Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (carica papaya) (2018)

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ Carica papaya” Với mục đích nghiên cứu thành phầ

CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

PGS TS NGUYỄN VĂN BẰNG

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này, em đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của các quý thầy cô, anh chị và bạn bè

Cảm ơn các anh chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh

biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ

và truyền đạt kiến thức, kiến thức trong suốt thời gian em thực tập

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã cho

phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại Viện

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy

giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng, người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong

suốt quá trình thực hiện khóa luận Và các thầy cô giáo trong Khoa Hóa học- trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt 4 năm em học tập tại trường Cảm ơn anh chị và bạn bè đã bên cạnh giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình em, những người thân luôn bên em, hết lòng ủng hộ em về cả tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô trong Khoa Hóa học- trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy cô cùng các anh chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thật dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

NGUYỄN THỊ HUYỀN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong

khóa luận: “Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ

(Carica papaya)”

Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung

thực và không trùng với kết quả của tác giả khác

Sinh viên

NGUYỄN THỊ HUYỀN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Nghiên cứu tổng quan 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.2 Phân bố và sinh thái 4

1.1.3 Tính vị và công dụng của cây đu đủ 4

1.1.4 Thành phần hóa học 5

1.1.5 Hoạt tính sinh học 6

1.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 9

1.2.1 Chọn dung môi chiết 9

1.2.2 Quá trình chiết 10

1.2.3 Các yếu tố ảnh ưởng tới quá trình chiết 11

1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ 11

1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí 11

1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký 12

1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký 12

1.4 Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 16

1.4.1 Phổ IR 16

1.4.2 Phổ khối lượng 17

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 18

CHƯƠNG 2 MẪU THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mẫu thực vật 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 22

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 22

2.3 Dụng cụ và thiết bị 24

2.3.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 24

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 24

2.4 Hóa chất 24

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25

3.1 Phân lập các hợp chất từ lá đu đủ đực 25

3.2 Hằng số vật lý và dự kiện phổ các hợp chất 27

3.2.1 Hợp chất 1 (Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside) 27

3.2.2 Hợp chất 2 (Quercetin-3--L-arabinofuranoside) 28

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 29

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside) 29

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2(Quercetin-3- -L-arabinofuranoside) 33

KẾT LUẬN 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các dạng sắc ký 13

Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 32

Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 36

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Đu đủ 4

Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen ) 8

Hình 1.3: Sambunigrin 9

Hình 1.4: Prunasin 9

Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết metahnol từ lá đu đủ 25

Hình 3.2: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Đu đủ 27

Hình 4.1.1:Phổ 1H của hợp chất 1 29

Hình 4.1.2 :Phổ 13C của hợp chất 1 30

Hình 4.1.3:Phổ 13C và DEPTcủa hợp chất 1 31

Hình 4.1.4: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 34

Hình 4.2.1 :Phổ 1H của hợp chất 2 33

Hình 4.2.2: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 34

Hình 4.2.3 :Phổ 13C của hợp chất 2 34

Hình 4.2.4: Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 2 35

Hình 4.2.5: Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 2 35

Hình 4.2.6 : Các tương tác HMBC chính (H C) của hợp chất 2 36

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

Carbon-13NuclearMagneticResonance Spectroscopy

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Corelation Spectroscopy

2D-NMR Phổcộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional

NMR

CC Sắc kí cột Column Chromatography

DEPT Distortionless Enhancement By Polarization

Transfer

EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron

Electron Impact Mas Spectroscopy

FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh

Fast Atom Bombardment MasSpectrometry

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivit

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

ME Nhóm metyl

MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography

MỞ ĐẦU

Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa dạng của hệ thực vật Từ xưa đến nay, cây cỏ đã xuất hiện trong các bài thuốc dân gian và trong đời sống của con người

Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên là nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học cả trong nước và thế giới quan tâm với mục đích phục vụ, đáp ứng nhu cầu về y tế, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong sinh hoạt của con người

Thiên nhiên là nguồn cung cấp các “bài thuốc” quý hiếm và là nơi lưu trữ các chất dẫn đường để tổng hợp những bài thuốc mới Trong quá trình nghiên cứu các chất phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chế tạo ra những bài thuốc có khả năng phòng, chữa bệnh Trong đó có cây đu đủ - Loại thực vật được sử dụng phổ biến có tác dụng chống oxi hóa, kích sữa, chữa tiêu chảy, giảm sưng do xuất huyết,… là một dược liệu trong bài thuốc dân gian nên cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây và tạo

cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp:

“Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ

(Carica papaya)”

Với mục đích nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu

đủ và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập Từ đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm các bài thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền Việt Nam

Nhiệm vụ chính của đề tài là:

1 Thu mẫu lá cây đu đủ (Carica papaya), xử lý mẫu và tạo dịch chiết

2 Phân lập một số hợp chất từ lá cây đu đủ (Carica papaya)

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Nghiên cứu tổng quan

1.1.1 Thực vật học

Giới thiệu về thực vật học

Tên thực vật: Carica papaya L

Tên thường gọi: Đu đủ

Tên khác: Thù đủ, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô

Phân loại khoa học

Họ Caricaceae hay Papayae

Mô tả thực vật

Đu đủ mọc thuộc loại thân mềm tự nhiên hằng năm

Cây nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2 - 4 m Thân thẳng không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do cuống lá rụng để lại

Lá: to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cướng rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn

Hoa: màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá; hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc; cụm hoa đực dài, phân nhánh thành chùy xim, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa cái có 2 - 3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận hơi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu 1 ô, nhiều lá noãn

Quả: mọng to, hình trứng ngược hoặc thuôn dài, khi chín màu vàng đỏ; hạt nhiều màu đen

Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Đu đủ 1.1.2 Phân bố và sinh thái

Chi Đu đủ (Carica) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới của Châu Mỹ, có

lẽ từ vùng Nam Mexico và một số các nước láng giềng ở Trung Mỹ Ở vùng núi cao (1500 - 3000 m), từ Panama đến Bolivia, có loài đu đủ mọc tự nhiên

( C pubescens Linné & K Koch) quả ăn được Vào thế kỉ 16, người Tây Ba

Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribe và một số nước Đông Á Từ các địa điểm này cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi

Đu đủ cần nhiệt độ ấm áp khoảng 25o

C với lượng mưa 100mm/tháng Cây trồng nơi đủ ánh sáng, không bị ngập úng, đất không nhiễm phèn

Đu đủ có khả năng trổ hoa và đậu trái quanh năm, tuy nhiên hạn chế sâu bệnh, có thể bố trí trồng đu đủ vào đầu mùa mưa (tháng 4- 5) Những vùng chủ động tưới tiêu trồng vào cuối mùa mưa (tháng 10-11) [11]

1.1.3 Tính vị và công dụng của cây đu đủ

Tính vị: tính hàn, vị ngọt, mùi hơi hắc

Công dụng:

Lá cây đu đủ: có tác dụng chữa tiêu chảy, giảm sưng do xuất huyết, phân hủy protein gluten và tiêu hóa tốt hơn, chống ung thư, loại bỏ cơn nghiện đường, loại bỏ mụn trứng cá, các bệnh liên quan đến tuyến tiền liệt, nhuận tràng, chống lão hóa

Quả cây đu đủ: có vị ngọt ,chống oxi hóa, giảm mỡ máu, tiêu hóa tốt, tăng cường đề kháng chống viêm nhiễm, kích thích sữa, tiêu đờm

Hạt đu đủ: chữa gai cột sống, hỗ trợ tiêu hóa, bảo vệ thận

Rễ đu đủ: chữa hôi chân

Nhựa đu đủ được dùng làm thuốc giun

Hoa đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn,nhất là ở trẻ em [32]

1.1.4 Thành phần hóa học

Lá cây đu đủ chứa chứa khá nhiều hợp chất như:

* Các enzym (enzymes): nhựa chứa khá nhiều enzym như papain, chymopapain, papaya glutamine cyclotransferase, glutaminyl-peptide-cyclo transferase, chitanase, papaya peptidase A và B, alpha-D-mannosidase và N-acetyl-beta-D-glucosaminidase Quả chứa beta-galactosidase I, II và III, và1-amino cyclopropane-1-carboxylase (ACC) oxidase, phenol-D-glucosyltransferase

*Carotenoid: Trong đu đủ chín có 19 loại carotenoid chủ yếu là cryptoxanthin (48%), beta caroten (30%), và cryptoflavin (13%), violaxanthin

và zeanxanthin

* Ankaloid: Lá chứa carpinin và carpain; ruột thân có pseudo carpain

* Monoterpenoid: Quả chứa 4-terpineol, linalool và linalool oxid

* Flavonoid: Chồi non chứa quercetin, mycicetin và kaempferol

* Các khoáng chất và vitamin: calcium,sắt, magiê, phốt pho, kali, natri, kém, đồng, mangan, thiamine (B1), beta caroten ( tiền vitamin A), riboflavine (B2), niacin (B3), pantothenic Acid (B5), ascorbic Acid , vitamin E, riêng chồi còn

có alpha tocopherol

* Glucositolat: Trong hạt có benzyl isothiocyanat

* Dầu béo của hạt chín chứa 16,97% acid béo bão hòa (gồm 11,38% palmitic, 5,25% stearic, 0,31% arachidic) và 78,63% acid béo chưa bão hòa ( 76,5% oleic và 2,13% linoleic).[28]

1.1.5 Hoạt tính sinh học

Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vậy được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2, 3, 16, 27] Hoạt tính sinh học của các bộ phận của cấy đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trên thế giới công bố khá phong phú

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá

đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T rubrum và Staphylococcus aureus Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri Benzyl isothiocyanate phân lập

từ đu đủ, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm

như Escherichia coli, Penicillium notatum và Shigella Rễ đu đủ có tác dụng

kháng khuẩn yếu [1]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả

năng kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80

µg/ml, không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram

âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/ml (với IC50 > 128 µg/ml) [5]

Năm 2001, Tác giả Phạm Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [8]

Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có

tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [12]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/ml), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/ml) và ung thư vú MCF-7 (IC50

= 19,16 µg/ml) Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập

từ cặn CH2Cl2 của lá đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) [5]

Ngoài những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu

đủ cũng đã được chứng minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác

dụng giảm thời gian đông máu, kháng viêm…

Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch chiết cồn từ lá cây đu đủ [19]

Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên được chứng minh khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là 386,5 và 778 RFU) ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và

30 µg/ml) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/ml) [5]

Lá đu đủ được sử dụng làm mền thịt khi nấu

Nhận xét chung: Như vậy, hoạt tính dược lý và thành phần hóa học của

cây đu đủ đã được nghiên cứu Tuy nhiên các công trình nghiên cứu chủ yếu

là lá và quả đu đủ, các công trình nghiên cứu hoa đu đủ đực hầu như chưa công bố

1.1.5.1 Các hợp chất Flavonoids

Flavonoid xuất hiện cách đây 280 triệu năm ở hai loại tảo, vòng

Sự tiến hóa của Flavonoid liên quan đến quá trình yiến hóa của thực vật Từ các loài có gỗ sơ khai đến các laoì cây bụi dẫ phát triển dẫn đến 3 sự thay đổi quan trọng về mặt cấu trức của Flavonoid:

- Sự biến mất Proantoxianidin trong lá

- Sự biến mất 3 nhóm OH ở vòng benzen

- Sự thay thế Flavonol (Quercetin) bởi Flavon (Luteonin)

Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol, đa dạng về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học Chúng có mặt hầu hết ở các bộ phận của cây, đặc biệt trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A,B được kết nối bởi một dị vòng C với khung cacbon C6-C3-C6 Tại các vòng có đính một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế một phần

Vì vậy về bản chất chúng là các poliphenol có tính axit Các polipphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydrõy để tạo thành các phân tử ohức tạp hơn hay có thể liên kết với các hợp chất khác có trong cây như các Oza (dạng glycozit) hay protein

Các flavonoid là các dẫn xuất của 2-phenyl chromen (flavan)

Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen)

1.1.5.2 Hợp chất glycoside

Năm 2002, David và cộng sự đã xác định được glycosid là prunasin và sambunigrin trong lá và thân đu đủ [21]

1.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và xử lý làm khô mẫu, tùy thuộc vào các chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,…) để người ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Dung môi để chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau:

- Không hòa lẫn với dung môi cũ (thường dùng là nước), nghĩa là có tỉ khối khác nhiều so với dung môi cũ

- Dung môi này phải không tương tác hóa học với chất được chiết và có nhiệt độ sôi tương đối thấp

Các dung môi hay được sử dụng

- Những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (lá, thân, rễ, hoa, quả, củ…) chủ yếu là clorofoc, metylen clorit và methanol

- Người ta sử dụng dung dịch nước của methanol thay vì dùng nước để chiết dịch thô từ cây

- Dietylete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ

nổ Peroxit của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không

có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid

- Axeton có thể tạo thành axetonit nếu 1,2- cis- diol có mặt trong môi trường axit Quá chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit, bazơ

để tạo ra những sản phẩm mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 - 40ºC với một vài hóa chất chịu nhiệt để có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.2.2 Quá trình chiết

Các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước Chiết ngâm được sử dụng rộng rãi Thông thường bình chiết ngâm không sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ sau đó mới lấy chất chiết ra Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được sẽ không chứa những chất giá trị nữa Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như sau:

Ví dụ:

- Với các ankaloit, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng phản ứng tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer,…

- Với các flavonoid thường là những hợp chất màu nên khi dịch chảy ra

mà không có màu có nghĩa là đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

- Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

- Với các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc sử dụng phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hidrat cacbon Từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi phù hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí để đạt hiệu quả cao

1.2.3 Các yếu tố ảnh ưởng tới quá trình chiết

- Ảnh hưởng của pH

- Vai trò của sựu tạo phức

- Ảnh hưởng của sự tạo rhành hợp chất ít tan

1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ

Sắc ký là phương pháp phổ biến được sử dụng rất trong việc phân lập các hợp chât hữu cơ nói chung hay hợp chât thiên nhiên nói riêng

1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí

Sắc ký là kĩ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp Các thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp

sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính

bị hấp phụ, tính tan,…)

Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ

Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký

Ta có định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh có nồng độ n1∞ (nồng độ của dung dịch) khi nhiệt độ không đổi

n =

n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh

N∞: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên chất hấp phụ nào đó b: Hằng số

C: Nồng độ của chất bị hấp phụ

1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc khí thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký,

người ta chia thành các phương pháp sau:

N∞ .b.C 1+b.C

Bảng 1.1: Các dạng sắc ký Dạng sắc ký Pha động Pha tĩnh Các bố trí

pha tĩnh

Cơ chế trao đổi chất

Lỏng Lỏng Lỏng

Lỏng Lỏng Lỏng

Rắn Lỏng

Rắn Lỏng Rắn

Rắn Lỏng Lỏng

Cột Cột

Cột Cột Cột

Lớp mỏng Giấy sắc ký Cột

Hấp phụ Phân bố

Hấp phụ Phân bố Trao đổi ion

Hấp phụ Phân bố Theo kích thước phân tử

1.3.3.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc

ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch

Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng

1 cm từ dưới lên Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp Dung môi

di chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc ký Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và

độ tan khác nhau trong dung môi Có thể phát hiện chất trên bảng mỏng bằng đèn tử ngoại, bằn chất hiện màu đặc trưng cho tùng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh

Sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:

- Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa

- Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật

- Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc

- Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn

- Giám sát các phản ứng hữu cơ

1.3.3.2 Sắc ký cột

Đây là phương pháp sắc ký được sử dụng nhiều nhất

Sắc ký côt là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột hình trụ hở 2 đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đường kính trong rất hẹp Theo nghĩa rộng, sắc ký cột bao gồm cả sắc ký cột cổ điển dùng trong điều chế các chất và sắc ký cột hiện đại thường dùng trong phân tích như HPLC, GC Ở đây chỉ trình bày các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển Với kích thước cột lớn, sắc ký cột cổ điển chủ yếu được dùng trong việc chiết tách

thường phân ra làm 3 loại là loại mịn (15 - 40µm), loại vừa (40 - 63µm) và loại thô (63 - 200µm) Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp của mẫu và khả năng tách của hệ thống Tỉ lệ mẫu / pha tĩnh thường là 1/30 - 1/100 hay hơn Trong 1 vài kỹ thuật, tỉ lệ này có thể tăng tới 1/10

Cột sẽ được triển khai bằng dung môi thích hợp Dung môi có các chất được tách ra sẽ đi ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bằng bộ phận hứng phân đoạn Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và những phân đoạn giống nhau được gộp chung, loại dung môi để thu được chất tinh khiết Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, các băng chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các

“khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất

Trong sắc ký cột cổ điển, áp lực đẩy dòng dung môi qua cột là áp suất thủy tĩnh Với cột dài và chất nhồi cột mịn, tốc độ dòng dung môi giảm có thể ảnh hưởng tới kết quả sắc ký do hiện tượng khuyếch tán Thời gian khai triển cũng rất dài, có khi là nhiều ngày hay hơn Để khắc phục phần nào nhược điểm này, một số kỹ thuật sắc ký cột cải tiến đã được sử dụng giúp giảm thời gian phân tách Tuy nhiên, hiệu lực tách của cột cũng có thể giảm Khi ấy người ta thường thu các phân đoạn đơn giản để tiếp tục phân tách trên các cột sắc ký

khác Hai kỹ thuật hay sử dụng là sắc ký cột nhanh (flash chromatography, FC)

và sắc ký cột chân không (vacuum liquid chromatography, VLC) Cả hai đều sử

dụng cột ngắn và đường kính lớn để tăng tốc độ dòng và tăng lượng mẫu FC sử dụng áp suất dương thấp trên đầu cột còn VLC sử dụng áp suất âm ở cuối cột

Việc nhồi cột bằng chất hấp phụ cũng hết sức quan trọng, có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

+ Nhồi cột khô: Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chấp hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Tiếp theo, dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

+ Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

 Ưu điểm:

- Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích

- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích

- Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng

1.4 Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

1.4.1 Phổ IR

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phân tích rất hiệu quả Kĩ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại

Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học

Ví dụ: dao động hóa trị của nhóm cacbonyl C=O trong andehyt/xeton là 1650

- 1800 cm-1, trong anhydrit là 1750 - 1870 cm-1; nhóm C=C của anken là 1600

- 1650 cm-1; nhóm C≡C của ankin là 3150 cm-1

; nhóm OH tự do trong các hydroxyl là 2500 - 3500 cm-1; nhom C-O-C là 1150 - 1250 cm-1 Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp chất hóa học coi như “ dấu vân tay’’, có thể căn cứ vào đó để nhận dạng chúng

Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, lượng chất cần cho phép đo là 2-3 mg và khó thu hồi lại Do đó, với lượng chất thu được ít từ các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại thường được

đo sau khi hoàn chỉnh các phép đo khác

1.4.2 Phổ khối lượng

Cơ sở của phương pháp phổ khổi lượng đối với các hợp chất hữu cơ là

sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phần tử mang năng lượng cao Sau đó, phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận thu được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối này có thể xác định được phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu

Khi ion hóa mẫu theo các phương pháp khác nhau sẽ thu được các phổ khối lượng các nhau Một số phương pháp thường được sử dụng:

 Phổ EI - MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) phương

pháp va chạm electron Sử dụng chùm electron để “bắn phá’’ phân tử mẫu

ở trạng thái hơi Electron va chạm với các phân tử trung hòa làm bật ra electron và phá vỡ phân tử thành các mảnh ion, mảnh gốc hay phân tử trung hòa nhỏ Điều kiện chuẩn để thực hiện EI là 70 eV

 Phổ ESI - MS (Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) phổ phun

điện tử Phổ này thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều phổ EI

- MS Dung dịch mẫu sẽ được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân không dưới điện trường Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hơi dung môi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion