Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài stephania SP 1, menispermaceae

Trang 1

LUONG NGOC CHI

NGHIEN CUU DAC DIEM THUC VAT, THANH PHAN HOA HOC, TAC DUNG UC

CHE ACETYLCHOLINESTERASE CUA LOAI STEPHANIA SP.1,

MENISPERMACEAE

KHOA LUAN TOT NGHIEP DUOC Si

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯƠNG NGỌC CHI

NGHIEN CUU DAC DIEM THUC VAT, THANH PHAN HOA HOC, TAC DUNG UC

Trang 3

cô và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn 7S Đỗ Quyên, người đã hết lòng tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn tôi trong thời

gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới 7S Nguyễn Quốc Huy, người đã hướng dẫn tôi, cho tôi những lời khuyên, những lời chỉ bảo chân thành, đề tơi hồn

thành tốt khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu và bộ môn Thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tồn thể thầy cơ giáo và cán bộ trong

trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ và mang lại cho tôi những

kiến thức cùng kinh nghiệm quý báu trong suốt 5 năm học vừa qua

Tôi xin trân trọng cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo và các phòng ban khác

trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt

chương trình học tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn và sự yêu thương tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên và là chỗ dựa tinh thần cho tôi những lúc khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sông

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2011 Sinh viên

Trang 4

1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 2.1 2.1.1 2.1.2 LOI CAM ON

DANH MUC CHU VIET TAT

DANH MUC BANG, DANH MUC HINH DAT VAN DE CHUONG 1 - TONG QUAN Thue vat Vi tri phan loai Đặc điểm thực vật

Phan bé6 chi Stephania Lour

Nghién ciru thanh phan héa hoc cia mét sé loai thudc chi Stephania Lour Nhóm alcaloid Nhóm flavonoid Tác dụng sinh học CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trang 5

2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.2.1 2.3.2.2 2.3.2.3 2.3.3 2.3.3.1 2.3.3.2 2.3.3.3 3.1 3.1.1 3.1.1.1 3.1.1.2 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.4.1 3.1.4.2 3.1.5 3.1.5.1 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu về thực vật Nghiên cứu về hóa học Định tính alcaloid Chiết xuất Phân lập Thử tac dung trc ché enzyme acetylcholinesterase Nguyên tắc Đối tượng Cách tiến hành CHUONG 3 - THUC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUẬN Thực nghiệm và kết qua Mô tả thực vật

Mô tả đặc điểm thực vật loài S/ephania sp.1 thu hái ở Hòa Bình Đặc điểm bột củ của loài S/ephania sp l

Định tính nhóm chất alcaloid của 4 loài thuộc chỉ Sfephamia Lour

Hàm lượng căn dịch chiết MeOH toàn phần và alcaloid toàn phần Tác dụng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)

Tác dụng ức ché AChE của dịch chiết MeOH toàn phan

Tác dụng ức chế AChE của dịch chiết alcaloid toàn phân

Trang 6

3.1.5.2.3 3.1.5.2.4 3.1.5.2.5 3.1.5.3 3.1.5.3.1 3.1.5.3.2 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3

Khảo sát tác dụng ức chế AChE của 5 phân đoạn từ FRI => FR5 Phân lập phân đoạn FR1 bằng sắc ký cột nhanh

Trang 7

AChE ATCI DTNB EI- MS !H- NMR MeOH NXB STT TS TT VLC Acetylcholinesterase Acetylthiocholine 1odide doublet acid 5,5’-dithio-(2-nitrobenzoic)

Trang 8

Bang 1.1 | Phan b6 cdc loai thudc chi Stephania Lour 6 mét s6 nuéc chau A 4

Bang 2.1 | Các dung dịch sur dung cho phan tng tao mau Ellman 18

Bảng 3.1 | Kết qủa định tính alcaloid 4 loai Stephania Lour 23 Bảng 3.2 | Hàm lượng căn methanol toàn phân của 4 loài Sfephamia (%) 24

Bảng 3.3 | Hàm lượng alcaloid toàn phân của 4 loài $/ephania (%) 24

Bảng 34 | Tác dụng ức chê AChE của dịch chiết MeOH của 4 loài S/ephamia 25 Bảng 3.5 | Tác dụng ức chê AChE của dịch chiết alcaloid ctia 4 loai Stephania | 26

Bảng 3.6 | Kết quả thử ức chê AChE của các phân đoạn FRI=>ER5 ở nông đội 30 100ug/ml

Bảng 3.7 | Số liệu phô 'H-NMR của FR1.2 đo trong CDC1; 500MHz 34

Trang 9

Hinh 1.1 Khung câu trúc cơ bản của 12 nhóm alcaloid 7

Hình 1.2 Câu trúc của Stephaflavon A và Stephaflavon B 8

Hình 1.3 | Câu trúc của 3 chất Kaemferin, Juglanin, Quercetin 8

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái thân, lá và củ loài S/ephania sp 1 21

Hình 3.2 Đặc điêm hoa đực loài Sephania sp l 22

Hình 3.3 Đặc điểm bột củ loài S/ephania sp l 22

Hình 3.4 | Sắc ký đơ alcaloid tồn phân lồi S$ephania sp.1 khi đùng hệ đung 28

môi Cloroform : Methanol

Hình 3.5 Sắc ký d6 cdc phan doan alcaloid cua loai Stephania sp.1 tr FRI =>| 29 FR5

Hình 3.6 | Sắc ký đô chất ERI.2 ở 2 hệ dung môi khác nhau 32 Hình 3.7 | Sắc ký đô chất FR3.1 ở 2 hệ dung môi khác nhau 32 Hình 3.8 | Pho ‘H-NMR cua FR1.2 ving trudng thap (6.5 + 7.0 ppm) 33

Hinh 3.9 Phô 'H-NMR của FR1.2 vùng trường cao (4.3 + 2.7 ppm) 33 Hình 3.10 | Công thức câu tạo của L-tetrahydropalmatin 35 Hình 3.11 | Công thức câu tạo của Oxostephanin và Oxoputerin 35

Trang 10

DAT VAN DE

Trong hé thuc vat, chi Stephania Lour dugce biết đến là một trong những chỉ lớn nhất của họ Menispermaceae (họ Tiết đê) Đây là một chi khá đa dạng về số loài cũng

như hệ sinh thái Trên thế giới và ở Việt Nam, đã có rất nhiều nghiên cứu sâu về các loài của chỉ Sfephania Lour., bao gồm cả nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh học Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây thường tập trung theo hướng nghiên cứu tác dụng an thần gây ngủ do kinh nghiệm sử dụng dân gian một số loài thuộc chi này là chữa mất ngủ Từ những năm cuối của thế kỉ 20 trở lại đây, các hướng nghiên cứu về các tác dụng sinh học khác mới được đi sâu, trong đó có một hướng nghiên cứu mới là tác dụng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) Acetylcholinesterase là một enzym có chức năng làm ngưng lại hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine tại các synap thần kinh cholinergic do phản ứng thủy phân cơ chất, do đó nó có tác dụng duy trì các hoạt động của hệ thần kinh ở mức bình thường Tuy nhiên, trong một số trường hợp bệnh lý như Alzheimer, Parkinson nồng độ acetylcholine lại giảm, do đó các thuốc có tác dụng ức chế acetylcholinesterase sẽ giúp duy trì nồng độ ốn định của acetylcholine Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, một số loài thuộc chỉ Sfephamia Lour có khả năng ức chế mạnh enzyme acetylcholinesterase, do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế acetylcholinesterase cua loai Stephania sp.1, Menispermaceae” voi 3 nội dung nghiên cứu chính:

¬ Mơ tả đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu Bình véi (Stephania sp.1) thu hai 6 Kim Boi, Hoa Bình

- Thử tác dụng tec ché AChE cia lodi Stephania sp.1, so sdnh với tác dụng ức chế của một số loài khác thuộc chỉ Stephania Lour

Trang 11

CHUONG 1 - TONG QUAN

1.1 Thực vật

1.1.1 Vi tri phân loại

Chi Stephania Lour dugc xép vao ho Tiét dé (Menispermaceae) [1], [2], [6], [20], [39] Theo hé thong phan loai cua Takhtajan (1997), ho Tiét dé (Menispermaceae)

thuộc bộ Hoàng Liên (Ranunculales), liên bộ Hoàng Liên (Ranunculanae), phân lớp Hoàng Liên (Ranunculidae), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [34]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Chi Stephania được mô tả đầu tiên bởi Loureiro trong Flora Cochinchinensis

vào năm 1790 voi 2 loai Stephania rotunda Lour va Stephania longa Lour.[16], [20], cho dén nay đã có thêm nhiều loài thuộc chi Stephania Lour dugc tim thay và mơ tả Các lồi thuộc chi Sephamia Lour có đặc điểm chung như sau [1], [3], [5], [8], [13],

[20]:

Dây leo sống lâu năm hoặc hàng năm, hầu hết mảnh khánh Thân gỗ hay thân cỏ

Ré dạng sợi hoặc phình to thành rễ củ Rễ củ đa dạng về hình thái, kích thước, màu sắc

Rễ củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hay hình dạng bất định Màu sắc vỏ củ thay đổi tùy từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống.Thịt củ nạc hoặc có

lẫn văn xơ, màu trăng ngà, vàng tươi, vàng nhạt, hoặc đỏ nâu, đỏ tươi tùy theo loài

Lá mọc cách Cuống lá thường mảnh, hai đầu phình lên, có khi gấp khúc ở gốc

Trang 12

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa thường mọc từ kẽ lá hay trên thân cây già không lá, thường có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù, có cuỗng, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm, ít nhất ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuối

cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi có xim tụ họp thành đầu hình đĩa Hoa đực thường

có cầu tạo đối xứng tỏa tròn ; đài 6-8 rời, xếp thành 2 vòng, bằng nhau hoặc không bằng nhau, đài thường có hình trái xoan ngược Cánh hoa rời nhau, 3 hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập vào trong, màu vàng hay trắng xanh Nhị hợp thành một tru, bao phan dính nhau thành hình đĩa với 4-8 ô nứt ngang Hoa cái đối xứng hay bất đối xứng, 1-8 lá đài, 2-4 cánh hoa, bầu hình trứng, lá noãn 2 nhưng chỉ 1 lá noãn phát

triển thành hạt, 1 lá noãn bị thoái hóa, vòi rất ngan hoặc không có, núm nhụy tử 4-6

chia thùy ngăn hoặc rách, choãi ra hình dùi

Quả hạch, hình gần tròn, hình trứng hoặc trứng ngược, trứng bâu, 2 bên đẹt Quả trưởng thành cuống lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy Quả chín màu vàng đậm hay đỏ tươi nhẫn bóng Hạt hình móng ngựa, trứng dẹt hoặc hơi tròn, lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2-4 dãy dọc bướu hay những gờ ngang Giá noãn có lỗ thủng hoặc không Đặc điểm hình thái hạt đặc trưng cho từng loài, là dấu hiệu quan trọng để giám định tên loài Cây mầm có lá mâm ít nhiều bằng rễ mâm, bao quanh bởi nội nhũ

1.1.3 Phân bố chỉ S/ephania Lour

Trên thế giới, chỉ Sephania Lour chủ yếu phân bố ở vùng nhiệt đới, Á nhiệt đới

ở các nước châu Á [11], [20] nhu: Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Việt Nam, Lào,

Campuchia, Philippin, Ấn Độ, Nhật Bản , một số loài phân bố ở Châu Phi và Châu

Uc

Bang 1.1 trình bày sự phân bố các loài thuộc chỉ Sfephania Lour ở một số nước

châu Á như Trung Quéc[20], Đài Loan[17], Việt Nam[1], [10], Lao[27], Thai Lan[18]

Trang 14

Cho đến nay đã thơng kê được 54 lồi Sfephania Lour ở 6 nước châu Á Trong

đó, Trung Quốc có 37 loài [20], Đài Loan có 6 loài [17], Việt Nam có 17 loài [10], Lào có 2 loài [27], Thái Lan có 15 loài [18] và Singapore có 2 loài [26] Loài S japonica

Trang 15

glabra, S pierrei, S tetrandra phan bỗ ở 3 nuéc khadc nhau trong khu vuc Loai S

cephalantha va S glabra phan bố ở Trung Quốc, Đài Loan, Việt Nam là nơi có vĩ độ cao hơn trong khi một số loài như S$ capitata, S pierrei, S venosa phan bỗ ở các nước

Thái Lan, Singapore hay miền nam Việt Nam là những nơi có vĩ độ thấp hơn, chứng tỏ

có những đặc điểm chung nhất định về hệ sinh thái của mỗi loài thuộc chỉ $/epharia

Lour

Ở Việt Nam, các loài chỉ Sfephania Lour phân bố ở nhiều vùng khác nhau với

diện tích phân bố rộng, trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam[1 1] Các loài bình vôi thường mọc hoang ở một số núi đá vôi, núi đất, núi đất lẫn đá, ở đồng bằng, ven biến, có loài

mọc ngay trên bãi cát hoặc gò hoang vùng ven biển{ 1 1] Ở Việt Nam có 4 loài giỗng 4 loai 6 Thai Lan 1a S glabra, S hernandifolia, S japonica va S venosa Cả 4 loài này

đều phân bố ở miền nam nước ta[10], phù hợp với điều kiện sinh thái ở Thái Lan Trong khi đó, 9 loài ở Việt Nam cũng xuất hiện ở Trung Quốc là S đielsiana, S

glabra, S hernandifolia, S japonica, S pierrei, S sinica, S tetrandra, S viridiflavens va S venosa, phan lén cdc loai nay phan bé & phia bac Viét Nam[10]

1.2 Nghiên cứu thành phan héa hoc cua mét sé loai thuéc chi Stephania Lour

Thanh phan hóa hoc cua cac loai thudc chi Stephania Lour trén thé gidi va 0 Việt Nam đều có alcaloid, flavonoid và một số chất khác như tinh bột, đường, acid hữu

cơ , trong đó alcaloid là thành phần chính [10], [23]

1.2.1 Nhóm alcaloid

Theo tong kết về alcaloid của họ Menispermaceae (2000) [23], alcaloid cua chi

Sfephamia Lour được phân lập từ 45 loài, bao gồm 673 alcaloid thuộc 12 nhóm khác nhau: Benzylisoquinolin, Bisbenzylisoquinolin, Proaporphin, Aporphin, Protoberberin,

Morphinan, Hasubanan, Stephaoxocan, Eribidin, Phenanthren, dẫn chất của acid

Trang 16

đến nay đã xác định được 188 chất, nhóm Bisbenzylisoquinolin có 171 chất, và nhóm

Protoberberin có 112 chất Ba nhóm này là nhóm chiêm nhiều alcaloid nhất với 471

chất Hình 1.1 trình bày khung câu trúc cơ bản của 12 nhóm alcaloid \ YN UN ⁄ ¬ ] 2 a S Ro N S1 we A ` NS NA Rio 3 5 6 | O s cre O 9 10 11 12 Hình 1.1: Khung câu trúc cơ bản của 12 nhóm alcaloid a a A C

Trong do: 1-Benzylisoquinolin, 2-Bisbenzylisoquinolin, 3-Aporphin, 4-Proaporphin, 5-

Trang 17

1.2.2 Nhom Flavonoid

Thực tế, nhóm flavonoid khéng phải là nhóm chất chuyển hóa bậc hai chính

được các nhà khoa học quan tâm khi nghiên cứu thành phân hóa học của các loài thuộc

chi Stephania Lour Tuy nhién, nam 2001, Duanyun va cong su [33] da phan lap dugc 2 biflavonoid tu loai S tetrandra la stephaflavon A va stephaflavon B (hinh 1.2)

OCH,

Hình 1.2: Câu trúc của Stephaflavon A (R = CH:) và Stephaflavon B (R = H)

Năm 2009, Nguyễn Quốc Huy và cộng sự [10] đã phân lập được 3 flavonoid thuộc nhóm flavon từ loài S brachyandra \a: kaempferin, juglanin, quercetin (hinh 1.3)

OH O

Hình 1.3: Câu trúc của 3 chất Kaempferin, Juglanin, Quercetin Trong đó: Kaempferin (R¡ = ơ-L-Rhamnopyranosid, R;= H)

Trang 18

1.3 Tác dụng sinh hoc

Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của chi S/ephania Lour thường tập trung lên tác dụng trên thân kinh trung ương Các nghiên cứu này xuất phát từ kinh nghiệm sử dụng dân gian của người dân, dùng rễ củ một số loài thuộc chi Sfephania Lour

(Bình vôi) để an thần, gây ngủ[5], [8], [11], [13]

- Tác dụng lên thân kinh trung ương

+ Tác dụng an thần gây ngủ: tác dụng này chủ yếu do tetrehydropalmatin gây ra Một số nghiên cứu i vivo đã chứng minh tác dụng này của L-tetrahydropalmatin

Dương Hữu Lợi [12] tiêm cho chuột nhắt trăng 0,1 ml dung dich L-tetrehydropalmatin

ở nồng độ 0,5%, 1%, 2% đều làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh trong vòng 3-5 giờ Nguyễn Tiến Vững [l4] đã thử tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của L- tetrahydropalmatin trên chuột nhắt trăng với liều 40mg/kg thể trọng chuột, kết quả đã làm tăng thời gian ngủ của chuột lên 8 lần

+ Tác dụng giảm đau: Nguyễn Quốc Huy [10] đã tiến hành thử tác dụng giảm

đau của dịch chiết từ rễ củ của loài $ đielsiana lên chuột theo mô hình của Koster, kết

quả cho thấy với liều 5g dược liệu/kg làm giảm rõ rệt số cơn quặn đau sau 10, 15, 20, 25 và 30 phút

- Tác dụng chéng viêm: Nguyễn Quốc Huy [10] tiến hành thử tác dụng chong viêm cấp của dịch chiết từ rễ củ của loài Š đielsiana trên chuột theo mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin Kết quả cho thấy dịch chiết dược liệu có tác dụng giảm phù viêm chân chuột với liều 1,5g và 3g được liệu/kg thể trọng chuột Tác dụng chống

viêm của các loài thuộc chi Stephania Lour cing dugc Hu S., Merayo L va cộng sự

[21] chứng minh với tác đụng ức chế quá trình viêm kết mạc gây ra bởi tetrandrin trên

mô hình viêm kết mạc di ứng ở chuột

- Tác dụng chỗng ung thư: Tác dụng này được gây ra bởi cepharanthin [19] và

Trang 19

- Ngoài ra, một số chất phân lập được từ các loài thuộc chi S/ephamia Lour có tác

dụng ức chế sự nhân lên của virus HIV (Cepharanthin phân lập tir loai S cepharantha)|[29]; kích thích hệ thần kinh trung ương, giãn mạch, hạ huyết áp

(Roemerin)[12]; tác dụng trên tim do đôi kháng calci chọn lọc trên mạch máu và ức

chế bơm Na”_K†_ATPase (Cycleanin)[31], chống loạn nhịp tim (Crebanin)[37]; ức chế

dopamin D2 làm giảm triệu chứng bệnh Parkinson (Stepholidin)[15], một số alcaloid thuộc nhóm isoquinolin có tác dụng kháng khuẩn, kháng nẫm[35]

- Trong đó, đác dụng ức chế enzyme acetylcholinesterase của các loài thuộc chỉ Sfephania Lour bắt đầu được nghiên cứu nhiều hơn trên ¿: viro trong những năm gần đây (từ năm 1997)

Cho đến nay, các nghiên cứu ¿: viro về khả năng ức chế acetylcholinesterase

[9], [22], [24], [25], [28], [30], [38] duoc thuc hién trén 5 loai thudc chi Stephania Lour 1a: S tetrandra, S suberosa, S venosa, S sinica va S rotunda

Trong đó, có nghiên cứu của Kornkanok và cộng sự (2003) [25], Đỗ Quyên va cộng sự [9] được tiến hành thử tác dụng ức chế AChE theo nguyên tắc Ellman trên dịch chiết MeOH băng phương pháp đo quang và sắc ký lớp mỏng Theo Kornkanok[25], dich chiét methanol (nồng độ 0,1mg/ml) từ rễ của loài Stephania suberosa có hoạt tính ức chế AChE cao (91,93% + 10,80 %) và trên sắc ký lớp mỏng có nhiều hơn 2 vết ức chế AChE có dương tính với thuốc thử Dragendorff Đỗ Quyên

và cộng sự [9] tiến hành thử tác dụng ức chế AChE trên dịch chiết MeOH (nơng độ 0,1

mg/ml) của lồi Sephania sinica cho hoạt tính ức chế AChE là 85%

Các nghiên cứu trên các chất tỉnh khiết được thực hiện bởi Ogino và cộng sự (1997) [28] và Kornkanok và cộng sự (2006) [24] Ogino đã chứng minh khả năng ức

chế AChE của các alcaloid nhóm bisbenzylisoquinoline từ rễ loài S tetrandra Theo Kornkanok (2006) [24], 3 alcaloid duoc phan lap tu S venosa 1a stepharanine, cyclanoline và N-methyl stepholidine thể hiện khả năng ức chế AChE với giá trị ICso là

Trang 20

Nghiên cứu của Trần Mạnh Hùng và cộng sự (2010) [22] thực hiện trên dịch

chiết cồn và các alcaloid phân lập từ rễ S rotunda, cho thay tac dung tc ché AChE đáng kê khi sử dụng enzyme AChE từ não chuột

Dựa trên kết quả nghiên cứu uc chế AChE ban đầu của một số loài thuộc chi

Stephania Lour., cùng với sự đa dạng về số loài ở Việt Nam cũng như thành phần hóa

học của chi này (đặc biệt nhóm chất alcaloid), chúng tôi tiễn hành thu mẫu Stephnia

Lour ở các vùng sinh thái khác nhau, sau đó tiến hành thử tác dụng ức chế AChE của

các mẫu này nhằm tìm ra các loài có hoạt độ ức chế AChE mạnh, có tiềm năng để từ

đó chúng tôi nghiên cứu thành phần hóa học, cụ thể là chiết xuất, chiết phân đoạn,

Trang 21

CHUONG 2 - NGUYEN LIEU, THIET BI, NOI DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Nguyên liệu:

vx Mẫu 1: Stephania sp.1, thu hái ở huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình trong thời gian từ

12/2010 đến tháng 01/2011, bộ phận thu hái bao gom cu, than leo, 14 va hoa duc,

mã tiêu bản HNIP/17795/11, người giám định mẫu nghiên cứu là TS Nguyễn Quốc

Huy (Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội)

v Mẫu 2: Stephania đielsiana thu hái ở Vườn quốc gia Ba Vì, Hà Nội vào tháng

4/2007, bộ phận thu hái là củ Mẫu do TS Nguyễn Quốc Huy, bộ môn Thực vật,

trường ĐH Dược Hà Nội cung cấp với mã số tiêu bản HNIP/15363/08

v Mẫu 3: Sfephamia giabra, thu hái ở huyện Mỹ Đức, Hà Nội vào tháng 10/2010, bộ

phận thu hái là củ Mẫu do TS Nguyễn Quốc Huy, bộ môn Thực vật, trường ĐH

Dược Hà Nội cung cấp với mã số tiêu bản là HNIP/17794/11

v Mẫu 4: S hernandifolia thu hai ở Vườn thực vật, tường Đại học Dược Hà Nội, vào

tháng 9/2010, bộ phận thu hái là thân hóa gỗ, mã tiêu bản HNIP/17796/11 người giám định mẫu là TS Nguyễn Quốc Huy

- Xử lý mẫu: Mẫu củ thu được đem rửa sạch, cạo vỏ, thái lát mỏng rồi sây khô & 60°C,

bảo quản nơi khơ ráo thống mát Các mẫu củ thu được sau khi sơ chế được nghiền thành bột

2.1.2 Hóa chất

Trang 22

thử sắc ký lớp mỏng: TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT Mayer, acid picric, bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silicagel GFzz„ — Merck, Silicagel đường kính 60um của Merck - Dùng cho thử tác dụng ức chế AChE: dém phosphate pH 7.6 (pha theo DDVN

IV - Phụ lục 2); enzym acetylcholinesterase (AChE), acetylthiocholine 1odide (ATCD,

acid 5,5’-Dithiobis-(2-nitrobenzoic) (DTNB) do hang Sigma cung cấp (St Luis, MO, USA), Chat chudn Galanthamine do hang Janssen-Cilag SpA (Italia) cung cấp

2.1.3 Thiét bi

Các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng tại bộ môn Dược liệu và bộ môn Thực vật, trường đại học Dược Hà Nội, bao gồm:

- Dùng cho mô tả đặc điểm thực vật: Kính lúp soi nổi Leica EZ4, Kính hiển vi Kruss

- Dùng cho chiết xuất, định tính và phân lập: bộ chiết Soxhlet và chiết hồi lưu dung

môi, máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI waterbath B480- Đức, máy xác định độ

4m Precisa PH60, tu sây Memmert, can phan tích Presica XB-220, đèn tử ngoại, máy

cham sắc ký lớp mỏng chuyên dụng, bơm hút chân không, phễu thủy tỉnh xốp đường kính 7cm và cột thủy tinh đường kính 2cm

- Dùng cho thử ức chế AChE: máy quang ph6é UV-VIS Spectrophotometer Cary 1E 2.2 Nội dung nghiên cứu

- M6 tả đặc điểm thực vật, mô tá đặc điểm bột củ của loài Sfephamia sp.1 thu hái ở

Hòa Bình

- Dinh tinh alcaloid 4 mau S/ephania Lour thu được

- _ Chiết dịch chiết methanol toàn phần và alcaloid toàn phần

- _ Thử tác dụng ức chế AChE của dịch chiết từ 4 mẫu Sfephania Lour

Trang 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

- _ Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của lồi Bình vơi thu hái ở Hòa

Bình

- _ Xác định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, đặc điểm bộ phận sinh sản có sử dụng kính hiển vi soi nổi Leica tại bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, so sánh với các tài liệu phân loại thực vật

- - Mô tả đặc điểm bột củ: quan sát các đặc điểm bột và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi Kruss tại bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

2.3.2.1 Định tính alcaloid

- Định tính alcaloid bằng phản ứng hóa học: lẫy 3g bột được liệu thẫm âm bang amoniac 6N trong bình nón có nút mài, cho thêm 10ml] cloroform lắc nhiều lần, gạn lẫy lớp dịch chiết cloroform đem lắc với 5 ml acid H;SOu 5%, gạn lây lớp nước - acid rồi chia dịch chiết acid vào 4 ống nghiệm:

*x Ông 1: Nhỏ 2-— 3 giọt thuốc thử Mayer VY Ong 2: Nhỏ 2 — 3 giọt thuốc thử Dragendorff *x Ông 3: Nhỏ 2 — 3 giọt thuốc thử Bouchardat *x Ông 4: Nhỏ 2 — 3 giọt acid picric

Phản ứng đương tính khi ống 1: có kết tủa màu trắng: ống 2: có kết tủa màu cam; ống 3:

có kết tủa màu nâu đỏ, ống 4: có kết tủa vàng

- Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp móng:

vx Chuẩn bị dịch chiết: Cân khoảng 5g bột dược liệu thấm âm băng amoniac 6N

trong bình nón có nút mài, cho thêm 10ml cloroform lắc nhiều lần, gạn lẫy lớp

dịch chiết cloroform dem lac voi 5 ml acid H,SO, 5%, gan lay l6p nude — acid,

Trang 24

Y Pha tinh: Ban mong silicagel GF)5, tráng sẵn của Merck Hoat héa & 110°C/1h, để nguội, bảo quản trong bình hút âm

*x Quan sát: đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 366nm, thuốc thử Dragendorff

2.3.2.2 Chiết xuất

- Dịch chiết MeOH: bột dược liệu, chiết hồi lưu với MeOH 80% trong 5h Dịch

chiết thu được đem cất thu hồi dưới áp suất giảm đến cắn Bảo quản cắn trong bình hút ”

A am

- Dịch chiết alcaloid toàn phần: bột dược liệu, thắm âm bằng NH,OH 10% trong 2h, chiết bằng soxhlet với dung môi CHC1, dén kiệt (thử bằng thuốc thử Mayer), dich

chiết thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến 1/3 thể tích, lắc với dung dịch acid HCI 0,JN từ 5 — 7 lần Dịch chiết acid thu được sau đó đem kiêm hóa với NHẠOH 10% đến pH 9 — 10 Chiết dịch acid đã kiềm hóa với dung môi CHC]; 3 - 5

lần, gộp dịch chiết dung môi hữu cơ, cất thu hồi dung môi đưới áp suất giảm thu được căn alcaloid toàn phần Bảo quản cắn trong bình hút âm

Hàm lượng cắn dịch chiết methanol toàn phần hoặc hàm lượng căn alcaloid toàn phân (theo phương pháp cân) được tính theo công thức sau:

a x 100%

m (%) =

Mx(iI-h) Trong đó : m (% ) là hàm lượng cắn thu được

a: khối lượng căn (cắn methanol toàn phân hoặc căn alcaloid toàn phan) (g)

M: khối lượng được liệu (g)

Trang 25

2.3.2.3 Phan lap

Đề phân lập các chất, chúng tôi sử dụng các phương pháp cơ bản như sắc ký cột nhanh, sắc ký cột bơm chân không[7], [32] Các phân đoạn được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng

- Sắc ký cột được tiến hành trên cột silicagel pha thường (0,040 — 0,063mm, Merck)

- Sắc ký cột chân không được tiến hành trên phếu lọc thủy tinh xốp Biichner

đường kính 8em, có sử dụng bơm chân không với chất mang là silicagel (0,040 —

0,063mm, Merck)

- Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60G Fys4 (Merck) Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nam và 36ónm hoặc dùng thuốc thử Dragendorff

2.3.3 Thử tác dụng ức chế enzyme acetylcholinesterase

2.3.3.1 Nguyên tắc

Thử tác dụng ức chế AchE bằng phương pháp đo quang dựa trên nguyên tắc của Ellman (1961): co chat acetylthiocholine iodide (ATCI) bi thty phan xtic tác bởi

enzym acetylcholinesterase (AChE) tao thanh Thiocholine va Acid acetic Thiocholine

thu được cho phản ứng với thuốc thử Ellman (acid 5,5?-dithio-(2-nitrobenzoic) (DTNB) tao ra acid 5-thio-2-nitrobenzoic (RS ) có màu vàng, có độ hap thụ cực đại ở bước sóng 420 nm[9][25]

2.3.3.2 Đối tượng

- Dịch chiết MeOH: Cân chính xác 1mg căn dịch chiết MeOH toàn phần 4 loài

Sfephania đã được chuẩn bị như mục chiết xuất (2.3.2.2), hòa tan hoàn toàn trong Iml

Trang 26

- Dịch chiết alcaloid toàn phần: Cân chính xác 1mg căn dịch chiết alcaloid toàn phần 4

loai Stephania đã được chuẩn bị như mục chiết xuất (2.3.2.2), hòa tan hoàn toàn trong

Iml methanol thu được dung dịch có nồng độ lImg/ml Từ dung dịch có nồng độ 1mg/ml pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 250ug/ml, 100ug/ml và 50ug/ml - Dịch chiết phân đoạn: dịch thu được sau khi phân lập alcaloid toàn phân bằng sắc ký cột đem cất thu hồi dung môi thu lấy căn Cắn được làm khô trong bình hút âm chứa silicagel Cân chính xác 1mg cắn, hòa tan trong 1ml methanol thu được dung dịch có nồng độ 1mg/ml, từ đó pha loãng thành các nồng độ 250ug/mIl, 100 ug/ml và 50ug/ml 2.3.3.3 Cách tiến hành

Đề tiến hành thử tác dụng ức chế AChE của dịch chiết được liệu, đầu tiên chúng

tôi chuẩn bị các dung dịch đệm, thuốc thử, enzym, cơ chất, và dịch chiết dược liệu:

- Dung dịch đệm: pha 5 lít dung dịch đệm phosphate (pH 7.6) theo dược điển Việt Nam IV phụ lục 2 [4]

- Enzym: cần chính xác 1mg bột enzym acetylcholinesterase tương ứng với 265

đơn vị (265 U) pha trong 53ml dung dịch đệm phosphate tạo thành dung dịch 5U

AChE/ml, từ dung dịch này pha loãng 20 lần thu được dung dịch enzym nông độ 0,25 U/nil

- Co chat: can 0,1446 g acetylthiocholine iodide (ATCI) pha trong 25ml dung dịch đệm phosphate tạo thành dung dịch có nồng độ 20mM, từ dung dịch đó pha loãng

40 lần thu được dung dịch cơ chất có nồng độ 0,5 mM

- Thuốc thi Ellman: cân 0.1982 g thuốc thir DTNB (acid 5,5’-Dithiobis-(2-

nitrobenzoic) pha trong 25ml dung dịch đệm phosphate tạo thành dung dịch có nồng độ 20 mM, pha loãng dung dịch này 40 lần thu được dung dịch thuốc thử nồng độ 0,5mM

Trang 27

phosphate và dịch chiết được liệu trong methanol với thể tích và nồng độ được trình bày ở bảng 2.1

Thực hiện song song 4 mẫu gồm 2 mau trang va 2 mau thử

- Mẫu trắng có enzym (TR1): mau nay ding để đối chứng với mẫu thử, trong đó không có chất ức chế AChE nên phản ứng tạo màu xảy ra hoàn toàn, mẫu có màu vàng

đậm

- Mẫu trắng không có enzym (TR2): mẫu này dùng đối chứng với mẫu trăng do khi không có enzym thì acetylcholine cũng bị thủy phân một phần

- Mẫu thử có enzym (THI): đối chiếu kết quả đo quang của mẫu này với mẫu

trăng sẽ tính được phần trăm ức chế AChE của dịch chiết được liệu

- Mẫu thử trăng (TH2): mẫu nay dùng để loại sai số cho mẫu thử có enzym do

bản thân một số dịch chiết đã có màu

Sau đó, ủ dịch phản ứng trong 15 phút (ở nhiệt độ thường, 25 °C) Đo độ hấp thụ

đồng thời 4 mẫu cùng một thời điểm, tại bước sóng 420nm Với mỗi nồng độ dịch chiết

dược liệu, tiễn hành 3 lần, hoạt độ ức chế AChE của mỗi mẫu là kết quá trung bình của 3 phép đo

Bảng 2.1: Các dung dịch sử dụng cho phản ứng tạo màu Ellman

Trang 28

CHUONG 3 - THUC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUAN

3.1 Thực nghiệm và kết quả 3.1.1 Mô tả thực vật

3.1.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật loài Sfepharia sp.1 thu hái ở Hòa Bình

Loai Stephania sp.1 moc rai rác trong rừng vùng núi đá vôi âm tại huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình Mùa ra hoa vào khoảng tháng 4-5 Loài này có đặc điểm:

Dây leo nhỏ, mảnh khảnh Thân cây có màu xanh đậm, tồn thân khơng có lơng

Rễ phình to thành rễ củ Rễ củ đa dạng về hình thái, kích thước từ 10 - 20cm Rễ củ

thường có dạng hình câu, hình trứng hay hình dạng bất định Vỏ củ có màu nâu sẫm Thịt củ nạc, có lẫn văn xơ, màu vàng tươi hay vàng nhạt

Lá mọc cách Cuống lá mảnh, đài từ 5 — 7 cm, gấp khúc ở gốc Phiến lá mỏng, nhẫn, hình lọng hay gần tròn Mép lá chia thùy ít, gân lá dạng chân vịt Gốc lá gần tròn hoặc gần hình tim Phiến lá có màu xanh sẵm

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa thường mọc từ kế lá Cụm hoa đực có dạng

xim tán kép, cuỗng cụm hoa đài 4-5 cm, gồm 6 — 8 tán, mỗi tán gồm 5 — 6 hoa, cuỗng hoa dài 3-4 mm, ở gốc có lá bắc nhỏ hình mác Hoa có cầu tạo đối xứng tỏa tròn Đài 6,

rời, xếp thành 2 vòng, mỗi vòng 3 lá đài bằng nhau, đài 1,5 mm; đài có hình trái xoan

ngược, mép lá đài mỏng, gân lá đài dày hơn và có màu xanh nhạt Cánh hoa 3, rời nhau, hình trứng ngược, dày nạc, màu vàng, 2 mép bên cuốn vào trong Nhị hợp thành một trụ, cao khoảng 1-2 mm, bao phấn dính nhau thành hình đĩa với 6 ô nứt ngang (hình 3.2)

Vì trong điều kiện thực nghiệm chưa thu hái được hoa cái và quả nên chưa mô

tả được đặc điểm của hoa cái, quả và hạt, do đó chưa định được tên khoa học của mẫu

nghiên cứu Mẫu được dat 14 Stephania sp.1

Trang 29

Bột củ có màu xám, vị đăng, sau hơi ngọt Soi dưới kinh hién vi thay cdc dic diém: Té

Trang 30

3.1.2 Định tính nhóm chat alcaloid cia 4 loai thudc chi Stephania Lour

Theo các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Sephania Lour trước đây, nhóm alcaloid là nhóm chất chính của chi này, nên chúng tôi tiến hành định tính alcaloid trong 4 mau Stephania thu duoc bang phan tmg hóa học Kết quá định tính alcaloid cua 4 loai Stephania được trình bay 6 bang 3.1

Bang 3.1: Két qua dinh tinh alcaloid 4 loai Stephania Lour TT TT TT

TT Tén khoa hoc Acid picric

Mayer Dragendorff Bouchardat Stephania sp.1 1 +++ +++ +++ +++ (Bình vôi Hoa Binh) 2 | S dielsiana +++ +++ +++ +++ 3 |S glabra +++ +++ +++ +++ 4 | S hernandifolia ++ ++ ++ ++ Ghi chú: +++ Phản ứng dương tính rất rõ + Phản ưng đương tính ++_ Phản ưng dương tính rõ Nhận xét:

Từ kết quá định tính alcaloid bằng phản ứng hóa học 4 loài Sephamia chúng tôi

nhận thấy cả 4 loài nghiên cứu đều có alcaloid, trong đó rễ củ của loài Sfephania sp ], S dielsiana, S glabra cho phản ứng đương tính với thuốc thử alcaloid tạo tủa rất rõ, còn thân của loài $ bernandifolia cho phản ứng dương tính yếu hơn

3.1.3 Hàm lượng cắn dịch chiết MeOH toàn phân và alcaloid toàn phần

Để chuẩn bị cho thử tác dụng ức chế AChE cua 4 loai Stephania, ching tdi tién

hành chiết xuất dịch chiết methanol toàn phần và alcaloid toàn phân

Quy trình chiết dịch methanol toàn phần của 4 loài Sfephwia và công thức tính

Trang 31

khoảng 10 g bột dược liệu Hàm lượng căn dịch chiết methanol toàn phần được trình bảy ở bảng 3.2

Bang 3.2 Hàm lượng cắn methanol toàn phần của 4 loài Sephania (%)

Khôi lượng | Hàm âm | Khôi lượng | Hàm lượng

SIT Tên loài „ „

được liệu (g) (%) can (g) can (%) Stephania sp.1 1 - 10,0362 5,7 1,1856 14,6 (Mau Hoa Binh) 2 |S dielsiana 10,0542 8,2 1,2591 13,6 3 | S glabra 10,1784 7,3 1,2630 13,4 4 |S hernandifolia 10,4368 6,1 1,3636 13,9

Nhận xét: Tr bang 3.2, nhan thay ham lượng căn methanol toàn phần của 4 loài

Stephania không có sự khác biệt nhiều, xấp xỉ 14% tính trên trọng lượng khô tuyệt đối

Từ kết quả định tính alcaloid dương tính của 4 loai Stephania, ching tôi tiễn hành

chiết xuất alcaloid toàn phần của 4 loài này để thử tác dụng ức chế AChE Quy trình

chiết xuất alcaloid toàn phần của 4 loài Š/ephnia được trình bày ở mục 2.3.2.2 Với mỗi mẫu được liệu, chúng tôi cân khoảng 20g bột dược liệu Hàm lượng căn alcaloid toàn phần của 4 loài S/ephania Lour được trình bày ở bảng 3.3

Trang 32

Nhận xét: Từ bảng 3.3, nhận thấy hàm lượng căn alcaloid toàn phần có sự khác biệt

giữa các loài, loài Sephanmia sp.Ï (thu hái ở Hòa Bình) có hàm lượng alcaloid cao nhất

(3%), trong khi đó loài S hernandifolia có hàm lượng alcaloid thấp nhất (1,1%)

3.1.4 Tác dung ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)

3.1.4.1 Tác dụng ức chế AChE cúa dịch chiết MeOH toàn phần

Tiến hành thử tác dụng ức chế AChE của 4 loài Sfephania Lour thu được trên

dịch chiết MeOH toàn phần ở 3 nồng độ 500, 250 và 100 pg/ml Két qua cho thay

(Bảng 3.4):

sp.1, S dielsiana, S glabra

e 2/4 loai & néng d6 250ug/ml cé hoat d6 tc ché > 60%

e Loài Stephania sp.1 (mau Hda Binh) cé hoat d6 uc chế cao nhất trong 4 lồi ở

nơng độ 100ug/ml

e Riêng loài $ hernandifolia không có tác dụng do có hoạt độ ức chế AChE <50%

Trang 33

3.1.4.2 Tác dung ức chế AChE của dịch chiết alcaloid toàn phan

Vì nhóm alcaloid là nhóm chất chính của chi Stephania Lour va cả 4 loài Stephania nghiên cứu đều dương tính với nhóm alcaloid nên chúng tôi tiến hành thử

tác dụng ức chế AChE của 4 dịch chiết alcaloid toàn phần Kết quả cho thấy (Bảng 3.5): e©_ Alcaloid tồn phần của cả 4 loài Sephania nghiên cứu đều có hoạt độ ức chế

AChE >50% ở nồng độ 250ug/ml (bằng 1⁄2 nồng độ của dịch chiết MeOH toàn phân tương ứng)

=> Như vậy, dịch chiết MeOH toàn phần của loài Š hernandifolia không có tác

dụng ở 3 nông độ (500, 250, 100 ug/m]) nhưng alcaloid toàn phần của nó có tác dụng ức chế >50% ở nồng độ 250ug/mI

° CO nông độ 100ug/ml, alcaloid của Sfephamia sp.]Ï có hoạt độ ức chế mạnh nhất so voi 3 loài còn lại

Nhận xét:

Từ kết quả thử tác dụng ức chế AChE của dịch chiết MeOH và alcaloid toàn phần của 4 lồi Sepharia, chúng tơi nhận thấy loài Sfephania sp.1 (thu hái ở Hòa Bình)

có tác dụng ức chế cao nhất trên cả 2 dịch chiết Đặc biệt, cả dịch chiết MeOH và

alcaloid ở cùng nông độ, khả năng ức chế AChE là tương đương nhau Do vậy, chúng

Trang 34

3.1.5 Nghiên cứu thành phan héa hoc cia loai Stephania sp.1 (thu hai 6 Hda Binh) 3.1.5.1 Chiét xuat alcaloid toan phan

Quy trình chiết xuất:

Cân 300g bột được liệu (hàm ẩm 7,1%), thắm âm bằng dung dịch NH,OH 10%

trong 2 giờ, sau đó chiết dược liệu bằng cloroform trong bình soxhlet đến kiệt alcaloid

(16 giờ) Cất thu hồi dung môi đến còn 1/3 thể tích Chiết với dung dịch acid HCI 0,1N 5 lần, mỗi lần 30 ml Gộp các dịch chiết acid, kiềm hóa bằng NH„OH 10% đến pH = 9-

10, sau đó chiết băng cloroform 3 lần, mỗi lần 100ml Gộp pha dung môi hữu cơ, làm khan bằng Na;SO¿ khan Cất thu hồi dung môi đưới áp suất giảm thu được cắn alcaloid toàn phân Lượng căn thu được là 7,5g

3.1.5.2 Phan lap

3.1.5.2.1 Khảo sát hệ dung môi phân lập alcaloid

Chúng tôi sử dụng sắc ký lớp mỏng để khảo sát các hệ dung môi phân lập alcaloid Các hệ được khảo sát gồm các cặp dung môi sau:

Hé 1: n-Hexan : Cloroform [1:1] Hệ 2: n-Hexan : Ethylacetat [4:1] Hé 3: Cloroform : Methanol [9:1]

Kết quả khảo sát cho thấy, khi triển khai sắc ký lớp mỏng với 2 hệ dung môi là

n-Hexan : Cloroform [1:1] và n-Hexan : Ethylacetat [4:1], dịch chấm alcaloid toàn

phần có di chuyển lên phía trên tạo thành một dải có Rf <0,3 và không tách thành vết

alcaloid (quan sát ở UV 366nm, 254nm, TT Dragendorff) Đối với hệ Cloroform :

Methanol [9:1], trên sắc ký đồ vết alcaloid chia thành 2 phần: phần 1 có Rf từ 0,7 — 0,9

va phần 2 có Rf ~ 0 (các vết phân cực) Khi tăng độ phân cực của hệ dung môi từ 10%

MeOH lén 20% MeOH ( ty 1é Cloroform : Methanol [8:2] ) thi cac vết phân cực dịch

Trang 35

3.1.5.2.2 Phân lập alcaloid toàn phần bằng sắc ký cột chân không (VLC)

Tiến hành: 150g silicagel (d = 60 - 200um) được nạp vào phéu Buchner (1 =

15cm, d = 8cm) bằng phương pháp nhồi cột ướt với dung môi CHC]; được gắn với bình hút chân không Sau đó trộn 7,5g căn alcaloid với I ít silicagel và dung môi

CHC];, trộn đều, để khô rồi trải lên phía trên bề mặt silicagel Tiến hành rửa giải bằng

hệ dung môi Cloroform : Methanol với ty lệ như sau: CHCl; : MeOH 100: 1 300ml CHCl; : MeOH 90 : 10 300ml CHCl, : MeOH 80 : 20 300ml CHCl, : MeOH 70 : 30 300ml CHCl, : MeOH 60 : 40 300ml CHCl, : MeOH 50 : 50 500ml

Hứng dung môi rửa giải vào bình hút chân không nỗi với bơm hút Mỗi lần

100ml Kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc kí lớp mỏng, gdp các dịch có các vết giống nhau trên sắc ký đồ, cất thu hồi dung môi Kết thúc quá trình rửa giải thu được 5 phân

đoạn, ký hiệu: FR1I => ERS

3.1.5.2.3 Khảo sát tác dụng ức chế AChE của 5 phân đoạn FR1 => FR5

Thử tác dụng ức chế AChE của 5 phân đoạn FR1 => FRS5 dé dinh hướng phân lập các chất có hoạt tính ức chế AChE ở các phân đoạn có hoạt tính Bảng 3.6 trình bày

hoạt độ ức chế AChE của các phân đoạn FRI-ER5 ở nồng độ 100ug/mIl

Nhận xét: Trong 5 phần đoạn, 4 phân đoạn đầu FRI => FR4 đều có họat độ ức chế

Trang 36

3.1.5.2.4 Phân lập phân đoạn FR1 bằng sắc ký cột nhanh

Tiến hành: 100g silicagel (d = 60 - 200um) được nạp vào cột thủy tỉnh (1 =

50cm, d = 2cm) bằng phương pháp nhỏi cột ướt với dung môi CHCl Sau đó cân 300mg cắn FRI, hòa tan trong lượng tối thiểu cloroform, dùng pipet hút lẫy hết dịch

cho đều đặn lên mặt cột Cho một lớp cát mịn phủ lên mặt cột để ôn định cột Tiến

hành rửa giải bằng hệ dung môi Cloroform : Methanol [50:1]

Hứng dung môi chạy cột vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2ml Sau quá trình chạy cột, chấm sắc ký lớp mỏng và gộp các ống nghiệm ta thu được chất: FR1.2

Kiểm tra độ tinh khiết: FR1.2 được kiểm tra độ tinh khiết băng sắc kí lớp mỏng

ở 2 hệ dung môi khác nhau (hình 3.6)

Hé I: Cloroform : Aceton : NH,OH [9:1:0,1] Hé II: Cloroform : MeOH : NH,OH [9:1:0,1]

Nhận xét: Từ sắc ký đồ hình 3.6, sơ bộ kết luận chất FR1.2 tinh khiết

3.1.5.2.5 Phân lập phân đoạn FR3 bằng sắc ký cột nhanh

Tiến hành: 100g silicagel (d = 60 - 200um) được nạp vào cột thủy tỉnh (1 =

50cm, d = 2cm) bằng phương pháp nhỏi cột ướt với dung môi CHC]; Sau đó cân 200mg căn FR3, hòa tan trong lượng tối thiểu cloroform, dùng pipet hút lấy hết dịch

cho đều đặn lên mặt cột Cho một lớp cát mịn phủ lên mặt cột để ôn định cột Tiến

hành rửa giải bằng hệ dung môi Cloroform : Methanol [20:1]

Hứng dung môi chạy cột vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2ml Sau quá trình chạy cột, châm sắc ký lớp mỏng và gộp các ống nghiệm ta thu được chất: FR3.1

Kiểm tra độ tỉnh khiết: FR3.1 được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc kí lớp mỏng

ở 2 hệ dung môi khác nhau (hình 3.7)

Hé I: Cloroform : Aceton : NH,OH [8:2:0,1] Hé II: Cloroform : MeOH : NH,OH [9:1:0,1]

Trang 38

Sac Sac ky ky đồ đồ Hệ I II Hệ I ! II Hình 3.6 Sắc ký đồ chất FRI1.2 ở 2 hệ Hình 3.7 Sắc ký đồ chất FR3.1 ở 2 hệ dung môi khác nhau dung môi khác nhau 3.1.5.3 Xác định câu trúc 3.1.5.3.1 Nhận dang chat FR1.2

Trang 39

Hinh 3.8 Pho ‘H-NMR cia FR1.2

vùng trường thap (6.5 + 7.0 ppm)

Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton chất

FRI.2, dựa trên độ dịch chuyển hóa học các

tín hiệu proton có thể chia thành 3 vùng tín

hiệu

- Ở vùng trường thấp, từ 6.5 + 7.0 ppm có tín hiệu của 4 proton nhân thơm Trong đó, có 2 proton xuất hiện dạng pic đơn có độ dịch chuyển hóa học là 6.73 và 6.62 ppm; va 2 proton tương tác với nhau (dạng doublet) có

độ dịch chuyển hóa học 6.88 và 6.79 ppm với hăng số tương tác J = 8,5 Hz (hình 3.8)

- Ở vùng 3.8 + 4.0 ppm, có 4 tín hiệu singlet của 4 nhóm methoxy (-OCH;) bị đây về phía trường thấp do hiệu ứng điện tử của Oxy có integral tương ứng với 12 proton Như vậy, chất FR1.2 có 4 nhóm methoxy riêng biệt, không tương tác

- Từ 2.7 + 4.3 ppm, không tính đến 4 nhóm methoxy, có 9 tín hiệu tương ứng với 9 proton Trong đó, có 2 proton tương tác với nhau có hăng số tương tác lớn J = 15.5 Hz,

có độ dịch chuyển hóa học ồ 3.55 và 4.24 ppm (hình 3.9)

Trang 40

Các tín hiệu của cac proton cho thây đó là đặc điêm của khung cầu trúc protoberberin, có 2 nhân thơm bị thế

Bảng 3.7 trình bày số liệu phan tich phé "H-NMR cua chat FR1.2 so voi di liéu

phố của Ltetrahydropalmatin trong cùng mét dung méi CDCl, va tần số máy là 500

MHz [10], cho thay di liệu phố chất ER1.2 gần như trùng khớp hoàn toàn với dữ liệu

Định dạng
Số trang	59
Dung lượng	10,96 MB