Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym a glucosidase và a amylase của loài dây thìa canh gymnema sylvestre (retz ) r br ex sm và dây thìa canh lá to gymnema latifolium wall ex wight

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Dương Thị Hải Yến NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM -GLUCOSIDASE VÀ -AMYLASE CỦA LỒI DÂY THÌA CANH - Gymnema sylvestre (RETZ.) R.BR EX SM VÀ DÂY THÌA CANH LÁ TO - Gymnema latifolium WALL EX WIGHT Hà Nội - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Dương Thị Hải Yến NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM -GLUCOSIDASE VÀ -AMYLASE CỦA LỒI DÂY THÌA CANH - Gymnema sylvestre (RETZ.) R.BR EX SM VÀ DÂY THÌA CANH LÁ TO - Gymnema latifolium WALL EX WIGHT Chuyên ngành: Mã số: Hóa Hữu Cơ 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Phan Văn Kiệm PGS TS Nguyễn Xuân Nhiệm Hà Nội – 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học PGS TS Phan Văn Kiệm PGS TS Nguyễn Xuân Nhiệm Các số liệu, kết luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2021 Tác giả luận án Dương Thị Hải Yến ii LỜI CẢM ƠN Luận án hồn thành Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong trình nghiên cứu, tác giả nhận giúp đỡ quý báu thầy cô, nhà khoa học, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, cảm phục kính trọng tới PGS TS Phan Văn Kiệm - người Thầy định hướng, tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực luận án Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Xuân Nhiệm - người Thầy tận tâm hướng dẫn khoa học truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm quý giá Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ, đồng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển tập thể cán Viện quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn phịng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển quan tâm giúp đỡ, với lời khun bổ ích góp ý q báu việc thực hồn thiện luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc giúp đỡ thực phép đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng phân giải cao phép thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase enzyme αamylase Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm tiên tiến hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa sinh biển giúp đỡ tơi giúp đỡ thực phép thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase enzyme α- amylase Tơi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học công nghệ Việt Nam (NAFOSTED) tài trợ kinh phí theo mã số đề tài 104.01-2017.25 Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới tồn thể gia đình, bạn bè người thân ln ln quan tâm, khích lệ, động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! iii MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu chi Gymnema 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Gymnema 1.1.2 Giới thiệu loài Gymnema sylvestre Gymnema latifolium 1.1.2.1 Loài Gymnema sylvestre 1.1.2.2 Loài Gymnema latifolium 1.1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học chi Gymnema 1.1.3.1 Các hợp chất steroid 1.1.3.2 Các hợp chất triterpenoid 1.1.3.3 Phenolic hợp chất khác 17 1.1.4 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Gymnema 19 1.1.4.1 Hoạt tính trị bệnh tiểu đường 19 1.1.4.2 Hoạt tính chống béo phì 21 1.1.4.3 Hoạt tính chống oxi hóa 21 1.1.4.4 Tác dụng bảo vệ gan 23 1.1.4.5 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 23 1.1.5 Tình hình nghiên cứu chi Gymnema Việt Nam 24 1.2 Khái quát bệnh tiểu đường .26 1.3 Khái quát vai trò enzyme α-glucosidase enzyme α-amylase 28 1.3.1 Khái niệm enzyme 28 1.3.2 Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1) 28 1.3.3 Enzyme α-glucosidase (EC 3.2.1.20) 29 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31 2.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.1.1 Loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Sm 31 2.1.2 Loài Gymnema latifolium Wall ex Wight 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu .32 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất 32 2.2.1.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 32 2.2.1.2 Sắc ký cột (CC) 32 2.2.1.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 32 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc 32 2.2.2.1 Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) 32 2.2.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 32 2.2.2.3 Độ quay cực 33 2.2.2.4 Phương pháp xác định đường 33 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 34 iv 2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -glucosidase 34 2.2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -amylase 35 2.3 Phân lập hợp chất 36 2.3.1 Các hợp chất phân lập từ loài G sylvestre 36 2.3.2 Các hợp chất phân lập từ loài G latifolium 39 2.4 Thông số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập 42 2.4.1 Các thơng số vật lí hợp chất phân lập từ loài G sylvestre 42 2.4.1.1 Hợp chất GS1: gymsyloside A (hợp chất mới) 42 2.4.1.2 Hợp chất GS2: gymsyloside B (hợp chất mới) 42 2.4.1.3 Hợp chất GS3: gymsyloside C (hợp chất mới) 42 2.4.1.4 Hợp chất GS4: gymsyloside D (hợp chất mới) 42 2.4.1.5 Hợp chất GS5:gymsyloside E (hợp chất mới) 42 2.4.1.6 Hợp chất GS6: gymnepregoside R (hợp chất mới) 43 2.4.1.7 Hợp chất GS7: gymnepregoside T (hợp chất mới) 43 2.4.1.8 Hợp chất GS8: vetircilloside M 43 2.4.1.9 Hợp chất GS9: verticilloside D 43 2.4.1.10 Hợp chất GS10: gymnepregoside F 43 2.4.1.11 Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F 44 2.4.1.12 Hợp chất GS12: stephanoside I 44 2.4.1.13 Hợp chất GS13:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester 44 2.4.1.14 Hợp chất GS14: gymnemoside-W1 44 2.4.1.15 Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester 44 2.4.1.16 Hợp chất GS16: alternoside XIX 45 2.4.2 Các thông số vật lí hợp chất phân lập từ loài G latifolium 45 2.4.2.1 Hợp chất GL1: gymlatifoside A (hợp chất mới) 45 2.4.2.2 Hợp chất GL2: gymlatifoside B (hợp chất mới) 45 2.4.2.3 Hợp chất GL3: gymlatifoside C (hợp chất mới) 45 2.4.2.4 Hợp chất GL4: gymlatifoside D (hợp chất mới) 45 2.4.2.5 Hợp chất GL5: verticilloside J 46 2.4.2.6 Hợp chất GL6: lucyoside H 46 2.4.2.7 Hợp chất GL7: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (xem hợp chất GS13) 46 2.4.2.8 Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester 46 2.5 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập .46 2.5.1 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase hợp chất 46 2.5.2 Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase hợp chất 47 CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 49 v 3.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 49 3.1.1 Một số đặc điểm chung hợp chất pregnane glycoside phân lập 50 3.1.1.1 Đặc điểm phổ 1H NMR hợp chất pregnane glycoside phân lập từ G latifolium G sylvestre 51 3.1.1.2 Đặc điểm phổ 13C NMR hợp chất pregnane glycoside phân lập từ G latifolium G sylvestre 52 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài G sylvestre 53 3.1.2.1 Hợp chất GS1: gymsyloside A 53 3.1.2.2 Hợp chất GS2: gymsyloside B 62 3.1.2.3 Hợp chất GS3: gymsyloside C 64 3.1.2.4 Hợp chất GS4: gymsyloside D 66 3.1.2.5 Hợp chất GS5: gymsyloside E 68 3.1.2.6 Hợp chất GS6: gymnepregoside R 70 3.1.2.7 Hợp chất GS7: gymnepregoside T 73 3.1.2.8 Hợp chất GS8: Vetircilloside M 75 3.1.2.9 Hợp chất GS9: verticilloside D 77 3.1.2.10 Hợp chất GS10: gymnepregoside F 79 3.1.2.11 Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F 81 3.1.2.12 Hợp chất GS12: stephanoside I 83 3.1.2.13 Hợp chất GS13: 3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester 84 3.1.2.14 Hợp chất GS14: gymnemoside-W1 87 3.1.2.15 Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester 89 3.1.2.16 Hợp chất GS16: alternoside XIX 91 3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài G latifolium 93 3.1.3.1 Hợp chất GL1: gymlatifoside A 93 3.1.3.2 Hợp chất GL2: gymlatifoside B 95 3.1.3.3 Hợp chất GL3: gymlatifoside C 98 3.1.3.4 Hợp chất GL4: gymlatifoside D 100 3.1.3.5 Hợp chất GL5: verticilloside J 102 3.1.3.6 Hợp chất GL6: lucyoside H 104 3.1.3.7 Hợp chất GL7:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester 106 3.1.3.8 Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester 106 3.2 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập .108 3.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase hợp chất 108 3.2.2 .Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase hợp chất 110 KẾT LUẬN 112 vi NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 114 KIẾN NGHỊ 115 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 116 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13 C NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 spectroscopy H NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton spectroscopy 2-NBDG 2-Deoxy-2-[ (7-nitro-2,1,3benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose 3T3-L1 ABTS All 2-Deoxy-2-[ (7-nitro-2,1,3benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose Tế bào mô mỡ 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid 6-sulfonic acid 6-Deoxy-3-oxymethylallopyranose Đường 6-deoxy-3oxymethylallopyranose ALP Alkaline phosphatase Enzymme alkaline phosphatase ALT Alanine aminotransferase Enzymme alanine aminotransferase BHT Butylated hydroxytoluene Butylated hydroxytoluene C.C Chromatography column Sắc ký cột Can Canaropyranose Đường canaropyranose Correlation spectroscopy Phổ COSY Cym Cymaropyranose Đường cymanopyranose DEPT Distortionless enhancement by Phổ DEPT COSY polarization transfer DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Glucose Đường glucose High density lipoprotein cholesterol Lipoprotein mật độ cao Glc HDL HL7702 HMBC Tế bào gan người Heteronuclear mutiple bond correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HPLC High pressure liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear singlequantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết correlation IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm LDH Lactate dehydrogenase Enzyme lactate dehydrogenase viii LDL Low density lipoprotein lipoprotein mật độ thấp MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide diphenyltetrazolium bromide ROESY Rotating frame Overhause Effect Phổ ROESY Spectroscopy OD Optical density Mật độ quang Ole Oleandropyranose Đường oleandropyranose 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside pNPG TBARS Thiobarbituric acid reactive substances Các chất phản ứng với axit thiobarbituric TGs Triglyceride Triglyceride Thv Thevetopyranose Đường thevetopyranose TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TLTK VLDL Tài liệu tham khảo Very low density lipoprotein Lipoprotein mật độ thấp 89 20.3 Phổ 13C NMR hợp chất GL4 20.4 Phổ HSQC hợp chất GL4 90 20.5 Phổ HMBC hợp chất GL4 20.6 Phổ COSY hợp chất GL4 91 20.7 Phổ ROESY hợp chất GL4 92 21 Phụ lục phổ hợp chất GL5 Verticilloside J CTPT: C53H88O22 KLPT: 1104 - Phổ 1H NMR - Phổ 13C NMR - Phổ HSQC - Phổ HMBC 93 21.1 Phổ 1H NMR hợp chất GL5 21.2 Phổ 13C NMR hợp chất GL5 94 21.3 Phổ HSQC hợp chất GL5 21.4 Phổ HMBC hợp chất GL5 95 22 Phụ lục phổ hợp chất GL6 Lucyoside H CTPT: C42H68O13 KLPT: 780 - Phổ 1H NMR - Phổ 13C NMR - Phổ HSQC - Phổ HMBC 96 22.1 Phổ 1H NMR hợp chất GL6 22.2 Phổ 13C NMR hợp chất GL6 97 22.3 Phổ HSQC hợp chất GL6 22.4 Phổ HMBC hợp chất GL6 98 23 Phụ lục phổ hợp chất GL7 3β-O-β-D-Glucopyranosyl (1 →6)-β-D-glucopyranosyl axit oleanolic 28-O-β-Dglucopyranosyl ester CTPT: C48H78O18 KLPT: 942 - Phổ 1H NMR - Phổ 13C NMR - Phổ HSQC - Phổ HMBC 99 23.1 Phổ 1H NMR hợp chất GL7 23.2 Phổ 13C NMR hợp chất GL7 100 23.3 Phổ HSQC hợp chất GL7 23.4 Phổ HMBC hợp chất GL7 101 24 Phụ lục phổ hợp chất GL8 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-β-Dglucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl ester CTPT: C54H88O23 KLPT: 1104 - Phổ 1H NMR - Phổ 13C NMR - Phổ HSQC - Phổ HMBC 102 24.1 Phổ 1H NMR hợp chất GL8 24.2 Phổ 13C NMR hợp chất GL8 103 24.3 Phổ HSQC hợp chất GL8 24.4 Phổ HMBC hợp chất GL8 ...  -AMYLASE C? ?A LỒI DÂY TH? ?A CANH - Gymnema sylvestre (RETZ. ) R. BR EX SM VÀ DÂY TH? ?A CANH LÁ TO - Gymnema latifolium WALL EX WIGHT Chuyên ngành: Mã số: H? ?a Hữu Cơ 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ H? ?A HỌC... javanicum Koord Java 46 G sylvestre (Retz) .R. Br ex Sm 21 G Maharashtra khandalense Santapau 22 G Ấn Độ kollimalayanum A. Ram ach & M.B.Viswan 23 G lacei Craib Myanma, Bangladesh 24 G lactiferum... lồi dây th? ?a canh - Gymnema sylvestre (Retz. ) R. Br ex Sm dây th? ?a canh to - Gymnema latifolium Wall ex Wight? ?? Mục tiêu luận án: Mục tiêu luận án xác định thành phần h? ?a học chủ yếu thân hai loài