Nghiên cứu thành phần triterpene glycoside từ loài thìa canh lá to (gymnema latifolium)

1 MỞ ĐẦU Ngày nay, các dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong đời sống với nhiều ưu điểm như dễ hấp thu, ít gây độc, ít tác dụng phụ, có

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

HÀ NỘI, 2018

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

Người hướng dẫn khoa học

PGS TS Phan Văn Kiệm

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này, em đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của các quý thầy cô, anh chị và bạn bè

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy

giáo PGS.TS Phan Văn Kiệm, người thấy đã tận tình hướng dẫn em trong

suốt quá trình thực hiện khóa luận

Cảm ơn các anh, chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ

truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em trong suốt thời gian em thực tập

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã cho

phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại Viện

Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng và

các thầy cô giáo trong Khoa Hóa học – Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt 4 năm học tập tại trường Cảm ơn anh chị, bạn bè đã luôn bên cạnh, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình em, những người thân luôn bên em, hết lòng ủng hộ em cả về vật chất cũng như tinh thần trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng em xin kính chúc thầy cô trong Khoa Hóa học – Trường ĐHSP Hà Nội 2, các thầy cô và các anh chị Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VIệt Nam dồi dào sức khỏe, thành công trong công việc

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Hoài

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phan Văn Kiệm Các số liệu, kết quả trong khóa luận

là trung thực và là của bản thân tôi Các kết quả nghiên cứu ra không hề sao chép của ai Nếu có vấn đề gì không đúng tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Sinh viên

Nguyễn Thị Hoài

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về cây thìa canh lá to 3

1.1.1 Khái quát thực vật học [47] 3

1.1.2 Mô tả đặc điểm 3

1.1.3 Phân bố và sinh thái 4

1.1.4 Bộ phận dùng, tính vị, công năng và công dụng 5

1.1.5 Thành phần hóa học 6

1.1.6 Hoạt tính sinh học 15

1.2 Giới thiệu về lớp chất saponin 17

1.2.1 Giới thiệu chung 17

1.2.2 Các nhóm saponin 17

1.2.2.1 Saponin triterpenoid 18

1.2.2.2 Saponin steroid 21

1.2.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của saponin 23

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 25

1.3.1 Đặc điểm chung của chiết 25

1.3.2 Cơ sở của quá trình chiết 25

1.3.3 Quá trình chiết 25

1.3.3.1 Chọn dung môi chiết 25

1.3.3.2 Quá trình chiết 27

1.4 Các phương pháp sắc ký trong phân lớp các hợp chất hữu cơ 28

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký [1] 29

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký 29

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký 29

1.4.3.1 Sắc ký cột (CC) 30

1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng 31

1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [1] 32

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) 32

1.5.2 Phổ khối lượng( Mass spectroscopy, MS) 32

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 33

1.5.3.1 Phổ 1H- NMR: 33

1.5.3.2 Phổ 13C-NMR: 34

1.5.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer): 34

1.5.3.4 Phổ 2D-NMR: 34

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Mẫu thực vật 36

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 36

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 36

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 36

2.2.3 Sắc ký cột (CC) 36

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 37

2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 37

2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 37

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ( 1D-NMR) 37

2.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ( 2D-NMR) 37

2.4 Dụng cụ và thiết bị 37

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 37

2.4.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 38

2.5 Hóa chất 38

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 39

3.1 Phân lập các hợp chất 39

3.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 41

3.2.1 Hợp chất GL5A1 41

3.2.2 Hợp chất GL8B1 41

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 42

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1 42

4.2 Xác định cấu trúc của hợp chất GL8B1 49

KẾT LUẬN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Electron Impact Mass Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ

Hình 1.1 Hình ảnh dây thìa canh lá to [48] 3

Hình 1.2 Cấu trúc của saponin 17

Hình 1.3 Khung cấu trúc nhóm olean và β-amyrin 18

Hình 1.4 Khung cấu trúc nhóm Ursan và α-amyrin 18

Hình 1.5 Khung cấu trúc nhóm lupna 19

Hình 1.6 Khung cấu trúc nhóm Hopan 19

Hình 1.7 Hai genin Protopanaxadiol, Protopanaxatriol khung Dammaran 20

Hình 1.8 Holothurin A khung Lanostan 20

Hình 1.9 Momorcharaside B khung Cucurbitan 21

Hình 1.10 Ba chất sapogenin 22

Hình 1.11 Thủy phân Sarsaparillosid 22

Hình 1.12 Thủy phân Avenacosid A 23

Hình 1.13 Solanin 23

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn MeOH của loài G latifolium 40

Hình 4.1.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất GL5A1 42

Hình 4.1.2 Phổ 13C-NMR của hợp chất GL5A1 43

Hình 4.1.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1 44

Hình 4.1.4 Phổ HSQC của hợp chất GL5A1 45

Hình 4.1.5 Phổ HMBC của hợp chất GL5A1 45

Hình 4.1.6 Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1 46

Hình 4.1.7 Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1 46

Hình 4.1.8 Các tương tác HMBC chính của hợp chất GL5A1 47

Hình 4.2.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất GL8B1 49

Hình 4.2.2 Phổ 13C-NMR của hợp chất GL8B1 50

Hình 4.2.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất GL8B1 51

Hình 4.2.4 Phổ HSQC của hợp chất GL8B1 51

Hình 4.2.5 Phổ HMBC của hợp chất GL8B1 52

Hình 4.2.6 Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1 52

Hình 4.2.7 Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1 53

Hình 4.2.8 Tương tác HMBC chính của hợp chất GL8B1 53

Bảng 4.1 Bảng số liệu phổ của hợp chất GL5A1 và hợp chất tham khảo 47

Bảng 4.2 Bảng số liệu phổ của hợp chất GL8B1 và hợp chất tham khảo 54

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, các dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được

sử dụng rộng rãi và phổ biến trong đời sống với nhiều ưu điểm như dễ hấp thu, ít gây độc, ít tác dụng phụ, có sẵn trong tự nhiên, có giá trị kinh tế cao… Các hợp chất thiên thể hiện hoạt tính sinh học rát phong phú và là một trong những định hướng để con người có thể tống hợp ra nhiều loại thuốc mới với những ưu điểm vượt trội được dùng để chữa bệnh mà ít gây các tác dụng phụ cũng như không ảnh hưởng đến môi sinh Vì vậy, việc nghiên cứu nguồn dược liệu trong thiên nhiên để ứng dụng vào sản xuất thuốc phòng và chữa bệnh đang là xu hướng hiện nay của y học Việt Nam và y học thế giới

Việt Nam là quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á, nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng phong phú Đặc biệt là nguồn tài nguyên rừng ở nước ta, không chỉ đa dạng

về số lượng loài mà còn chứa đựng giá trị đa dạng sinh học cao chưa được khám phá Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài trong đó có 4000 loài được nhân dân sử dụng làm thảo dược cùng các mục đích khác phục vụ đời sống con người Đây chính là nguồn dược liệu quý phục vụ cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh phục vụ cho đời sống Cùng với sự đa dạng do thiên nhiên mang lại, Việt Nam là một trong những quốc gia có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng các thực vật và sinh vật trong các bài thuốc y học cổ truyền

Từ ngày xa xưa, người ta đã biết sử dụng các loại cây phối hợp với nhau

để tạo được thành các bài thuốc dân gian có nhiều tác dụng tốt như chữa được nhiều bệnh mà không để lại tác dụng phụ hoặc ít để lại tác dụng phụ

Tuy nhiên, phần lớn các cây thuốc và các bài thuốc mới chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu, đánh giá một cách

khoa học, cũng như các thành phần hóa học, các chất có hoạt tính sinh học cao trong cây có thể sử dụng để làm thuốc chữa được nhiều bệnh khác mà chưa được phân tích và tách chiết ra

Xuất phát từ các cơ sở trên, việc nghiên cứu và khai thác các chất có hoạt tính sinh học cao từ các nguồn dược liệu ở Việt Nam là rất cần thiết và đặc biệt có ý nghĩa to lớn về mặt khoa học cũng như thực tiễn

Hiện nay bệnh đái tháo đường là một trong các căn bệnh mãn tính, gây

tử vong cao, đứng hàng thứ ba trên thế giới sau bệnh tim mạch và ung thư Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh ngày một gia tăng, đòi hỏi cấp thiết phải tìm ra các loại thuốc hiệu quả đặc trị

Trong y học cổ truyền, loài thìa canh lá to và loài thìa canh có tác dụng tính kích thích dạ dày, đồng thời làm se da, lợi tiểu, lại rất bổ dưỡng và nhất là làm giảm thiều được lượng đường trong máu Cây còn có tác dụng chống béo phì, giảm mỡ máu, đặc biệt cây thìa canh lá to còn hỗ trợ điều trị bệnh tiêu đường hiệu quả tự nhiên mà không tốn kém mà lại an toàn, ngoài ra nó còn hỗ trợ điều trị cao huyết áp… các nghiên cứu về dược học từ loài thìa canh lá to trên thế giới cho thấy nhiều tác dụng tuyệt vời đặc biệt là đối với bệnh đái tháo đường đang ngày một gia tăng và phổ biến như hiện nay

Vì vậy em lựa chọn đề tài: với mục đích khảo sát thành phần hóa học nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp trong việc nghiên cứu phát triển thuốc mới và giải thích tác dụng chữa bệnh của cây thuốc quý này

Nhiệm vụ của đề tài:

1 Xử lí mẫu và tạo dịch chiết

2 Nghiên cứu phân phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ phân đoạn

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về cây thìa canh lá to

1.1.1 Khái quát thực vật học [47]

Tên khoa học: Gymnema latifolium

Tên thường gọi: Dây thìa canh lá to

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium), còn gọi là Lõa ti lá rộng, là

dạng cây thân gỗ, dây leo, thân leo tới 6m Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ Cuống lá 1,5 - 4 cm, có lông tơ dày đặc, phiến lá 8-13 × 5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm Đài hình trứng, phủ lông măng.Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 × 1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng Khối nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy Khối phấn hình thuôn Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi [8]

Quả đại hình mác nhọn, 4,5-5,5 × 1,5-2 cm Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm × 5 mm, mép dạng màng, mào lông dài 3 cm [8]

1.1.3 Phân bố và sinh thái

Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng

Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand, Indonesia [45] Ở Việt Nam được trồng ở nhiều nơi như Cúc Phương( Ninh Bình), Hòa Bình, Thái

Nguyên, Thanh Hóa, Nam Định.[8]

Sinh thái: Dây thìa canh lá to nói riêng là loài không ưa trũng, ngập úng

nên khi trồng đây thìa canh phải chọn vùng đất cao nhưng phải thoát nước tốt, đất càng mùn và tơi xốp càng tốt cho cây Nếu muốn trồng cây ở nhà thì cũng

có thể trồng trên sân thượng nhưng nguồn đất phải giàu dinh dưỡng, đắp ụ đất cao Đối với dây thìa canh, từ khi trồng đến khi thu hoạch mất khoảng 6-8 tháng, trồng 1 lần có thể thu hoạch 10 năm Một năm có thể thu hoạch từ 4-5 lần, từ tháng 4-12, cứ 2 tháng thì thu 1 lần

5

1.1.4 Bộ phận dùng, tính vị, công năng và công dụng

Bộ phận dùng: Thân leo Thường thu hái dây lá và ngọn non, sơ chế, rửa

sạch sau đó đem phơi hay sấy khô

Tính vị, công năng: Dây thìa canh có vị đắng, cay Lá của cây khi nhai

có tác dụng làm tê trong vài giờ, vị giác đối với các chất ngọt và đắng Có tác

dụng mát, bổ, làm dễ tiêu và lợi tiểu

Công dụng: Dây thìa canh được dùng làm trị đái tháo đường với liều

uống hàng ngày là 4g lá khô (Võ Văn Chi, 1997; 396 - 397) Dây thìa canh được dùng điều trị đái tháo đường ở nhiều nước khác nhau trên thế giới

Ở các nước Đông Nam Á, ngoài công dụng trị đái tháo đường, rễ và lá được dùng trị viêm khớp dạng thấp, bệnh gút, viêm mạch máu, phù, sốt, ho, trĩ, nhọt, mụn, lở, rắn cắn, thuốc làm dễ tiêu và lợi tiểu Lá có khi được dùng làm rau ăn

Ở Trung Quốc, tất cả các bộ phận của cây, đặc biệt là rễ, được dùng trị viêm khớp dạng thấp, bệnh gút, viêm mạch máu, phù, sốt, trĩ và rắn cắn (Lemnens R.M.H.J et al., 2003: 228 - 236)

Ở Ấn Độ, lá của dây thìa canh được dùng trị đái tháo đường và một số chứng bệnh khác như khó tiêu, trĩ, táo bón, sốt rét, ho, viêm phế quản, hen Dây thìa canh được dùng làm thuốc trợ tim, lợi tiểu, làm dễ tiêu, nhuận trành, gây tăng trương lực cơ tử cung, trị các bệnh đa tiết mật, giác mạc và thể kính

ở bệnh nhân đái tháo đường

Lá đắp trị vết thương và trộn với dầu thầu dầu đắp trị sưng hạch, gan to

và lách to

Rễ tán bột chữa rắn cắn

Quả đắng và có tác dụng làm giảm trướng bụng, và được dùng trị bệnh phong, đái tháo đường, viêm phế quản, chữa loét, trị ngộ độc và diệt giun

Toàn cây dùng trị lỵ

Trong thú y, dây thìa canh được dùng cho gia súc ăn để lợi sữa

Ở Đông Phi, rễ tán bột và sắc lấy nước uống để điều trị động kinh, rắn cắn và dùng ngoài trị nhọt (Kirtikar K.R et al., 1998: 1625 - 1627; Williamson E.M et al., 2003: 228 - 236)

1.1.5 Thành phần hóa học

Dây thìa canh lá nhỏ (Gymnema sylvestre) từ lâu đã được biết đến rộng

rãi với tác dụng hạ đường huyết và kiểm soát béo phì Giai đoạn gần đây, một

loài dây thìa canh khác là dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex

Wight) đã được khẳng định có kết quả tốt hơn hẳn so với dây thìa canh lá nhỏ

Cho đến nay, loài Gymnema latifolium chỉ mới được nghiên cứu rất sơ

lược về thành phần hóa học Các nhóm chất chứa trong cây này chỉ mới được

đề cập đến trong rất ít các tài liệu, bao gồm: HCN-glucosid [36], saponin, flavonoid, tanin, sterol, chất béo acid amin, đường khử và coumarin trong loài Gymnema latifolium Wall Ex Wight thu hái tại Hòa Bình [2]

Các nghiên cứu về thành phần hóa học vẫn đang tập trung vào loài

Gymnema sylvestre Theo đó các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của các loài thuộc chi Gymnema được bắt đầu vào những năm

1950, chủ yếu bởi các nhà khoa học Ấn Độ Nghiên cứu về thành phần hóa học thực sự bắt đầu khi có các thiết bị xác định cấu trúc Hoạt tính sinh học

đặc trưng của loài G sylvestre là khả năng hạ đường huyết [9] Tuy nhiên như

phổ cộng hưởng từ nhân NMR, phổ khối lượng MS Các nghiên cứu cho thấy

G sylvestre có thành phần hóa học rất đa dạng, trong đó thành phần chính là

các conduritol, gymnemasin

Vào khoảng những năm 1980-1990, các nhà khoa học Nhật Bản tập trung

mạnh vào nghiên cứu thành phần hóa học loài này Cụ thể từ lá loài G

sylvestre được các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập và xác định cấu trúc của

một hợp chất mới conduritol A (1) [10] Hợp chất này đã được phát hiện có khả

năng ức chế enzyme aldose mạnh trên chuột và không gây độc [11] Tiếp đó,

7

Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc thành công của 7 hợp

chất mới gymnemic acid I-VII (2-8) [12, 13] Trong quá trình tìm kiếm các hợp

chất có tác dụng diệt cỏ, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định đƣợc 5

hợp chất mới từ lá loài G sylvestre là gymnemic acid VIII-XII (9-13) [14]

Từ lá loài G sylvestre, Sahu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc

của 4 hợp chất mới, đƣợc đặt tên là gymnemasin A-D (14-17) [15] Tiếp đó

vào năm 1996, Murakami và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 2

hợp chất mới, đặt tên là gymnemoside a và b (18-19) cùng với 10 hợp chất đã

biết Cũng tiếp tục nghiên cứu này, Yosikawa và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và đã xác định đƣợc 4 hợp chất mới và đƣợc đặt tên

là gymnemoside c-f (20-23) [16] Các nhà khoa học Trung Quốc, đã phân lập

và xác định cấu trúc của 6 hợp chất mới (24-29) và 2 hợp chất đã biết [17]

O O

OH O

HO

OH HO

HO

OH OH

OH

OAc HOOC

OH O

HO

OH HO

HO

OH OR

OH

OH HOOC

14 R = Tigloyl

15 R = H

20

O O OH HO

HO

OH

OH O

OH

OAc

O O

OH HO

HO OH HO

HO

O O OH HO

HO

S1

O

O O

OH HO

HO OH HO

Vào năm 2001, Ye và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện

ra 4 hợp chất mới có tác dụng diệt cỏ từ loài G sylvestre, 4 hợp chất này đƣợc đặt tên là: 21α-O-benzoylsitakisogenin 3-O-α-D-glucopyranosyl(1→3)-α-D-

9

glucuronopyranoside (30), longispinogenin D-glucuronopyranoside potassium (31), 29-hydroxylongispinogenin 3-O-α-D- glucopyranosyl(1→3)-α-D-glucuronopyranoside potassium (32), alternoside

3-O-α-D-glucopyranosyl(1→3)-α-II sodium (33) [18]

Liu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 1 hợp chất mới (34) và

4 hợp chất đã biết từ loài G sylvestre [19] Tiếp nối các nghiên cứu, Zhu và cộng

sự đã phân lập đƣợc 2 hợp chất mới, 16β-hydroxyl

olean-12-en-3-O-[β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-olean-12-en-3-O-[β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranoside (35) và 16β,21β,28-trihydroxy-olean-12-ene-3-O-glucoronopyranoside (36) [20]

Zhang và cộng sự đã thông báo phân lập đƣợc 1 hợp chất mới, 3β,16 trihydroxy-olean-12-ene3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-

β,22α-(1→6)-β-D-glucopyranoside (37) và 4 hợp chất đã biết từ loài G sylvestre [21]

Zarrelli và cộng sự thông báo đƣợc 7 hợp chất mới, bao gồm 6 oleanane (38-43):

3β,16β,21β,23-tetrahydroxyolean-12-ene, 12-ene, 3β,16β,23,28-tetrahydroxyolean-13(18)-ene, 16β,23,28-trihydroxyolean- 12-en-3-one, 16β,21β,23,28-tetrahydroxyolean-12-en-3-one, 16β,21β,22α,23,28- pentahydroxyolean-12-en-3-one và 1 lupane 3β,16β,23,28-tetrahydroxylup-

3β,16β,21α,23,28-pentahydroxyolean-20(29)-ene (44) cùng với 6 hợp chất đã biết từ phần trên mặt đất loài G

sylvestre [22]

11

Cũng các nghiên cứu thuộc nhóm tác giả này tiếp tục công bố 6 hợp chất mới khác, đó là (3β,16β)-olean-12-ene-3,16,23,28-tetrayl tetraacetate, (3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentahydroxyolean-12-en-21-yl(2S)-2-

methylbutanoate, 12-en-21-yl (2S)-2-methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentakis

(3β,16β,21β,22α)-28-(acetyloxy)-3,16,22,23-tetrahydroxyolean-(acetyloxy)olean-12-en-21-yl (2S)-2-methylbutanoate,

(3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentahydroxyolean-12-en-21-yl (2E)-2-methylbut-2-enoate, và

(3β,16β)-lupane-3,16,20,23,28-pentol (45-50) [23]

Từ loài G inodorum, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chấtmới: 2α,3β-dihydroxy-olean-12-ene-23,28-dioicacid-3-O-β-D- glucopyranoside và 2α,3β,15β-trihydroxy-olean-12-ene-23,28-dioic acid-3-O-

β-D-glucopyranoside [24] Cũng từ loài này, Atsuchi và cộng sự đã phân lập

đƣợc 1 hợp chất mới glucopyranosyl-β-D-glucopyranosiduronic acid [25]

(3β,16β)-16,28-dihydroxyolean-12-en-3-yl-2-O-β-D-13

Từ loài G alternifolium, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định

cấu trúc của 6 hợp chất mới và đƣợc đặt tên là gymnepregoside A-F [26] Cũng từ loài này, nhóm tác giả tiếp tục công bố phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất mới khác và đặt tên là gymnepregoside G-Q [27]

6 hợp chất mới đặt tên là gymnetinoside A-F cùng với 6 hợp chất cũ,

sequinoside K, khaephuoside B, and albibrissinoside A (60-69) đƣợc Tian và

cộng sự phân lập từ loài G tingens Các hợp chất này đƣợc phát hiện có khả

năng bảo vệ tế bào gan mạnh [28]

8 hợp chất mới thuộc khung pregnane steroidal glycoside đã đƣợc phân

lập từ vỏ quả loài G griffithii và đƣợc đặt tên là gymnemogriffithoside A-H

Các hợp chất này đã đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thƣ (BT 474, Chago, Hep-G2, KATO-III và SW620) và hoạt tính ức chế

enzyme α-glucosidase và thể hiện hoạt tính ở mức độ trung bình [29]

15

1.1.6 Hoạt tính sinh học

Bên cạnh việc sử dụng phổ biến để điều trị bênh tiểu đường, các loài

thuộc chi Gymnema còn được sử dụng để điều trị một số bệnh như béo phì,

viêm khớp, bệnh Parkinson và bệnh sơ vữa động mạch Các hoạt chất từ các

loài thuộc chi Gymnema đã được nghiên cứu về tác dụng kháng viêm, kháng

khuẩn, và kháng ung thư, và kháng cỏ dại Dược tính của các loài này đã được nghiên cứu rộng dãi Hơn 70 hợp chất mới đã được phân lập Dịch chiết đã được nghiên cứu lâm sàng và trên động vật Các hoạt tính được thử nghiệm

bao gồm:

Hoạt tính trị bệnh tiểu đường

Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết saponin cùng với 5 triterpene

saponin gymnemic acid I-IV và gymnemasaponin V từ loài G sylvestre đã

được thông báo Hợp chất gymnemic acid IV (3.4/13.4 mg/kg) được phát hiện

có tác dụng hạ đường huyết từ 14,0-60% trong vòng 6h khi so sánh với glibenclamide Thêm vào đó, hợp chất này cũng làm tăng lượng insulin khi cho chuột bị tiểu đường uống ở nồng độ 13.4 mg/kg [30] Nghiên cứu khác về

tác dụng hạ đường huyết của lá loài G sylvestre thông qua kiểm soát hàm

lượng glyucose trong máu và lipid trên chuột Wistar ở nồng độ 200mg/kgP Kết quả cho thấy dịch chiết loài này làm giảm đáng kể đường trong huyết tương và mỡ máu (thông qua các thông số cholesterol VLDL, LDL) [31] Với liều triacetate dihydroxy gymnemic (20 mg/kgP) bằng đường uống trong 45 ngày trên chuột bị tiểu đường Các thông số đánh giá bao gồm đường huyết, insulin, hemoglobin glycated (HbA1c), mô glycogen, các thông số lipid như triglycerid, cholesterol tổng, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol và họat tính của các enzym gan đánh dấu, như aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP) và phosphatase acid (ACP) Kết quả cho thấy hợp chất dihydroxy triacetate gymnemic tại liều 20

mg đã tác động đáng kể trên tất cả các thông số sinh hóa học so với nhóm

chuột mang bệnh tiểu đường [32] Gymnemic acid từ lá loài G sylvestre đã làm tăng đáng kể sự tiết ra insulin từ tế bào β- tuyến tụy của chuột mang bệnh

tiểu đường [33]

Một nghiên cứu ở cấp độ lâm sàng về tác dụng tiết insulin của dịch chiết

ethanol loài G sylvestre thông qua đường uống (500 mg/ngày) trong 60 ngày

cho thấy nồng độ glucose trong máu lúc đói giảm từ 162 mg/L xuống còn 119 mg/L, nồng độ glucose trong máu sau ăn giảm từ 291 mg/L xuống 236 mb/L; tăng nồng độ insulin huyết thanh từ 24 đến 32 μU/mL, tăng nồng độ C-peptide huyết thanh từ 298 đến 447 pmol/L, nhưng không ảnh hưởng đến cân nặng [34]

Một số nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết loài G inodorum đã chỉ

dịch chiết cũng như các hợp chất từ loài này đã thể hiện tác dụng hạ đường huyết mạnh [35, 36]

Hoạt tính chống béo phì

Saponin từ dịch chiết nước của lá loài G sylvestre đã được phát hiện có

tác dụng chống béo phì tương đương với orlistat, một loại thuốc tổng hợp

dùng để điều trị bệnh béo phì [37] Dịch chiết nước loài G sylvestre đã phát

hiện có khả năng chống béo phì trên chuột thông qua giảm nồng độ serum lipid, leptin, insulin, glucose, apolipoprotein B và LDH trong khi tăng nồng

độ HDL-cholesterol, apolipoprotein A1 [38]

Hoạt tính kháng viêm khớp

Dịch chiết nước và ether dầu hỏa từ lá loài G sylvestre đã được phát

hiện có tác dụng rõ rệt trong việc kiểm soát hiệu quả bệnh nhân viêm khớp [34] Thêm vào đó, các dịch chiết khác nhau từ loài này cũng đã được phân bố đều trong 1% Tween 8 và diclofenac sodium cho chuột viêm đa khớp uống 1 lần/ngày trong 21 ngày Kết quả cho thấy dịch chiết ether dầu hỏa làm giảm

rõ các yếu tố viêm như IL-1b, TNF-α, GM-CSF, PGDF [39]

17

Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu về hoạt tính diệt tế bào ung thư [40], kháng viêm [41], kháng khuẩn [42] từ các hợp chất cũng như cặn chiết của

loài thuộc chi Gymnema

1.2 Giới thiệu về lớp chất saponin

1.2.1 Giới thiệu chung

Saponin hay saponoid là một nhóm glycosid lớn, Sapo trong tiếng la tinh

có nghĩa là xà phòng Saponin có mặt trong các lòa thực vật như một số cây

họ đậu: đậu tương, đậu Hà Lan và một số loài động vật như: hải sâm, cá sao…Cấu trúc saponin gồm 2 phần: Aglycone và Glycone

Hình 1.2 Cấu trúc của saponin

Dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid

1.2.2.1 Saponin triterpenoid

Saponin triterpenoid có bản chất là các hợp chất triterpenoid gốm 6

nhóm hemitrerpen, tạo nên 2 loại: - Saponin triterrpenoid pentacyclic: Bao

gồm các nhóm nhỏ: Olean, Ursan, Lupan, Hopan

+ Nhóm Olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này

23 24

15 16

17 28

30 20 21

22

29

19

18 12

(A)

olean β-amyrin

R1=R2=R3=R4=R5= CH3

Hình 1.3 Khung cấu trúc nhóm olean và β-amyrin

Cấu trúc hóa học: Phần aglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn chất của 3-hydroxy olean 12-ene, tức là -amyrin

+ Nhóm Ursan: Nhóm ursan có cấu trúc tương tự olean chỉ khác nhau ở nhóm methyl ở C-30 không đỉnh vào vị trí C-20 mà đỉnh vào C-19

Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống các nhóm trên chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí C20-C29

+ Nhóm Hopan: cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A, B, C, D giống như các nhóm trên, vòng E là vòng 5 cạnh giống nhóm lupan Tuy nhiên, nhóm C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl gốc đỉnh C-18 thay vì ở C-17

Hopan Hình 1.6 Khung cấu trúc nhóm Hopan

- Saponin triterpenoid: Nhóm này được chia làm 3 nhóm nhỏ:

Dammaran, Lanostan, Cucurbitan

+ NHóm Dammaran: Phần Aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh, Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran

Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật Hai genin chính là protopanaxadiol và protopanaxatripol Phần đường nối vào OH ở C-3 hoặc có khi thêm một mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh

Hình 1.7 Hai genin Protopanaxadiol, Protopanaxatriol khung Dammaran

+ Nhóm Lanostan: Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm - Holothuria spp là một ví dụ của nhóm này

H HO

OH

H HO

OH

H OH

O

H

OH

OH O

H

OH OH

S O

O O

Na

Hình 1.8 Holothurin A khung Lanostan

21

+ Nhóm Cucurbitan: Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong

họ cucurbitaceae Ở đây nhóm CH3 gốc thay vì ở vị trí C-10 lại đính ở C-9

O OH

OH

OH

OH O

- Nhóm spirostan: Ta xét 3 chất sapogenin làm ví dụ: sarsasapogenin,

smilagenin, tigogenin Những chất này có 27 carbon nhƣ cholesterol, nhƣng mạch nhánh từ C20-27 tạo thành 2 vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy), một vòng là hydrofuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F) Hai vòng này nối với nhau bởi một carbon chung ở C-22 Mạch nhánh này đƣợc gọi là mạch nhánh spiroacetal

O O

OH

H

H A

E

27 25 26

24 23

22 20 21

17 18

13

14 8 9

12 11

B

F

O O

OH

H

H

O O

OH

H

H

Tigogenin Hình 1.10 Ba chất sapogenin

Các sapogenin nhóm này có nối vòng C Và D trans Còn vòng A và B có thể là cis như ở chất sarsasapogeninvà smilagenin hoặc có thể là trans như ở chất tigogenin

- Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ

khác là vòng F bị biến đổi

Trường hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm ancol bậc 1 ở C-26 được nối với đường glucose Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzim hoặc acid) thì xảy ra

sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan Ví dụ sarsaparillosid dưới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin

enzym

Hình 1.12 Thủy phân Avenacosid A

- Nhóm aminifurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid

nói ở trên nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2

- Nhóm Spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy

của vòng F được thay bằng NH Một điểm cần chú ý là ở đây có isomer ở

Solanin Hình 1.13 Solanin 1.2.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của saponin

Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho Saponin là hoạt chất chính trong các dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, sạch môn,… Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ

H+

giải, thiên môn, mạch môn… Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ tăng cường sinh lực như nhân sâm, tam thất, ngũ gia bì, đinh lăng và một số cây thuốc họ nhân sâm khác Saponin làm tăng sự thấm của tế bào, sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu Một số có tác dụng chống viêm như saponin cam thảo, ngưu tất, cỏ xước Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế hoạt động của virut như saponin cam thảo, lá cà chua, mầm khoai tây Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mền (nhuyễn thể)

Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tống hợp các thuốc steroid Digitonin dùng để định lượng cholesterol Saponin trong đậu nành cũng giống như phytate, hành xử như chất anti-oxidants để bảo vệ tế bào cơ thể chúng ta khỏi bị hư hại do tác dụng các gốc tự do Nó cũng còn có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng và đồng thời làm giảm lượng cholesterol trong máu Saponin trong nhân sâm làm tăng chuyển hóa lipid, theo các thí nghiệm, nhân sâm có thể ngăn ngừa sự phát sinh cholesterol cao ở thỏ, vì vậy mà ngăn ngừa được sự hình thành xơ vữa động mạch Người

ta đã khám phá ra những tác dụng của nhân sâm và các thành phần hóa học đơn lẻ của nó, dặc biệt là saponin (còn gọi là ginsenoside) Trong đó có một hoạt chất mang tên gọi là Ginsenoside Rh2- đây là một trong hơn 30 loại saponin có trong thành phần của Nhân sâm

Saponin tam thất Việt Nam chứa chủ yếu saponin dammaran Các nhà khoa học đã phân lập được hai saponin chủ yếu của Tam thất Việt Nam và xác định chúng là ginsenosid- Rb1 và ginsenosid- Rg1 Saponin Rg có tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh, có tác dụng chống mệt mỏi, tăng khả năng lao động trí óc và chân tay, nhưng loại Saponin như Rb thì có tác dụng

ức chế trung khu thần kinh biểu hiện an thần gây ngủ [3,4]

25

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

1.3.1 Đặc điểm chung của chiết

Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa tan với nó

Mục đích của chiết:

+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu

+ Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên

1.3.2 Cơ sở của quá trình chiết

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:

1.3.3.1 Chọn dung môi chiết

Trông thường các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy

Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hưởng tới hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetyniat và tributylphotphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản như các thùng nhựa hoặc các nút nhựa

Methanol và chloroform thường chứa đioctylphtalat [đi-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlorofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ

bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…

Những tạp chất của cloroform như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ững với một vài hợp chất như các ankaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm khác Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axits clohidric (HCl) cũng

có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt lạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại khả năng phân cực của Chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol