano nhóm ngun liệu ngày khơng tn theo phân bố chuẩn (p0,05) PL-9 Bảng Kết xử lý thống kê so sánh thể tích khối u nhóm thời điểm ngày 10 Normality Test - Shapiro-Wilk Thời điểm Nhóm DF Ngày 10 Bệnh lý Ngày 10 Nano Ngày 10 NL Kruskal-Wallis ANOVA Descriptive Statistics N Ngày 10 Bệnh lý Ngày 10 Nano Ngày 10 NL Test Statistics Chi-Square DF Ngày 10 12,31579 Mann-Whitney Test Test Statistics So sánh U Z Bệnh lý Nano 36 2,80224 Nano NL -2,80224 Bệnh lý NL 27 1,36109 Statistic p-value 0,76568 0,02824 0,76004 0,02493 0,74717 0,01869 Decision at level(5%) Reject normality Reject normality Reject normality Min Q1 Median Q3 5007,15 5011,03 5416,45 2220,20 2220,34 2434,57 4618,75 4624,49 4884,58 5791,35 2634,06 5177,88 Prob>Chi-Square 0,00212 Exact Prob>|U| Asymp Prob>|U| 0,00216 0,00507 0,00216 0,00507 0,17965 0,17349 Nhận xét: - Như vậy, thể tích khối u nhóm Bệnh lý, nhóm Nano nhóm ngun liệu ngày 10 khơng tn theo phân bố chuẩn (p